QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測豬肉中76 種獸藥及其代謝物

吳彥蕾，蘇 敏，周純潔，田 圓，汪 敏

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（調(diào)味品監(jiān)管技術(shù)），重慶 401121）

我國是豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)大國，其質(zhì)量安全問題主要來源于獸藥殘留[1-3]。長期食用獸藥殘留超標(biāo)的豬肉，會造成人體內(nèi)獸藥蓄積，抑制人體的免疫功能，危害人體健康[4-6]。獸藥種類繁多，結(jié)構(gòu)多樣，化學(xué)性質(zhì)也存在較大差異[7-9]。目前的國標(biāo)檢測方法大多是測定某一種或某一類藥物，在實(shí)際檢測中往往需要反復(fù)取樣，并采用不同的方法進(jìn)行樣品前處理，耗時(shí)耗力，無法實(shí)現(xiàn)對多種類獸藥殘留的同時(shí)檢測，因而在發(fā)生食品安全突發(fā)事件時(shí)和應(yīng)急保障工作中就顯得力不從心[10-12]。因此，簡便、快速、高通量、高靈敏度已成為未來獸藥殘留檢測領(lǐng)域發(fā)展的趨勢[13-15]。

近年來，快速、簡便、便宜、高效、可靠、安全的QuEChERS 樣品前處理方法結(jié)合高靈敏度、高選擇性的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)已經(jīng)開始應(yīng)用于動(dòng)物源性食品的獸藥殘留檢測[16-20]，研究者通過不斷改進(jìn)凈化方式和凈化材料，對動(dòng)物源性食品中的多種類獸藥殘留的測定進(jìn)行了探索[21-22]。值得一提的是，獸藥理化性質(zhì)差異較大，色譜保留能力和溶解性也各不相同，采用QuEChERS技術(shù)凈化后得到的溶液通常為高比例有機(jī)相，若直接進(jìn)樣容易出現(xiàn)不同程度的溶劑效應(yīng)。許多研究者采用氮吹后高比例水相復(fù)溶的方式來減少溶劑效應(yīng)，但往往一些弱極性的獸藥又難以復(fù)溶。針對這一問題，本研究建立了一種基于化合物色譜行為和溶解性的集成化分類方式，以理化性質(zhì)各異的18 種喹諾酮類、23 種磺胺類、10 種硝基咪唑類、9 種大環(huán)內(nèi)酯類、16 種苯并咪唑類獸藥及其代謝物作為研究對象，將這76 種化合物分為弱極性的Q1 組和強(qiáng)極性的Q2 組，選擇豬肉為代表基質(zhì)，采用QuEChERS 技術(shù)一步凈化后分組進(jìn)行UPLC-MS/MS 測定，既能解決弱極性化合物的溶解性問題又能減少強(qiáng)極性化合物的溶劑效應(yīng)。該方法操作簡便、快速、靈敏度和準(zhǔn)確度高，有拓展更多類別獸藥及其代謝物的潛力，為豬肉中多類別獸藥殘留檢測提供了有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇中18 種喹諾酮類混標(biāo)溶液、甲醇中23 種磺胺類混標(biāo)溶液、乙腈中10 種硝基咪唑類混標(biāo)溶液、甲醇中9 種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素混標(biāo)溶液、甲醇中16 種苯丙咪唑類混標(biāo)溶液 100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司；乙腈、甲醇 色譜純，德國Merck 公司；甲酸 色譜純，德國CNW 公司；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）（40～50 μm）、石墨化炭黑（GCB）天津Agela Technologies 公司；無水硫酸鈉、無水硫酸鎂 分析純，重慶川東化工公司；聚四氟乙烯（PTFE）濾膜 0.22 μm，美國Agilent公司；實(shí)驗(yàn)用水 超純水；豬肉樣品 購自重慶市內(nèi)超市及農(nóng)貿(mào)市場。

QTRAP 5500 型三重四級桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX 公司；Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜儀 美國WATERS 公司；VORTEX GENIUS3 型渦旋振蕩儀 德國IKA 公司；Milli-Q 型超純水機(jī) 美國Millipore 公司；MSE225P-ICEDU 型電子天平 德國Sartorius 公司；超聲波清洗器 德國Elma 公司；MD200-2 型氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：分別準(zhǔn)確移取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈定容至10 mL，得到10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，-20 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用乙腈定容至10 mL，得到1 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，4 ℃避光保存。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 樣品提取 稱取均質(zhì)試樣5 g（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，加入2 mL 乙腈飽和的正己烷，渦旋混合30 s，再加入0.2%甲酸乙腈10 mL，渦旋混合30 s；加入6 g 無水硫酸鈉后迅速振搖，渦旋1 min，37 kHz 超聲提取15 min 后，以8000 r/min 離心5 min，待凈化。

1.2.2.2 提取液凈化 移取5 mL 提取液到含有500 mg無水硫酸鎂和500 mg C18吸附劑的離心管中，渦旋1 min 后以8000 r/min 離心5 min。離心后取1 mL上清液經(jīng)0.22 μm PTFE 濾膜過濾后供Q1 組目標(biāo)化合物的測定；同時(shí)取2 mL 上清液在40 ℃下用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)屑尤?.5 mL 0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水（v/v，2:8），渦旋混勻后經(jīng)0.22 μm PTFE 濾膜過濾，供Q2 組目標(biāo)化合物的測定。

1.2.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制 稱取7 份陰性豬肉樣品各5 g，按“1.2.2”操作步驟進(jìn)行后，得到空白基質(zhì)溶液，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。

1.2.4 儀器條件

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱：WATERS ACQUITY UPLC HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸乙腈，B 為0.1%甲酸水；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；Q1 組梯度洗脫程序：0～1.0 min，90%～5% B；1.0～2.5 min，5% B；2.5～2.6 min，5%～90% B；2.6～4.0 min，90% B；Q2 組梯度洗脫程序：0～4.5 min，95%～85% B；4.5～6.0 min，85%～5%B；6.0～6.5 min，5% B；6.5～6.6 min，5%～95% B；6.6～8 min，95% B。

1.2.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；噴霧電壓：5500 V；氣簾氣（CUR）壓力：35 psi；霧化氣（GS1）壓力：50 psi；輔助氣（GS2）壓力：50 psi；離子源溫度（TEM）：550 ℃；76 種獸藥及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 76 種獸藥及其代謝物的保留時(shí)間、母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量Table 1 Retention times,parent ions,product ions,declustering potentials (DPs),and collision energies (CEs) of the 76 veterinary drugs and their metabolites

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

由于部分磺胺類及硝基咪唑類化合物的極性較強(qiáng)，本研究選用對極性小分子保留性能優(yōu)良的WATERS ACQUITY HSS T3 色譜柱進(jìn)行色譜分離?？紤]到樣品前處理采用乙腈體系作為提取溶劑，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈和水的混合體系作為流動(dòng)相，并考察了流動(dòng)相中引入pH 調(diào)節(jié)劑甲酸或離子對試劑乙酸銨對76 種獸藥及其代謝物的色譜峰形及質(zhì)譜響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，乙腈-水作流動(dòng)相時(shí)，喹諾酮類和苯丙咪唑類化合物的色譜峰拖尾明顯；乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液作流動(dòng)相時(shí)，喹諾酮類化合物峰形仍然不理想；0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈-含0.1%甲酸10 mmol/L 乙酸銨水溶液作流動(dòng)相時(shí)，喹諾酮類和苯并咪唑類化合物的峰形均得到明顯改善，說明流動(dòng)相中引入甲酸可有效改善這兩類化合物的峰形（圖1）。但流動(dòng)相中乙酸銨的引入會使得磺胺硝苯（SAN）的質(zhì)譜響應(yīng)降低1 個(gè)數(shù)量級以上（圖2），因此本研究選擇0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。考慮到磺胺類化合物有5 組同分異構(gòu)體（磺胺醋酰/磺胺脒、磺胺惡唑/磺胺二甲異噁唑、磺胺二甲基嘧啶/磺胺二甲異嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶/磺胺對甲氧嘧啶/磺胺甲氧噠嗪、磺胺間二甲氧嘧啶/磺胺鄰二甲氧嘧啶），實(shí)驗(yàn)采用先緩后陡的梯度洗脫程序，可以兼顧76 種化合物的峰形和質(zhì)譜響應(yīng)。

圖1 流動(dòng)相定容時(shí)76 種獸藥及其代謝物的色譜圖（50 ng/mL）Fig.1 Chromatogram of 76 veterinary drugs and their metabolites using mobile phase as solvent (50 ng/mL)

圖2 不同流動(dòng)相時(shí)磺胺硝苯的質(zhì)譜響應(yīng)Fig.2 Mass spectroscopic response of sulfanitran using different mobile phase

2.2 復(fù)溶液的選擇

由于76 種獸藥及其代謝物極性差異較大，因此樣品前處理過程中復(fù)溶液的選擇非常關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)考察了76 種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（30 ng/mL）氮吹干后，分別用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水體積比為5:95、20:80、50:50、80:20 的溶液和0.1%甲酸乙腈復(fù)溶時(shí)各化合物的色譜行為，發(fā)現(xiàn)3 種喹諾酮類、4 種磺胺類、8 種大環(huán)內(nèi)酯類、7 種苯并咪唑類共22 種化合物（Q1 組）無顯著溶劑效應(yīng)，而其它54 種化合物（Q2 組）在有機(jī)相占比越高時(shí)色譜保留能力越差。當(dāng)有機(jī)相占比≤20%時(shí)，76 種化合物色譜保留效果較好，無顯著溶劑效應(yīng)。由圖3 可見，復(fù)溶液中有機(jī)相占比越低，Q1 組化合物尤其是苯并咪唑類的峰面積越小，這可能是由于這些化合物極性較弱，復(fù)溶液中乙腈含量變低后對這些化合物的溶解能力變差。結(jié)果表明，即使含有相同官能團(tuán)的同類別的獸藥，其色譜保留效果和溶解性也存在較大差異，因此現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中同類別獸藥同時(shí)檢測的方法并不合理。

圖3 Q1 組化合物在不同有機(jī)相占比溶液中的復(fù)溶效果Fig.3 Solubilization of group Q1 in solutions with different amount of organic phase

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)色譜行為和溶解性將76 種獸藥及其代謝物分為兩組進(jìn)行測定（Q1 組和Q2 組）：Q1 組為弱極性的22 種化合物，在色譜柱上保留較好，無顯著溶劑效應(yīng)，因而經(jīng)提取凈化后的樣液即可直接測定；Q2 組為強(qiáng)極性的54 種化合物，溶劑效應(yīng)較強(qiáng)，樣液需經(jīng)氮吹后用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液（v/v，2:8）復(fù)溶后測定。此外，由于Q1 組化合物在色譜柱上普遍保留較強(qiáng)，按照2.1 優(yōu)化出的梯度條件洗脫后保留時(shí)間均集中在6.0～6.5 min。為節(jié)省分析時(shí)間，本研究采用更陡的梯度程序洗脫Q1 組的22 種化合物，見圖4。

圖4 0.1%甲酸乙腈定容時(shí)Q1 組化合物色譜圖Fig.4 Chromatogram of compounds of group Q1 in acetonitrile with 0.1% formic acid

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

乙腈和甲醇是獸藥殘留檢測中常用的提取劑，乙腈與甲醇相比滲透性更強(qiáng)且沉淀蛋白的效果更好，因此本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為主要提取溶劑?？紤]到多數(shù)化合物含堿性基團(tuán)，適量添加甲酸可以提供酸性環(huán)境，與目標(biāo)化合物結(jié)合成鹽從而提高提取效率，本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈和0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%、5%甲酸乙腈作為提取劑時(shí)，豬肉基質(zhì)中Q1 組和Q2 組化合物的平均回收率（圖5a 和圖5b）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用小于0.2%的甲酸乙腈提取時(shí)，可提高各類化合物的平均回收率，這可能是由于甲酸的加入提高了各化合物在乙腈中的溶解度[23]；當(dāng)采用大于0.2%的甲酸乙腈提取時(shí)，除喹諾酮類以外，其它4 類化合物的平均回收率逐漸下降，這可能是由于甲酸含量的增加提高了提取劑對基質(zhì)的滲透作用，使得更多的共提物進(jìn)入到提取液中造成基質(zhì)干擾，降低了化合物的離子化效率[24]；其中Q2 組的磺胺類平均回收率下降最明顯，當(dāng)采用5%甲酸乙腈提取時(shí)，平均回收率低至13.7%，較0.2%甲酸乙腈提取時(shí)降低了80.4%，這可能是由于氮吹導(dǎo)致磺胺在過高的酸性環(huán)境下發(fā)生了一定程度的損失[15,23]。從圖6 可以看出，當(dāng)采用0.2%甲酸乙腈作為提取劑時(shí)，回收率在60%～120%范圍內(nèi)的化合物最多。因此本研究最終選擇0.2%甲酸乙腈作為提取劑。

圖5 不同提取劑時(shí)76 種獸藥及其代謝物的平均回收率Fig.5 Average recoveries of 76 veterinary drugs and their metabolites with different extraction solvents

圖6 不同提取劑時(shí)各回收率范圍內(nèi)的化合物數(shù)量Fig.6 Number of compounds in each recovery range with different extraction solvents

2.4 凈化條件的優(yōu)化

QuEChERS 方法常用的吸附劑主要有PSA、C18和GCB，PSA 可用來去除有機(jī)酸、糖類等極性干擾物，C18能夠吸附脂肪、磷脂等非極性雜質(zhì)，GCB 對平面結(jié)構(gòu)分子有很強(qiáng)的親和性，能有效去除色素和甾醇。由于PSA 對喹諾酮類和磺胺類存在吸附作用[25-28]，本實(shí)驗(yàn)選擇C18和GCB 考察豬肉基質(zhì)中76 種獸藥及其代謝物的回收率，發(fā)現(xiàn)樣品提取液經(jīng)GCB 凈化后，磺胺硝苯、苯硝咪唑、螺旋霉素、替米考星以及18 種喹諾酮類和16 種苯并咪唑類化合物回收率均低于20%。因此，本研究選擇C18作為吸附劑。

實(shí)驗(yàn)考察了使用50、100 和200 mg/mL C18吸附劑時(shí)76 種獸藥及其代謝物的回收率，發(fā)現(xiàn)各化合物的回收率均無顯著變化。然而，豬肉樣品基質(zhì)復(fù)雜，采用0.2%甲酸乙腈提取時(shí)容易共提出大量的磷脂，造成污染儀器，降低色譜柱壽命。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較了不同用量C18吸附劑對豬肉樣品提取液中磷脂的凈化效果。將液相色譜柱替換為雙通接頭后，以豬肉中最為常見的磷脂酰膽堿（PC）作為代表磷脂，選擇PC 的特征碎片離子m/z 184 進(jìn)行母離子掃描得到總離子流圖[29]。由圖7 可見，采用C18吸附劑凈化后，無論是直接測定還是氮吹后復(fù)溶再測定，PC 峰均明顯降低，且出峰時(shí)間越靠后的PC 峰降低越明顯。圖7c 和圖7f 表明，0.9 min 左右的色譜峰高均隨著C18吸附劑用量的增加逐漸下降；采用Q1 組的直接測定法，當(dāng)C18吸附劑的用量≥50 mg/mL時(shí)峰高變化不明顯；采用Q2 組的氮吹后測定法，當(dāng)C18吸附劑的用量≥100 mg/mL 時(shí)峰高變化不明顯。因此，本研究確定每1 mL 樣品提取液中C18吸附劑的用量為100 mg。

圖7 按照Q1 組和Q2 組樣品前處理操作時(shí)豬肉基質(zhì)提取液凈化效果Fig.7 Purification effect of the extract solution from pork when using sample pretreatment of group Q1 and Q2

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是樣品離子化時(shí)樣品基質(zhì)與目標(biāo)化合物相互競爭電離而導(dǎo)致目標(biāo)化合物的響應(yīng)強(qiáng)度發(fā)生不同程度增強(qiáng)或減弱的現(xiàn)象。按照公式：基質(zhì)效應(yīng)（ME，%）=（樣品基質(zhì)中添加相同含量化合物的響應(yīng)值/純?nèi)軇┲谢衔锏捻憫?yīng)值-1）×100，計(jì)算76 種獸藥及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)，ME 為正值表示增強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，負(fù)值表示抑制的基質(zhì)效應(yīng)，絕對值越大表示基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)[30]，見表2。76 種獸藥及其代謝物中有3 種喹諾酮類、1 種磺胺類、6 種大環(huán)內(nèi)酯類、3 種苯并咪唑類化合物基質(zhì)效應(yīng)的絕對值高于20%，說明豬肉基質(zhì)復(fù)雜，即使采用QuEChERS 技術(shù)凈化后仍然對部分化合物存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。因此，本研究采用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量來校正基質(zhì)效應(yīng)。

表2 76 種化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、定量限、加標(biāo)回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和基質(zhì)效應(yīng)（n=6）Table 2 Regression equations,correlation coefficients (r),limits of quantitations (LOQs),spiked recoveries,RSD and Me of the 76 compounds (n=6)

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 線性范圍與檢出限 采用陰性豬肉樣品制備空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測試，以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到76 種獸藥及其代謝物的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，如表2所示。結(jié)果表明，76 種化合物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r 均大于0.995，按照定量離子信噪比（S/N）≥10 時(shí)計(jì)算定量限（LOQ），76 種化合物的定量限（LOQ）均低于10 μg/kg。

2.6.2 回收率及精密度 在陰性豬肉樣品中添加三個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行6 次平行實(shí)驗(yàn)，考察76 種化合物的加標(biāo)回收率和精密度。結(jié)果表明，76 種化合物回收率范圍在61.3%～96.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.0%～14.6%之間，符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》附錄F 中對回收率及精密度的要求，可滿足日常檢測需要。

2.7 實(shí)際樣品測定

采用本研究建立的方法，對170 批次豬肉樣品進(jìn)行全面篩查，其中23 批次樣品檢出5 種獸藥殘留量超出GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定限量。與現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用配對T 檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析，結(jié)果顯示5 個(gè)項(xiàng)目P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此認(rèn)為兩種方法檢測結(jié)果無顯著性差異，詳見表3。

表3 本方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法比較Table 3 Comparison between established method and the state standard methods

3 結(jié)論

本研究結(jié)合QuEChERS 樣品前處理技術(shù)和UPLC-MS/MS 技術(shù)，建立了可同時(shí)檢測豬肉中性質(zhì)各異的5 類76 種獸藥及其代謝物的方法。根據(jù)化合物色譜行為和溶解性，將76 種獸藥及其代謝物進(jìn)行集成化歸類，分為弱極性的Q1 組22 種化合物和強(qiáng)極性的Q2 組54 種化合物，以豬肉為代表基質(zhì)，采用一步凈化后分組測定的方式，既能解決弱極性化合物的溶解性問題又能減少強(qiáng)極性化合物的溶劑效應(yīng)。在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件以及樣品前處理提取、凈化和復(fù)溶條件下，該方法測定76 種化合物回收率范圍在61.3%～96.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于15%，LOQ 小于10 μg/kg，可滿足豬肉中多類別獸藥殘留同時(shí)檢測的需要。