鮮核桃致病菌分離鑒定及二氧化氯對(duì)其抑制效應(yīng)研究

孟文彥，萬(wàn)楊卓群，張東莉，劉方玥，馬惠玲

（西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100）

核桃又名萬(wàn)歲果，羌桃，是胡桃科胡桃屬的植物（Juglansspp.）。核桃脂肪組分中約90%為不飽和脂肪酸，對(duì)增強(qiáng)大腦的思維能力和記憶力、降低心腦血管疾病發(fā)病率具有重要作用[1]，并且核桃中富含蛋白質(zhì)、視黃素、生育酚、維生素B6 等豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，十分有利于人體健康[2]。‘清香’核桃個(gè)體大、果殼薄、取仁容易、耐貯藏，是我國(guó)中晚熟核桃品種中的佼佼者，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)[3]。隨著核桃產(chǎn)品的多元化，每年8～10 月以青皮核桃、脫皮鮮核桃等形式銷售的產(chǎn)品在西北和西南地區(qū)市場(chǎng)中隨處可見(jiàn)[4]。然而，鮮核桃貯存期易發(fā)生霉變，貨架壽命短，25 ℃以上只有2～3 d[5-6]，難以適應(yīng)較長(zhǎng)貨架期或遠(yuǎn)距離的銷售，降低其市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。因此，研發(fā)高效的鮮核桃流通或貨架期保鮮技術(shù)具有十分重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義。

二氧化氯（Chlorine dioxide，ClO2）因其強(qiáng)的殺菌能力且不影響食品風(fēng)味等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于果蔬保鮮、畜禽制品、水產(chǎn)品、乳制品、啤酒和飲料等食品行業(yè)殺菌保鮮方面[7]，被世界衛(wèi)生組織（WHO）定為A1 級(jí)高效安全消毒劑[8]。ClO2可阻斷蛋氨酸向乙烯的轉(zhuǎn)化，且能氧化分解已合成的乙烯，延緩果蔬衰老和腐敗，起到良好的保鮮作用；低濃度的ClO2殺菌機(jī)理與抑制病毒、細(xì)菌、霉菌中蛋白質(zhì)的合成有關(guān)，高濃度ClO2則通過(guò)軟化和破壞病原菌細(xì)胞壁或病毒包膜而殺菌[9]。目前，ClO2在核桃貯藏保鮮中的作用逐漸得到關(guān)注，ClO2處理后的青皮核桃在貯藏期腐爛率和褐變指數(shù)均顯著下降，延緩了核桃果實(shí)的褐變[10]。低濃度ClO2浸果后結(jié)合真空包裝抑制了鮮核桃仁腐爛，降低呼吸強(qiáng)度，有效保持貯藏期核桃仁的品質(zhì)[11]。ClO2熏蒸結(jié)合氣調(diào)包裝也延長(zhǎng)了脫皮鮮核桃的低溫保鮮期[4]。然而，前人研究也發(fā)現(xiàn)高濃度（80 mg/L）的ClO2處理在抑制和殺滅核桃仁表面的微生物的同時(shí)，可能激發(fā)鮮核桃自身的生理性劣變[12]，因此果實(shí)對(duì)不同濃度的ClO2承受能力差異較大，這也是困擾保鮮行業(yè)的一個(gè)難題[13]。并且ClO2對(duì)鮮核桃室溫下（25 ℃左右）保鮮效果鮮有報(bào)道，對(duì)鮮核桃病原菌的鑒定及ClO2對(duì)其單獨(dú)的抑制效應(yīng)也少有研究。

核桃青皮提取液（GE）是近年來(lái)興起的一種抑菌劑，前人對(duì)GE 的研究進(jìn)行了大量報(bào)道[14]，包括對(duì)其活性物質(zhì)及含量的測(cè)定[15]，在果蔬保鮮方面的應(yīng)用。但少有應(yīng)用于鮮核桃保鮮的文獻(xiàn)，本研究依據(jù)科赫法則[16]分離了鮮核桃表面致病菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)各菌株進(jìn)行分類與鑒定。采用離體和活體抑菌試驗(yàn)篩選和驗(yàn)證了ClO2對(duì)各菌的抑制效應(yīng)，并比較它與GE 疊加處理的效應(yīng)。研究旨在揭示ClO2在鮮核桃霉變控制中的作用特點(diǎn)和適宜劑量，為開(kāi)發(fā)新型無(wú)公害鮮核桃防腐保鮮劑提供理論與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘清香’核桃（Juglans regiacv.Qingxiang）2021年8 月28 日（約雌花盛開(kāi)后125～130 d）采摘于陜西省周至縣專一‘清香’核桃園；二氧化氯（ClO2）緩釋劑有效成分含量5%，粉劑（500 g/包裝），訂制于山東臨朐華威生物科技有限公司；P3 保鮮袋 改良透氣性的PE 袋（單層厚20 μm，25 cm×20 cm），西安海宏包裝有限公司；三氯乙酸、硫代巴比妥酸、碳酸鈉、蒽酮、葡萄糖和次氯酸鈉 均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇 分析純，科隆化學(xué)品有限公司；Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）奧博星生物技術(shù)有限公司；Triton X-100 分析純，登峰化學(xué)試劑廠；硫酸 分析純，西隴科學(xué)有限公司；酵母基因組DNA 提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；凝膠回收試劑盒 奧科生物科技有限公司。

DH4000 電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；SW-CJ-2F 超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；QYC-2102C 恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SX-700 高壓滅菌鍋 TOMY KOGYO CO.,LTD；SW350T 光學(xué)顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；CR-400 色差儀 柯尼卡美能達(dá)（中國(guó)）投資有限公司[Konica Minolta（China）Investment Ltd]；ABI3730-XL 測(cè)序儀 北京北嘉美儀生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ‘清香’核桃處理 青皮核桃表皮無(wú)明顯的病蟲(chóng)斑和機(jī)械損傷，部分有輕度裂紋，但未開(kāi)裂。采回的青皮核桃在室溫下放置12 h 以散去田間熱，置于5±0.5 ℃冷庫(kù)保存?zhèn)溆?。每批試?yàn)用果時(shí)，對(duì)青皮核桃手工剝?nèi)デ嗥?、自?lái)水洗刷至表面潔凈，并用去離子水沖洗3 次，室溫吹晾1～2 h 至表面濕氣揮發(fā)，得到新鮮脫青皮的（濕）鮮堅(jiān)果，即鮮核桃，用作本研究材料。

1.2.2 青皮提取液（GE）的獲取 采用索氏提取器法提取。將10 g 鮮青皮切成邊長(zhǎng)為0.2～0.3 cm 小塊，包入濾紙，投入索氏提取器，加100 mL 75%乙醇，85 ℃提取4 h 后，用三層紗布過(guò)濾得到濾液，之后使用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀蒸干圓底燒瓶乙醇（至1 mL 以下漿狀物），用去離子水洗入100 mL 容量瓶中，定容得到100 mg/mL 的GE，當(dāng)天制備當(dāng)天用。

1.2.3 致病菌分離鑒定

1.2.3.1 真菌的分離 將鮮核桃堆積于30 ℃下，彩條無(wú)紡布覆蓋，保濕至相對(duì)濕度（RH）≥90%。存放10 d 以上，待核桃發(fā)生嚴(yán)重霉變，挑選其中帶有典型不同顏色霉菌病癥的核桃，用接種針?lè)謩e挑取各種霉菌菌塊，劃線法涂抹在PDA 培養(yǎng)基（?=90 mm）進(jìn)行初步分離。28 ℃培養(yǎng)3 d 后，挑取同一培養(yǎng)皿內(nèi)不同形狀與色澤的菌落分別接入新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)3～4 次，直到每個(gè)培養(yǎng)皿只長(zhǎng)出單一菌落，并連續(xù)兩次不再分離后作為純化菌株保存，留待測(cè)定。

1.2.3.2 細(xì)菌的分離 將鮮核桃堆積于25 ℃下，同1.2.3.1 中的操作進(jìn)行保濕覆蓋。待核桃表面呈現(xiàn)典型細(xì)菌滋生癥狀，即表面黏濕，局部顏色發(fā)黃時(shí)（約6～7 d），并呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)霉變癥狀時(shí)選取果殼上帶霉菌的堅(jiān)果3 個(gè)，分別放入100 mL 無(wú)菌水中浸泡，搖動(dòng)5 min，使核桃表面的微生物脫離，制備菌懸液。吸取100 μL 菌懸液均勻涂抹到細(xì)菌培養(yǎng)基（LB）上，37 ℃培養(yǎng)2 d 后，按照上述真菌操作方法分離純化培養(yǎng)直至得到單一菌株。

1.2.3.3 霉菌的回接 挑選12 個(gè)表面清潔、完整健康、大小整齊的新鮮核桃，并用蒸餾水沖洗3 次，備用。從上述純化的兩種霉菌菌落各挑取一個(gè)接種環(huán)左右面積的菌塊涂抹至鮮核桃表面，每個(gè)核桃沿縱向左側(cè)中部接種，之后將未接種一側(cè)朝下，用滅菌衛(wèi)生棉墊置廣口組培瓶?jī)?nèi)，以使堅(jiān)果位置固定，防止霉菌孢子的任意沾涂。每瓶擺放一個(gè)核桃，每種菌接種4 個(gè)核桃，4 個(gè)不接種作對(duì)照，蓋蓋，置于28 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天觀察，7 d 時(shí)堅(jiān)果感菌癥狀明顯，取出觀察、拍照。

1.2.3.4 細(xì)菌的回接 用上述霉菌相同的方法獲取12 個(gè)清潔完好的鮮核桃，每4 個(gè)堅(jiān)果接種同一細(xì)菌菌株，4 個(gè)不接種作對(duì)照。同上置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37 ℃培養(yǎng)3 d，每個(gè)核桃投入盛有100 mL 無(wú)菌水的燒杯中浸泡并輕微搖晃5 min，使核桃表面細(xì)菌脫離，制備菌懸液。按照GB4789.2-2022 方法測(cè)定每個(gè)核桃表面微生物數(shù)量[17]。

1.2.4 病原菌的分子鑒定 以上分離純化得到的4 種致病菌，每種挑選生長(zhǎng)旺盛的平板3 個(gè)，送楊凌天潤(rùn)奧柯生物科技有限公司進(jìn)行菌種鑒定。霉菌鑒定方法為：采用酵母基因組DNA 提取試劑盒提取真菌基因組DNA，再以內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1/ITS4 引物（表1）擴(kuò)增（PCR）18S rRNA 基因。PCR 體系組成：DNA 模板（50 ng/μL）1.0 μL，高保真DNA 聚合酶（2*Taq Master Mix）25.0 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，超純水22.0 μL。反應(yīng)流程為：98 ℃預(yù)變性30 s→98 ℃變性10 s→55 ℃退火30 s→72 ℃延伸1 min，循環(huán)30 次→72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物使用奧科生物凝膠回收試劑盒回收；細(xì)菌則采用酚-氯仿法[18]提取基因組DNA，再以27F 和1492R通用引物擴(kuò)增16S rRNA 基因。其PCR 體系組成為：基因組DNA（20 ng/μL）1.0 μL，高保真DNA 聚合酶（2X M5 HiPer plus Taq HiFi）15.0 μL，27F（10 μmol/L）、1492R（10 μmol/L）各1 μL，超純水12.0 μL。同真菌操作流程獲得和回收PCR 產(chǎn)物。

表1 引物名稱及序列表Table 1 Primer name and sequence table

各菌株P(guān)CR 產(chǎn)物分別經(jīng)ABI3730-XL 測(cè)序儀采取Sanger 技術(shù)測(cè)序，進(jìn)行NCBI Blast（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）比對(duì)，相似率最高的種或?qū)偌礊榇郎y(cè)菌的鑒定結(jié)果。

1.2.5.1 ClO2緩釋熏蒸劑對(duì)4 種致病菌作用的量效關(guān)系及半抑制濃度（IC50）測(cè)定 分別準(zhǔn)備好霉菌的PDA 固體培養(yǎng)基和細(xì)菌的LB 固體培養(yǎng)基，根據(jù)培養(yǎng)基的體積，按照2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40 mg/L 的ClO2固體緩釋熏蒸劑梯度劑量，將ClO2置入培養(yǎng)皿中央去除培養(yǎng)基的直徑10 mm孔槽中，在孔槽之外均勻加入100 μL 菌懸液，涂布均勻后，霉菌在28 ℃下培養(yǎng)3 d，細(xì)菌在37 ℃下培養(yǎng)2 d，每種菌每個(gè)劑量ClO2重復(fù)進(jìn)行3 次。以無(wú)藥劑處理為對(duì)照，觀測(cè)各皿中抑菌圈大小，換算為抑菌率（%）[19]。使用Igor Pro 軟設(shè)置件分析數(shù)據(jù)，選取量效關(guān)系曲線模式，在指定抑菌率為0%～100%之間進(jìn)行曲線擬合，并計(jì)算ClO2對(duì)4 種致病菌的半抑制濃度（IC50）的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差[20]。

1.2.5.2 孢子萌發(fā)率和菌絲平均生長(zhǎng)速率測(cè)定 用移液槍從28 ℃自然生長(zhǎng)的霉菌PDA 平板上刮取適量孢子于無(wú)菌水中，多次吸打?qū)㈡咦哟蛏ⅲ浞謸u勻，配制孢子懸浮液（107CFU/mL）。試驗(yàn)組于2 mL 離心管中加入含兩種霉菌IC50濃度ClO2的900 μL PDA 液體培養(yǎng)基，然后加入100 μL 孢子懸浮液，于28 ℃，200 r/min 的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于1、2、3、4、5 和6 d 時(shí)吸取培養(yǎng)液，顯微鏡下測(cè)定孢子萌發(fā)率[21]。每個(gè)處理至少觀察100 個(gè)孢子，重復(fù)3 次。

1.2.5 離體抑菌實(shí)驗(yàn)

接種直徑10 mm 的菌絲塊于培養(yǎng)基中央，置于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)9 d。十字交叉法測(cè)定菌絲生長(zhǎng)量，并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速率[22]。

1.2.6 鮮核桃貨架期保鮮試驗(yàn)

1.2.6.1 鮮核桃處理與包裝 根據(jù)上述試驗(yàn)選取的ClO2劑量，按照每袋鮮核桃包裝量（20 個(gè)，約0.37 kg），準(zhǔn)備ClO2熏蒸藥袋（0.48 g ClO2粉劑封入7 cm×5 cm無(wú)紡布袋）。以預(yù)試驗(yàn)中選取P3 保鮮袋（材料部分所述）為保濕包裝，進(jìn)行ClO2處理下鮮核桃貨架期的霉變控制試驗(yàn)。設(shè)3 個(gè)處理：核桃青皮提取液（GE）處理（陽(yáng)性對(duì)照），100 mg/mL GE 噴灑至核桃各個(gè)面濕潤(rùn)，晾干后密封；40 mg/kg ClO2熏蒸，20 個(gè)鮮核桃與ClO2藥袋一起裝入P3 袋，密封；復(fù)合處理，GE 噴灑并ClO2熏蒸。對(duì)照：潔凈鮮核桃直接裝入P3 袋密封。各處理均準(zhǔn)備36 小袋，12 袋隨機(jī)擺放于25 ℃貨架，24 袋置于5 ℃貨架。

1.2.6.2 抑霉效應(yīng) 保存于25 ℃貨架的核桃于0、6、12 d，5 ℃貨架的于0、6、12、24、48 d 從各組隨機(jī)抽取3 袋樣品，觀測(cè)鮮核桃表面霉變情況。每袋隨機(jī)抽取3 個(gè)堅(jiān)果，分別投入盛有100 mL 無(wú)菌水的燒杯，浸泡輕微搖晃5 min，使核桃表面微生物脫離，以制備菌懸液，按照GB4789.2-2022 測(cè)定微生物數(shù)量[17]。

1.2.6.3 品質(zhì)評(píng)價(jià) 對(duì)25 和5 ℃貨架各次所取的樣品同步觀測(cè)鮮核桃感觀品質(zhì)（仁色、香、脆、味、種衣剝離度），貨架前和取樣點(diǎn)分別對(duì)鮮核桃測(cè)定以下感觀指標(biāo)，每重復(fù)取4 個(gè)核桃，每處理共12 個(gè)。色澤：采用色差儀測(cè)定兩瓣核桃仁間隔平整處的色澤亮度（L*）；種皮剝離度：由評(píng)分小組10 人（均為大三學(xué)生，5 男5 女）手工剝?nèi)『颂胰实姆N衣，根據(jù)剝?nèi)〉碾y易程度進(jìn)行10～1 分間打分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下（表2）；消費(fèi)者可接受度：參考Wang 等[6]的標(biāo)準(zhǔn)由同上10 人根據(jù)種皮感觀色澤、核桃仁脆度和風(fēng)味進(jìn)行觀測(cè)和品嘗后在10～1 分之間綜合打分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下（表3）。

表2 種皮剝離度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Seed coat stripping degree scoring criteria

表3 消費(fèi)者可接受度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Consumer acceptability rating criteria

1.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)離體和活體抑菌試驗(yàn)的數(shù)據(jù)、核桃保鮮結(jié)果觀測(cè)值等采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS22.0 進(jìn)行正態(tài)分布與方差齊性檢驗(yàn)，之后作單因素方差分析（ANOVA）和最小顯著性差異法（LSD）進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮核桃致病菌分離與鑒定

2.1.1 致病真菌分離與感觀驗(yàn)證 根據(jù)科赫法則，病原菌的類型及其致病性須培養(yǎng)分離和回接驗(yàn)證方可初步確定[16]。經(jīng)對(duì)霉變核桃的真菌分離培養(yǎng)，得到黑色和綠色兩種菌株，其純化菌落特征如圖1，初生菌絲均呈白色，老化至產(chǎn)生孢子期分別變?yōu)楹诤稚途G色。兩種霉菌接種核桃均在接種部位產(chǎn)生了明顯的黑霉或青霉癥狀；而右側(cè)未接種部位果殼狀態(tài)良好，雖然部分堅(jiān)果的霉變已由左側(cè)擴(kuò)散至右側(cè)，左右生霉量差異仍然明顯，且霉變形態(tài)與貨架期自然發(fā)生的一致，證明了兩種霉菌對(duì)鮮核桃具有致病性。

圖1 鮮核桃分離的兩種霉菌及其回接后的致霉效果Fig.1 Two sort of mold isolated from fresh walnut and their mildewing effect after reinfection

2.1.2 致病細(xì)菌分離與感觀驗(yàn)證 對(duì)呈現(xiàn)細(xì)菌污染狀的核桃進(jìn)行細(xì)菌分離純化同樣得到兩種菌株，其純化菌落分別呈現(xiàn)白色和黃色（圖2A、2B）。白菌表面光滑、濕潤(rùn)，黃菌略帶粉質(zhì)、并呈由邊緣向中心逐漸加深的桔黃色。

圖2 鮮核桃分離的白色（A）和黃色（B）細(xì)菌Fig.2 Separated white (A) and yellow (B) bacteria from fresh walnut

兩種細(xì)菌分別回接核桃后測(cè)定發(fā)現(xiàn)，接種白菌引起核桃表面滋生白菌數(shù)量較對(duì)照增加了1 倍以上，差異極顯著（P<0.01），黃菌數(shù)量差異不顯著；接種黃菌引起核桃表面滋生黃菌數(shù)量較對(duì)照增加2.3 倍以上，差異亦達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。白菌數(shù)與對(duì)照差異不顯著（表4）。可見(jiàn)，對(duì)照和接種組核桃的細(xì)菌污染均以黃菌和白菌為主，且接種細(xì)菌的核桃表面黏濕，顏色發(fā)黃，接種黃菌時(shí)細(xì)菌數(shù)量陡增，驗(yàn)證了黃菌是核桃發(fā)粘的主要致病細(xì)菌，白菌為次要致病細(xì)菌。

表4 細(xì)菌回接后鮮核桃表面微生物數(shù)量測(cè)定（×10 6 CFU/核桃）Table 4 Microbial quantity on the surface of fresh walnut after reinfection with bacteria (×10 6 CFU/walnut)

2.1.3 病原菌鑒定 將所觀察到的病原菌形態(tài)與《真菌鑒定手冊(cè)》[23]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[24]等資料進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)黑霉與曲霉（Aspergillus）屬，綠霉與青霉屬（Penicillium）真菌外觀形態(tài)大體相符。

進(jìn)一步對(duì)4 種致病菌進(jìn)行分子鑒定，如表5 所示，對(duì)兩種霉菌的18S rRNA，內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS-1）、5.8S rRNA 和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS-2）基因完整序列，28S rRNA 部分序列比對(duì)，得出青霉菌株屬于青霉屬（Penicilliumsp），可信度為100%；黑霉菌株屬于塔賓曲霉（Aspergillus tabinus），可信度也為100%。對(duì)白菌16SrRNA 部分序列（1020 bp）比對(duì)確定其為按樹(shù)假單胞菌（Pseudomonas eucalypticola），可信度為99.85%，對(duì)黃菌16SrRNA 的部分序列（1395 bp）比對(duì)確定其為黃色微球菌（Micrococcus flavus），可信度為99.85%。即對(duì)‘青霉’只鑒定到青霉屬，表觀形態(tài)大致相符，黑霉鑒定到了種，兩種細(xì)菌則全部鑒定到種。

前人研究提出生鮮水果病變主要是由霉菌引起的[11]。在鮮核桃保鮮領(lǐng)域，已鑒定出了部分品種的個(gè)別鮮核桃致病霉菌，其中青霉（Penicillium）是在不同核桃品種具有普遍致病效應(yīng)的一種霉菌[25]，這與本文中所得結(jié)論一致。除此之外，本研究從病變的‘清香’核桃上還分離出另一種致病霉菌—塔賓曲霉（Aspergillus tabinus）、及兩種細(xì)菌（黃色微球菌和桉樹(shù)假單胞菌），更加詳細(xì)確定引起鮮核桃霉變和發(fā)粘的病原菌種類，為今后鮮核桃新型保鮮劑的開(kāi)發(fā)提供了新的依據(jù)。

2.2 二氧化氯最適抑菌濃度的確定

2.2.1 二氧化氯緩釋熏蒸劑對(duì)4 種病原菌作用的量效關(guān)系 當(dāng)ClO2緩釋熏蒸劑量由0 增加至40 mg/L時(shí)，4 種病原菌的抑制率均不斷增加，表現(xiàn)出ClO2對(duì)4 種致病菌具有廣譜的抑制效應(yīng)，并且呈現(xiàn)顯著的量效關(guān)系（圖3）。在ClO2濃度為16 mg/L 時(shí)，對(duì)青霉的抑制率已達(dá)到100%，顯著高于其它三種菌（P<0.05），但對(duì)黃色微球菌的抑制作用不強(qiáng)，僅不到40%。從ClO2濃度0～40 mg/L 全程來(lái)看，ClO2對(duì)青霉的抑制效應(yīng)最強(qiáng)，對(duì)黃色微球菌的抑制效應(yīng)最低，對(duì)塔賓曲霉和桉樹(shù)假單胞菌的抑制效應(yīng)較為相近，30 mg/L 的ClO2對(duì)塔賓曲霉的抑制率達(dá)到100%，40 mg/L 的ClO2對(duì)兩種細(xì)菌的抑制率也達(dá)到100%，40 mg/L 的ClO2是作為共同抑制4 種病原菌的最低理論濃度。

圖3 不同濃度二氧化氯緩釋熏蒸劑對(duì)4 種病原菌的抑制作用Fig.3 Inhibition rates of different concentrations of chlorine dioxide fumigants on four pathogens

以20、40 mg/L ClO2緩釋熏蒸劑作用為例，圖示其對(duì)兩種真菌的抑制效果（圖4）可見(jiàn)，這兩種劑量ClO2對(duì)青霉，40 mg/ LClO2對(duì)塔賓曲霉的抑制率均達(dá)到100%（圖4B、C、F 所示），結(jié)果表明，ClO2對(duì)不同菌株的抑制能力有所差異，對(duì)青霉的抑制作用強(qiáng)于塔賓曲霉。

圖4 ClO2 對(duì)青霉（上排）和塔賓曲霉（下排）抑制效果Fig.4 Inhibitory effect of ClO2 on Penicillium sp (top row) and Aspergillus tubingensis (lower raw)

前人報(bào)道適量的ClO2可降低低溫自發(fā)氣調(diào)貯藏鮮核桃的腐爛指數(shù)[4]，本文進(jìn)一步得出，這種防腐效應(yīng)實(shí)際上是ClO2對(duì)青霉、曲霉和細(xì)菌共同抑制取得的。

2.2.2 二氧化氯緩釋熏蒸劑對(duì)4 種病原菌作用的半抑制濃度（IC50）使用Igor Pro 軟件分析數(shù)據(jù)，制作抑菌率與劑量對(duì)數(shù)的模擬曲線圖，如圖5 所示，在抑菌率0～100%之間，ClO2對(duì)4 種病菌的抑制率—?jiǎng)┝繉?duì)數(shù)曲線均為典型的S 型。從曲線求得ClO2對(duì)4 種病菌的IC50分別為：青霉（A）7.357±0.451 mg/L、塔賓曲霉（B）12.943±0.693 mg/L、黃色微球菌（C）19.606±1.131 mg/L、桉樹(shù)假單胞菌（D）13.022±1.131 mg/L。其中，青霉的IC50最低，黃色微球菌的最高，塔賓曲霉和桉樹(shù)假單胞菌的IC50相近，說(shuō)明ClO2緩釋熏蒸劑對(duì)青霉的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)黃色微球菌的抑制作用最弱，對(duì)塔賓曲霉和桉樹(shù)假單胞菌的抑制效應(yīng)較為相近，這非常適合ClO2緩釋熏蒸劑應(yīng)用于鮮核桃貨架期保鮮，因?yàn)橛扇庋劭梢?jiàn)，鮮核桃霉變癥狀中青霉霉變癥狀更為嚴(yán)重。

圖5 二氧化氯對(duì)4 種致病菌的濃度效應(yīng)曲線及IC50Fig.5 Dose-effect curve and IC50 of chlorine dioxide on four pathogens

2.3 各制劑對(duì)孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的影響

以ClO2緩釋熏蒸劑對(duì)兩種霉菌各自的IC50作為供試濃度，分析ClO2對(duì)兩種霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用。由圖6 可知，在6 d 之前ClO2對(duì)青霉和塔賓曲霉的孢子萌發(fā)均有顯著的抑制作用，但是隨著時(shí)間的推移該效應(yīng)逐漸減弱。比較兩種霉菌的孢子萌發(fā)率可知（圖6A 和圖6B），在2、3 d 時(shí)處理組的青霉孢子萌發(fā)率分別約為40%、60%，塔賓曲霉的孢子萌發(fā)率分別約為60%，80%?？梢?jiàn)ClO2對(duì)青霉的孢子萌發(fā)抑制作用強(qiáng)于塔賓曲霉。

圖6 IC50 水平的二氧化氯處理后青霉（A）和塔賓曲霉（B）的孢子萌發(fā)率Fig.6 Spore germination rate of Penicillium sp (A) and Aspergillus tubingensis (B) treated with chlorine dioxide at IC50 level

如表6 所示，ClO2極顯著抑制了兩種霉菌菌絲的生長(zhǎng)（P<0.01），并且抑制率均大于50%，對(duì)青霉的抑制作用較塔賓曲霉更強(qiáng)。前人研究發(fā)現(xiàn)ClO2顯著促進(jìn)了指狀青霉（Penicillium digitatum）的細(xì)胞凋亡，抑制了其菌絲體生長(zhǎng)[26]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果跟該研究趨于一致，Liu 等[26]采用了200～1800 mg/L 的ClO2，對(duì)4 種柑橘類果實(shí)的青霉病具有顯著抑制作用，其離體抑菌實(shí)驗(yàn)的最低有效濃度為200 mg/L，本實(shí)驗(yàn)為40 mg/L，表明ClO2對(duì)核桃霉菌的抑制作用強(qiáng)于柑橘的致病霉菌，更適合用于核桃霉變控制。

表6 不同處理下兩種霉菌菌絲生長(zhǎng)速率的變化（mm/d）Table 6 Growth rate of mycelium for two molds under ClO2 treatment (mm/d)

2.4 二氧化氯對(duì)貨架期鮮核桃霉變的影響

在25 ℃貨架6 d 和12 d 時(shí)，40 mg/L ClO2緩釋熏蒸處理較對(duì)照均顯著（P<0.05）減少了鮮核桃表面滋生真菌和細(xì)菌的數(shù)量（表7），且霉變起始期從對(duì)照的6 d 推遲至12 d，且12 d 時(shí)處理組的霉菌數(shù)量較對(duì)照組減少50.1%，細(xì)菌數(shù)較對(duì)照減少98.4%。對(duì)比圖5 的離體抑菌試驗(yàn)的結(jié)果，在活體條件下ClO2對(duì)細(xì)菌的抑菌效果較真菌更強(qiáng)。在5 ℃下，ClO2處理將真菌與細(xì)菌的滋生天數(shù)由對(duì)照的12 d 延遲至24 d 以上，與25 ℃下相同，處理對(duì)細(xì)菌的抑制率高于真菌。從各組的觀測(cè)數(shù)量上看，相同貨架時(shí)間內(nèi)，鮮核桃表面滋生的細(xì)菌較真菌多，表明活體條件下，細(xì)菌較真菌繁殖和生長(zhǎng)更快，ClO2這種優(yōu)先抑制細(xì)菌的效應(yīng)更有利于鮮核桃病原菌的控制。由表7還可見(jiàn)，5 ℃下微生物發(fā)展慢于25 ℃，低溫是抑制微生物滋生的最有效措施。國(guó)家對(duì)生鮮果實(shí)的微生物總量沒(méi)有具體標(biāo)準(zhǔn)，參考《干果食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定葡萄干，柿餅等鮮果干燥制成的干果食品不得有霉變[27]的標(biāo)準(zhǔn)，及《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 糕點(diǎn)、面包》中對(duì)糕點(diǎn)、面包中菌落總數(shù)應(yīng)<10000 CFU/g 的規(guī)定[28]，ClO2處理鮮核桃5 ℃貨架期24 d 完全符合食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，而對(duì)照在25 ℃下6 d，5 ℃下12 d 均已出現(xiàn)微生物超標(biāo)的情況。25 ℃下6 d 和12 d 的觀測(cè)均得出，核桃青皮提取液（GE）的復(fù)合應(yīng)用（P3+ClO2+GE）并沒(méi)有較單獨(dú)使用（P3+ClO2）增進(jìn)對(duì)真菌和細(xì)菌的抑制作用。

表7 貨架期鮮核桃微生物數(shù)量變化（×104 CFU/g）Table 7 Changes of microbial quantity of fresh walnut during shelf life (×104 CFU/g)

2.5 二氧化氯對(duì)貨架期鮮核桃感觀品質(zhì)的影響

25 ℃貨架6 d 和5 ℃貨架12 d 后剝?nèi)ズ颂覛ず罂梢?jiàn)，各組核桃仁雖然均未出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的病變，然而感觀色澤和新鮮度差別很大。如表8 所示，25 ℃下，隨著貨架時(shí)間的延長(zhǎng)，核桃仁種衣褐變加劇，L*下降，6 d 時(shí)各組核桃仁L*均下降15%以上，兩個(gè)處理下降量小于對(duì)照，但差異不顯著（P>0.05）。12 d 時(shí)兩個(gè)處理的L*顯著高于對(duì)照（P<0.05）。5 ℃條件下，核桃仁種衣褐變大大延緩。兩個(gè)處理進(jìn)一步減少了種衣L*的下降量。在6～24 d 下降量均低于對(duì)照，差異均顯著（P<0.05），48 d 時(shí)差距縮小，但是復(fù)合處理依然顯著高于對(duì)照（P<0.05）。聯(lián)系到上文觀測(cè)到兩處理顯著的抑菌效果可知，ClO2或ClO2+GE 的復(fù)合處理通過(guò)抑制鮮核桃表面的微生物滋生，減緩了鮮核桃堅(jiān)果整體品質(zhì)劣變，抑制了核桃仁的褐變，以低溫條件下的作用較室溫下更強(qiáng)，復(fù)合處理較ClO2單獨(dú)處理效果更顯著。

表8 各抑菌劑處理后核桃仁的感官品質(zhì)Table 8 Sensory quality of walnut kernel treated with various antibacterial agents

種皮剝離度方面，在25 ℃下，隨著保鮮時(shí)間延長(zhǎng)，核桃仁種皮剝離度大幅下降。6 d 時(shí)各組核桃仁種皮剝離度均下降20%以上，6～12 d 兩個(gè)處理下降量小于對(duì)照，且差異顯著（P<0.05）。5 ℃貨架條件下，核桃仁種皮剝離度下降大大延緩。兩個(gè)處理進(jìn)一步減少了種皮剝離度的下降量。在6～24 d 下降量均低于對(duì)照，但差異不顯著。消費(fèi)者可接受度方面，25 ℃貨架條件下，隨著保鮮時(shí)間的加長(zhǎng)，消費(fèi)者可接受度迅速降低，12 d 時(shí)對(duì)照組的消費(fèi)者可接受度僅為3.30，表明此時(shí)的核桃仁的品質(zhì)（色、香、味）已低于可接受范圍。6～12 d 兩個(gè)處理的消費(fèi)者可接受度均高于對(duì)照，差異顯著（P<0.05）。5 ℃貨架條件下，可延緩消費(fèi)者可接受度的下降。6～24 d 兩個(gè)處理的消費(fèi)者可接受度仍高于對(duì)照，但差異不顯著（P>0.05），48 d 時(shí)兩個(gè)處理的消費(fèi)者可接受度顯著高于對(duì)照（P<0.05）。可見(jiàn)，ClO2增加了貨架期鮮核桃的種皮剝離度，維持了較好感官品質(zhì)，增大了消費(fèi)者可接受度。GE 和ClO2復(fù)合處理在維持種皮亮度方面相比ClO2單獨(dú)處理作用更強(qiáng)。

對(duì)25 ℃貨架保鮮的鮮核桃仁進(jìn)行0～12 d 外觀形態(tài)拍攝記錄，如圖7 所示，對(duì)照組鮮核桃仁在6 d 時(shí)已出現(xiàn)明顯的褐變，嚴(yán)重降低了核桃仁的品相和消費(fèi)者可接受度。而ClO2處理組的核桃仁品相相差較小，出現(xiàn)輕度褐變，核桃仁色澤光亮，品相良好。對(duì)照組鮮核桃仁在12 d 時(shí)褐變進(jìn)一步加重，呈深褐色，完全失去消費(fèi)價(jià)值。而ClO2處理組雖然核桃仁表面有一定的褐變程度，但仍具有良好的品相，且表面無(wú)明顯霉菌癥狀。

圖7 鮮核桃仁于25 ℃下0、6、12 d 的外觀狀態(tài)Fig.7 Appearance of fresh walnut kernel at 25 ℃ for 0 d,6 d and 12 d

前人將含核桃青皮提取液（GE）復(fù)合涂膜劑成功用于鮮切蘋(píng)果的保鮮[14]，本研究用于鮮核桃病原菌離體抑菌效果卻不明顯（數(shù)據(jù)未顯示），與ClO2復(fù)合使用于鮮核桃表現(xiàn)了部分活體抑菌效應(yīng)。由于GE 富含各種多酚類物質(zhì)[29]，可推測(cè)GE 的主要效應(yīng)不在于抑菌，而是抗氧化，從而減輕了貨架期鮮核桃殼及其內(nèi)部核桃仁品質(zhì)下降，理論上也是鮮核桃保鮮中富于前景的功能性植物保鮮劑。只是，本文采用粗提液作用并不顯著。通過(guò)優(yōu)化GE 提取的工藝溶劑[30]和提取方法[31]，有望進(jìn)一步提高GE 的抑菌效果，為GE推廣應(yīng)用于鮮核桃尋找新的保鮮方法。

3 結(jié)論

從病變的核桃上分離純化和鑒定出青霉（Penicilliumsp）、塔賓曲霉（Aspergillus tabinus）、桉樹(shù)假單胞菌（Pseudomonas eucalyptus）和黃色微球菌（Micrococcus flavus）4 種菌株，是鮮核桃的主要致病菌。

ClO2熏蒸對(duì)4 種病原菌的抑制效應(yīng)在0～40 mg/L 之間均具有量效關(guān)系，對(duì)兩種真菌100%抑制的濃度為16～30 mg/L，對(duì)兩種細(xì)菌為40 mg/L。40 mg/L ClO2處理下，25 和5 ℃貨架期鮮核桃的真菌與細(xì)菌滋生數(shù)量均顯著降低，霉變期延遲，減緩鮮核桃仁的感官品質(zhì)下降，鮮核桃無(wú)可見(jiàn)霉變期分別保持6、24 d，核桃仁的消費(fèi)者可接受期由對(duì)照的6、24 d 分別達(dá)到12、48 d。核桃青皮提取液復(fù)合使用僅對(duì)ClO25 ℃下的抑菌效應(yīng)有所促進(jìn)，對(duì)核桃仁感觀品質(zhì)略有提升。

綜上得出，40 mg/L ClO2熏蒸是鮮核桃室溫和低溫貨架保鮮均適用的措施，按藥劑成本0.10 元/kg核桃，是經(jīng)濟(jì)又高效的保鮮方法，在生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用潛力。