嘧菌酯與硒代蛋氨酸復(fù)合暴露對斑馬魚胚胎及仔魚的發(fā)育毒性

潘莉璇, 郭志芯, 毛連綱, 張 蘭, 張燕寧,朱麗珍, 蔣紅云, 劉新剛

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，北京 100193)

嘧菌酯(azoxystrobin)是全球開發(fā)成功的第一個(gè)甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，主要抑制線粒體的呼吸作用，破壞病原菌的能量合成[1]。目前嘧菌酯在全球范圍內(nèi)已得到廣泛應(yīng)用，根據(jù)中國農(nóng)藥信息網(wǎng)(http://www.icama.org.cn/)，查詢嘧菌酯目前登記單劑(含原藥) 282 個(gè)、混劑366 個(gè)，相比2019年單劑和混劑的登記數(shù)量均保持持續(xù)增長(截止日期：2023 年9 月11 日)[2]。隨著嘧菌酯在全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的大量應(yīng)用，其在環(huán)境水體中的殘留問題也日益突出，實(shí)際檢出質(zhì)量濃度在1～30 μg/L 之間[3-5]，因此其對生態(tài)環(huán)境的負(fù)面影響正逐漸受到關(guān)注。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，嘧菌酯在農(nóng)田施用后，會隨著雨水沖刷和地表徑流等途徑進(jìn)入水生生態(tài)系統(tǒng)，從而對魚類等水生生物產(chǎn)生潛在威脅[6-7]。開展包括嘧菌酯對以斑馬魚為模式生物的水生生物的潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估研究是近年來的研究熱點(diǎn)。高濃度嘧菌酯(1500 mg/L)暴露會導(dǎo)致斑馬魚胚胎畸形，如脊柱彎曲、心包水腫、尾部畸形等，并破壞線粒體的功能，甚至影響其生殖發(fā)育[8-10]；即使在環(huán)境濃度(20 μg/L)水平下，嘧菌酯也會對斑馬魚產(chǎn)生危害，比如受精后42 和60 d 斑馬魚雄魚比例顯著降低、雌雄同體比例升高[11]等。

富硒農(nóng)產(chǎn)品富含人體和動物體所必需的微量元素硒(Se)，目前該類產(chǎn)品市場前景廣闊、發(fā)展?jié)摿Υ?，正受到越來越多的關(guān)注[12]。硒代蛋氨酸(selenomethionine)作為一種有機(jī)硒，相比亞硒酸鈉等無機(jī)硒更容易被生物體吸收利用，是替代無機(jī)硒的重要有機(jī)硒源[13-14]。目前在水稻等農(nóng)作物生產(chǎn)上，主要采用葉面噴施硒代蛋氨酸等硒肥產(chǎn)品的方式來提高稻米等種植農(nóng)產(chǎn)品中硒的含量[15]。然而，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的硒元素也是一把“雙刃劍”——人和動物需要適量補(bǔ)充硒元素，但長期噴施過量硒也會對生態(tài)環(huán)境及人體健康產(chǎn)生不良影響[16]。何佳等檢測發(fā)現(xiàn)，在我國8 大流域水體中，硒的實(shí)際檢出質(zhì)量濃度在0.10～7.39 μg/L之間[17]，其對生態(tài)環(huán)境的負(fù)面影響已逐漸受到關(guān)注。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，超出營養(yǎng)安全劑量的硒元素隨著生物富集，會對斑馬魚等水體生物產(chǎn)生致畸效應(yīng)，甚至影響其發(fā)育和學(xué)習(xí)認(rèn)知等行為[18-20]。

在我國水稻種植中，嘧菌酯一般在水稻分蘗末期用于預(yù)防水稻紋枯病[21]以及在水稻整個(gè)生育期內(nèi)用于預(yù)防稻瘟病[22]，而硒肥一般在水稻齊穗期和抽穗期進(jìn)行葉面噴施[23]。在稻田生態(tài)系統(tǒng)中，由于硒的有效利用率很低[24]，未被有效吸收利用的硒在農(nóng)田環(huán)境中不斷累積，會與嘧菌酯等農(nóng)藥形成復(fù)合暴露。關(guān)于嘧菌酯或硒對水生生物的單一毒性效應(yīng)已有很多研究報(bào)道[8-10,18-20]，然而關(guān)于兩者復(fù)合暴露毒性的研究很少。筆者等[16]前期評價(jià)了嘧菌酯與3 種常見外源性硒單劑(亞硒酸鈉、硒代蛋氨酸和納米硒)及其二元聯(lián)合的混劑對斑馬魚不同生命階段(成魚、仔魚和胚胎)的急性毒性，其中，斑馬魚不同生命階段對硒代蛋氨酸的敏感性(以96h-LC50值，單位mg/L 表示，其中mg 指硒的質(zhì)量)順序依次為仔魚(0.80 mg/L) > 胚胎(1.03 mg/L) > 成魚(9.36 mg/L)；并通過相加指數(shù)法(AI)、毒性單位法(TU) 和混合毒性指數(shù)法(MTI)對其聯(lián)合毒性效應(yīng)進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除MTI 法計(jì)算得到嘧菌酯與硒代蛋氨酸復(fù)合暴露對成魚的毒性效應(yīng)表現(xiàn)為部分相加作用外，其余均為拮抗作用。

水生生物體在受到環(huán)境污染物危害時(shí)，會在體內(nèi)產(chǎn)生及累積過量的活性氧(reactive oxygen species，ROS) 而誘導(dǎo)氧化損傷，而過氧化氫酶(catalase，CAT) 和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等可以清除體內(nèi)多余的ROS，從而緩解氧化損傷[25]。線粒體呼吸鏈蛋白復(fù)合體 Ⅲ(簡稱線粒體復(fù)合體Ⅲ，即細(xì)胞色素c 還原酶)是線粒體中產(chǎn)生活性氧的主要部位，也是嘧菌酯的主要作用位點(diǎn)，其功能被抑制后可產(chǎn)生大量超氧負(fù)離子，從而可能引起心衰線粒體呼吸鏈異常并加劇活性氧的產(chǎn)生[26]。為進(jìn)一步揭示嘧菌酯與硒復(fù)合暴露對斑馬魚的早期發(fā)育毒性，以及對氧化損傷的影響，本研究選取對斑馬魚胚胎急性毒性最高的硒代蛋氨酸，測定了嘧菌酯與硒復(fù)合暴露對斑馬魚胚胎的短期發(fā)育毒性以及相關(guān)酶(CAT、SOD)活性和線粒體復(fù)合體Ⅲ的影響，以期為甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑與外源硒的科學(xué)及安全應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，從而有效平衡我國富硒產(chǎn)業(yè)發(fā)展和水稻田病害的高效防控。

1 材料與方法

1.1 供試生物與飼養(yǎng)條件

斑馬魚Danio rerio親魚：于國家斑馬魚資源中心(武漢)購買野生型AB 品系斑馬魚，在本實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立養(yǎng)殖系統(tǒng)(購自北京愛生科技發(fā)展有限公司)進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖。飼養(yǎng)用水(簡稱重組水)保持水溫(26 ± 1) ℃，pH 7.0～7.5，電導(dǎo)率(500 ± 50) μS/cm。每天采用新鮮的豐年蝦飼喂斑馬魚親魚3 次。保持光照/黑暗=14 h/10 h 循環(huán)。

試驗(yàn)用斑馬魚胚胎：挑選發(fā)育健康的10 月齡斑馬魚親魚成魚，按雌/雄比例1 : 1 進(jìn)行配對，并轉(zhuǎn)移到有隔板的配魚盒中，于第2 天開始光照后，移除隔板使之交配，收集受精后2 h (即2 hpf)的胚胎用于發(fā)育毒性試驗(yàn)。

1.2 主要儀器與試劑

Agilent 6470 超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)以及Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(50 mm × 2.1 mm, 1.8 μm)(安捷倫科技有限公司)；AVIO200 型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司)；SG68 多參數(shù)測試儀(梅特勒-托利多儀器有限公司)；YD300 便攜式水質(zhì)硬度儀(上海三信儀表廠)；BX63 奧林巴斯生物顯微鏡(奧林巴斯株式會社)；Infinite F50 多功能酶標(biāo)測定儀(瑞士Tecan 公司)；酶活性檢測試劑盒以及線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；98%嘧菌酯(azoxystrobin)原藥(連云港市金囤農(nóng)化有限公司)；9 8% 硒代蛋氨酸(selenomethionine) (北京百靈威科技有限公司)。

1.3 供試藥劑濃度實(shí)測

1.3.1 混劑水樣中嘧菌酯濃度實(shí)測 參照前期試驗(yàn)混合水樣中嘧菌酯濃度實(shí)測分析方法[16]，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)對本研究中嘧菌酯的初始濃度(0 h) 及換藥液前濃度(24 h)進(jìn)行取樣實(shí)測。

1.3.2 混劑水樣中總硒濃度實(shí)測 參照前期試驗(yàn)混合水樣中總硒濃度實(shí)測分析方法[16]，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-OES)[27]對本研究中總硒的初始濃度(0 h)及換藥液前濃度(24 h)進(jìn)行取樣實(shí)測。

1.4 斑馬魚胚胎及仔魚發(fā)育毒性試驗(yàn)

1.4.1 復(fù)合暴露對斑馬魚胚胎及仔魚的發(fā)育毒性試驗(yàn) 用適量丙酮配制60 mg/L 的嘧菌酯母液，用重組水配制150 mg/L (mg 指硒元素的質(zhì)量，下同)的硒代蛋氨酸母液。參照前期測得嘧菌酯和硒代蛋氨酸單一成分對斑馬魚胚胎的急性毒性96 h-LC50結(jié)果0.52 和1.03 mg/L[28]，按等毒性配比(即兩種藥劑質(zhì)量濃度比為1 : 2)方法，將斑馬魚胚胎分別暴露于嘧菌酯和硒代蛋氨酸4 個(gè)不同梯度二元混配(0.1 + 0.2、0.25 + 0.5、0.5 + 1.0 和1.0 +2.0 mg/L)復(fù)合暴露組中，同時(shí)設(shè)置空白對照(重組水)。同時(shí)根據(jù)前期研究[17]，為確保在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)試驗(yàn)體系中嘧菌酯和硒代蛋氨酸的濃度和配比保持不變，試驗(yàn)藥液每24 h 更換一次。將24 孔板轉(zhuǎn)移到恒溫培養(yǎng)箱中于(26 ± 1) ℃下培養(yǎng)，通過顯微鏡觀察記錄不同復(fù)合暴露組不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)(24、48、72 和96 h) 胚胎的生長發(fā)育參數(shù)：自主運(yùn)動、孵化數(shù)、心跳次數(shù)(20 s)、死亡率和體長等。判斷胚胎孵化的標(biāo)準(zhǔn)是胎膜破裂，仔魚成型，判斷胚胎死亡的標(biāo)準(zhǔn)為顯微鏡下觀察無心跳。

1.4.2 復(fù)合暴露對仔魚酶活性及線粒體復(fù)合體Ⅲ活性的影響測定 同1.4.1 節(jié)，參照前期急性毒性96h-LC50結(jié)果，按等毒性配比法，將斑馬魚胚胎分別暴露于嘧菌酯和硒代蛋氨酸3 個(gè)不同梯度二元混配(0.0005 + 0.001、0.005 + 0.01 和0.05 +0.1 mg/L) 復(fù)合暴露組中，同時(shí)設(shè)置重組水空白對照。暴露結(jié)束后，將每個(gè)處理組的胚胎/孵化的仔魚采用冰生理鹽水沖洗多次并吸干水分，放入1.5 mL 離心管中，稱量后按1 : 9 加入生理鹽水進(jìn)行勻漿并低溫冷凍離心10 min (3500 r/min)，取上清液于 –80 ℃保存，待測。采用考馬斯亮藍(lán)法，分別按照CAT、SOD 以及線粒體復(fù)合體Ⅲ相關(guān)試劑盒操作說明，采用微孔酶標(biāo)儀測定吸光值，并利用試劑盒方法計(jì)算活力值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過單因素方差分析差異顯著性分析(P< 0.05，表示數(shù)據(jù)之間差異顯著；P< 0.01，表示數(shù)據(jù)之間差異極顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體系中嘧菌酯與硒代蛋氨酸的實(shí)測質(zhì)量濃度

測定結(jié)果(表1)表明，嘧菌酯與硒代蛋氨酸所有復(fù)合暴露處理組水樣中0 h 和24 h 的實(shí)測質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度比值均滿足80%～120%的要求，表明嘧菌酯與硒代蛋氨酸在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，即本研究中通過每24 h 更換一次試驗(yàn)藥液，可以確保整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)嘧菌酯和硒代蛋氨酸藥劑濃度和配比保持基本不變，從而設(shè)定理論質(zhì)量濃度可以代替實(shí)測值直接用于相關(guān)毒性數(shù)據(jù)分析。

表1 二元混劑對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)中藥劑質(zhì)量濃度測定Table 1 Determination of concentrations in developmental toxicity test of binary mixtures on zebrafish embryo

2.2 嘧菌酯與硒代蛋氨酸復(fù)合暴露對胚胎自主運(yùn)動的影響

結(jié)果如圖1 所示，在受精后24 h (即24 hpf，其余同) 時(shí)，對照組斑馬魚胚胎20 s 內(nèi)的自主運(yùn)動次數(shù)為1.8 次，而嘧菌酯與硒代蛋氨酸不同濃度復(fù)合暴露處理組均顯著抑制了斑馬魚胚胎的自主運(yùn)動(P< 0.05)，其中，嘧菌酯與硒代蛋氨酸最低濃度復(fù)合暴露組(0.1 + 0.2 mg/L)胚胎20 s 內(nèi)的自主運(yùn)動次數(shù)下降為1.1 次，其余3 個(gè)更高濃度組抑制作用更加明顯，胚胎20 s 內(nèi)的自主運(yùn)動次數(shù)均出現(xiàn)大幅降低，僅為0.8 次左右。

圖1 嘧菌酯與硒代蛋氨酸不同濃度復(fù)合暴露對斑馬魚胚胎自主運(yùn)動的影響Fig.1 Effects of combination exposure of azoxystrobin and selenomethionine on autonomic movement

2.3 嘧菌酯與硒代蛋氨酸復(fù)合暴露對胚胎孵化率及死亡率的影響

如圖2-A 所示，與空白對照組相比，嘧菌酯與硒代蛋氨酸不同濃度復(fù)合暴露處理均顯著抑制了胚胎的孵化。48 hpf 時(shí)，對照組斑馬魚胚胎孵化率達(dá)到23.3%，而高濃度復(fù)合暴露處理組(1.0 +2.0 mg/L)則完全未孵化；60 hpf 時(shí)，對照組胚胎孵化率達(dá)63.3%，而不同濃度復(fù)合暴露組胚胎孵化率均顯著低于對照組，且各處理組之間均存在顯著差異(P< 0.05)，其中，高濃度復(fù)合暴露處理組(1.0 + 2.0 mg/L)孵化率最低，僅8.33%；72 hpf和96 hpf 時(shí)，對照組胚胎孵化率達(dá)100%，嘧菌酯與硒代蛋氨酸最低濃度復(fù)合暴露組(0.1 + 0.2 mg/L)的胚胎孵化率達(dá)到93.3%，與空白對照組相比其抑制作用已逐漸消除，但其余3 個(gè)更高濃度復(fù)合暴露組的胚胎孵化率最高僅73.3%，仍表現(xiàn)出明顯的抑制作用(P< 0.05)。

圖2 嘧菌酯與硒代蛋氨酸不同濃度復(fù)合暴露對斑馬魚胚胎孵化率和死亡率的影響Fig.2 Effects of combination exposure of azoxystrobin and selenomethionine on hatching rate and mortality

從圖2-B 中可看出，與空白對照組相比，嘧菌酯與硒代蛋氨酸最低濃度復(fù)合暴露處理(0.1 +0.2 mg/L) 對胚胎的死亡率無顯著影響，但其余3 個(gè)更高濃度復(fù)合暴露組胚胎的死亡率均出現(xiàn)明顯升高(P< 0.05)，其中，96 hpf 時(shí)，嘧菌酯與硒代蛋氨酸最高濃度復(fù)合暴露組(1.0 + 2.0 mg/L)斑馬魚胚胎的死亡率高達(dá)90.0%，遠(yuǎn)高于其余各處理組(P< 0.01)。

2.4 嘧菌酯與硒代蛋氨酸復(fù)合暴露對仔魚心跳及體長的影響

如圖3-A 所示，在48 hpf 和72 hpf 時(shí)，對照組斑馬魚胚胎在20 s 內(nèi)的心跳次數(shù)分別達(dá)到44.5次和49.2 次，而嘧菌酯與硒代蛋氨酸除最高濃度復(fù)合暴露組(1.0 + 2.0 mg/L)顯著抑制了斑馬魚胚胎的心跳外，其余各濃度復(fù)合暴露組與空白對照組相比均無顯著差異；隨受精后時(shí)間延長，復(fù)合暴露組對斑馬魚胚胎心跳的抑制作用更加明顯，96 hpf 時(shí)，除最低濃度復(fù)合暴露組(0.1 + 0.2 mg/L)外，其余3 個(gè)更高濃度組均顯著抑制了胚胎的心跳，其中最高濃度復(fù)合暴露組(1.0 + 2.0 mg/L)抑制作用最為顯著，20 s 內(nèi)的胚胎心跳僅33.5 次。

圖3 嘧菌酯與硒代蛋氨酸不同濃度復(fù)合暴露對斑馬魚仔魚心率和體長的影響Fig.3 Effects of combination exposure of azoxystrobin and selenomethionine on heart rate and body length

從圖3-B 中可看出，72 hpf 時(shí)，對照組斑馬魚胚胎體長達(dá)3690.7 μm，而嘧菌酯與硒代蛋氨酸除最高濃度復(fù)合暴露組(1.0 + 2.0 mg/L) 顯著抑制了斑馬魚的生長(P< 0.05)外，其余各濃度復(fù)合暴露組斑馬魚體長與空白對照組相比均無顯著差異；隨受精后時(shí)間延長，復(fù)合暴露組對斑馬魚體長的抑制作用更加明顯，96 hpf 時(shí)，復(fù)合暴露各濃度組均顯著抑制了斑馬魚的生長，其中最高濃度(1.0 + 2.0 mg/L) 抑制作用最為顯著，體長僅3277.3 μm (P< 0.05)。

2.5 嘧菌酯與硒代蛋氨酸復(fù)合暴露對仔魚抗氧化酶和線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ活性的影響

如圖4-A 所示，與空白對照組相比，嘧菌酯與硒代蛋氨酸3 個(gè)濃度復(fù)合暴露組均顯著抑制了斑馬魚仔魚體內(nèi)CAT 活性(P< 0.05)，且藥劑濃度越高，抑制作用越明顯。其中，嘧菌酯與硒代蛋氨酸中濃度(0.005 + 0.01 mg/L)和低濃度(0.0005+ 0.001 mg/L)復(fù)合暴露組仔魚體內(nèi)CAT 活性差異不顯著，但最高濃度復(fù)合暴露組(0.05 + 0.1 mg/L)仔魚體內(nèi)CAT 活性均顯著低于中濃度和低濃度組。但與空白對照組相比，嘧菌酯與硒代蛋氨酸3 個(gè)濃度復(fù)合暴露組對仔魚體內(nèi)SOD 活性則均無顯著影響(P> 0.05) (圖4-B)。

圖4 嘧菌酯與硒代蛋氨酸不同濃度復(fù)合暴露對斑馬魚仔魚過氧化氫酶 (CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ活性的影響Fig.4 Effects of combination exposure of azoxystrobin and selenomethionine on catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and mitochondrial complex III activity

從圖4-C 中可看出，與空白對照組相比，嘧菌酯與硒代蛋氨酸最高濃度復(fù)合暴露組(0.05 +0.1 mg/L)顯著抑制了仔魚體內(nèi)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ的活性(P< 0.05)，但中濃度(0.005 + 0.01 mg/L)和低濃度復(fù)合暴露組(0.0005 + 0.001 mg/L)仔魚體內(nèi)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ活性差異不顯著(P> 0.05)。

3 結(jié)論與討論

與空白對照組相比，嘧菌酯與硒代蛋氨酸不同濃度復(fù)合暴露處理組均顯著抑制了斑馬魚胚胎的自主運(yùn)動次數(shù)和胚胎孵化率(P< 0.05)。其中，最低濃度復(fù)合暴露處理組(0.1 + 0.2 mg/L)對胚胎孵化率的抑制作用在72 hpf 后可恢復(fù)正常，且對胚胎死亡率、心跳等均無顯著影響，但其余3 個(gè)更高濃度復(fù)合暴露組胚胎的死亡率均出現(xiàn)明顯升高(P< 0.05)。說明嘧菌酯與硒代蛋氨酸復(fù)合暴露對斑馬魚胚胎及仔魚自主運(yùn)動、孵化率、死亡率、心跳等的影響存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。此外，72 hpf 時(shí)，除最高濃度復(fù)合暴露組(1.0 + 2.0 mg/L)顯著抑制了斑馬魚的生長外，其余各濃度復(fù)合暴露組斑馬魚體長與空白對照組相比均無顯著差異；但96 hpf 時(shí)，所有濃度復(fù)合暴露組均顯著抑制了斑馬魚的生長(P< 0.05)，其中最高濃度組(1.0 +2.0 mg/L)抑制作用最為顯著。說明相比斑馬魚胚胎及仔魚的孵化率、死亡率及心跳等指標(biāo)，胚胎的自主運(yùn)動次數(shù)和體長指標(biāo)更為敏感，更容易受到嘧菌酯與硒代蛋氨酸復(fù)合暴露的影響。

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，嘧菌酯在實(shí)際自然水體環(huán)境中的檢出質(zhì)量濃度范圍為1～30 μg/L[3-5]，硒在我國流域水體中的檢出質(zhì)量濃度范圍為0.10～7.39 μg/L[17]，而基于本研究結(jié)果，斑馬魚胚胎及仔魚的96 hpf 孵化率、死亡率及心跳等指標(biāo)尚不會受到自然水體環(huán)境中嘧菌酯與硒代蛋氨酸復(fù)合暴露的影響。

此外，本研究表明，嘧菌酯與硒代蛋氨酸3 個(gè)濃度復(fù)合暴露組均顯著抑制了仔魚體內(nèi)CAT活性(P< 0.05)，且藥劑濃度越高，CAT 活性受抑制作用越明顯；但所有濃度復(fù)合暴露組仔魚體內(nèi)超SOD 活性卻均無顯著變化(P> 0.05)。說明CAT對兩種藥劑的復(fù)合暴露更為敏感，即使是最低濃度暴露組 (0.0005 + 0.001 mg/L)，即在自然水體環(huán)境中嘧菌酯及硒的實(shí)際檢出濃度水平下，也會受到二者復(fù)合暴露的顯著影響。而本團(tuán)隊(duì)之前的研究發(fā)現(xiàn)，在嘧菌酯低質(zhì)量濃度(0.00025 和0.0025 mg/L)暴露下，斑馬魚仔魚體內(nèi)CAT 活性并不會出現(xiàn)顯著變化[9]，說明低濃度的硒代蛋氨酸(0.001 mg/L)，即在自然水體環(huán)境中硒的實(shí)際檢出濃度水平下，復(fù)合暴露后可能會加重嘧菌酯對斑馬魚仔魚的氧化脅迫。與對照組相比，嘧菌酯與硒代蛋氨酸最高濃度復(fù)合暴露組(0.05 + 0.1 mg/L)顯著抑制了仔魚體內(nèi)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ的活性(P< 0.05)，但中濃度(0.005 + 0.01 mg/L)和低濃度(0.0005 +0.001 mg/L)復(fù)合暴露組，即在自然水體環(huán)境中嘧菌酯及硒的實(shí)際檢出濃度水平下，仔魚線粒體復(fù)合體Ⅲ的活性差異并不顯著。心肌細(xì)胞和神經(jīng)元是兩個(gè)高能量需求位點(diǎn)，易受線粒體損傷的影響，線粒體功能障礙與胚胎的心臟毒性和神經(jīng)毒性有關(guān)，而本研究發(fā)現(xiàn)，嘧菌酯與硒代蛋氨酸低濃度復(fù)合暴露處理(0.1 + 0.2 mg/L) 對斑馬魚胚胎心跳并未表現(xiàn)出顯著影響，說明線粒體復(fù)合體Ⅲ活性是更為敏感的指標(biāo)，可以考慮將其作為潛在的敏感生物標(biāo)志物，用于嘧菌酯與硒代蛋氨酸的復(fù)合暴露監(jiān)測。

綜上所述，本研究中嘧菌酯與硒代蛋氨酸不同濃度復(fù)合暴露后會對斑馬魚胚胎及仔魚發(fā)育產(chǎn)生毒性效應(yīng)，但在目前自然水體環(huán)境中嘧菌酯及硒的實(shí)際檢出濃度水平下，除了會抑制仔魚體內(nèi)CAT 活性外，尚不會影響胚胎的自主運(yùn)動次數(shù)、孵化率、死亡率、心率以及仔魚體長等指標(biāo)，也不會影響仔魚體內(nèi)SOD 活性和線粒體復(fù)合體Ⅲ的活性。所得研究結(jié)果可以為水體環(huán)境中嘧菌酯和硒代蛋氨酸濃度監(jiān)測及復(fù)合暴露的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估提供數(shù)據(jù)支撐，從而有助于平衡我國富硒產(chǎn)業(yè)發(fā)展和水稻田病害的高效防控。