酶解大豆乳清蛋白制備抗氧化肽及其體外抗氧化活性評價

林彥君，劉楊靜，曲肖鳳，杜媛媛，房文碩，尹藝童，李 瑞

（濟寧醫(yī)學院生物科學學院，山東日照 276826）

大豆乳清廢水是由大豆分離蛋白生產(chǎn)過程中產(chǎn)生，具有排放量大和富含有機物的特點[1-3]。目前，大多數(shù)大豆分離蛋白生產(chǎn)企業(yè)將大豆乳清廢水排放至污水處理廠經(jīng)生化法處理[4]，這樣不僅造成了大量有機物的浪費，也給企業(yè)造成了很大的經(jīng)濟負擔[5]。因此，大豆乳清廢水的回收再利用一直是生產(chǎn)企業(yè)亟待解決的關鍵問題之一。

大豆乳清廢水中含有大豆乳清蛋白（whey soy proteins）、低聚糖、大豆異黃酮等有機物[6]。其中，大豆乳清蛋白具有較高的分子量，它的回收能有效降低低聚糖和大豆異黃酮等低分子量有機物的回收難度，所以大豆乳清蛋白的回收再利用可認為是大豆乳清廢水資源化的首要步驟[7]。目前，大豆乳清蛋白的資源化主要有兩種策略：單獨回收其中的蛋白活性組分（如植物凝集素、β-淀粉酶、脂肪氧化酶、胰蛋白酶抑制劑等）并加以利用；整體回收大豆乳清蛋白以作為食品或飼料組分加以利用[8,9]。由于大豆乳清廢水中大豆乳清蛋白濃度低且成分復雜，導致單獨回收每個蛋白活性組分的成本很高，因而第一種策略尚未實現(xiàn)工業(yè)化應用。相比而言，大豆乳清蛋白整體回收的成本較低，并已獲得工業(yè)化應用。然而，企業(yè)所回收的大豆乳清蛋白僅作為動物飼料的添加組分，利用價值相對較低。因此，在整體回收的基礎上，進一步提高大豆乳清蛋白的應用價值對其資源化有重要的意義。

抗氧化活性肽，作為天然的抗氧化劑，因其低毒、高效的特點，在食品、醫(yī)藥和飼料等行業(yè)備受青睞[10-12]。酶解法具有綠色高效、安全、專一性強和成本低的優(yōu)點，在水解大豆分離蛋白制備抗氧化活性肽方面已獲得廣泛的研究[13-15]。然而，酶解大豆乳清蛋白用于制備抗氧化活性肽的研究卻少有報道。尹樂斌等[16]利用乳酸菌對大豆乳清廢水進行發(fā)酵，發(fā)酵液中的多肽具有較高的抗氧化活性。上述研究證實了大豆乳清蛋白可用于生產(chǎn)抗氧化肽，但是發(fā)酵液中成分復雜，導致抗氧化肽的后續(xù)分離十分困難。而采用蛋白酶直接水解從大豆乳清廢水中回收的大豆乳清蛋白則會避免上述問題[17]。鑒于此，本實驗將采用酶解法水解大豆乳清廢水中分離的大豆乳清蛋白以制備抗氧化肽。利用單因素和響應面試驗優(yōu)化大豆乳清蛋白的酶解工藝，以得到活性較高的抗氧化肽混合物。再通過超濾分離該混合物，并以抗壞血酸為參照評價其體外抗氧化活性。本研究旨在為大豆乳清蛋白抗氧化肽的制備提供理論依據(jù)，進一步提高大豆乳清蛋白的利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂豆粕（蛋白含量53.7%±1.4%）湖北興恒業(yè)科技有限公司；堿性蛋白酶（230 U/mg）、胃蛋白酶（30 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）上海藍季科技發(fā)展有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）上海麥克林生化科技有限公司；硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、無水乙醇、三氯乙酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵等 國藥集團化學試劑有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

752N 紫外可見分光光度計、PHS-3C pH 計上海儀電分析儀器有限公司；JJ-1B 300 W 恒速電動攪拌器 金壇區(qū)西城新瑞儀器；Sorvall LYNX6000落地離心機 美國Thermo Scientific 公司；ATN-300 全自動定氮儀 上海精密儀器儀表有限公司；BT100FJ 蠕動泵 保定創(chuàng)銳泵業(yè)有限公司；KQ2200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FD-1A-50 冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；DFY-5L/10 低溫恒溫反應浴 鞏義市予華儀器有限責任公司；WP-UP-YZ-100 超純水機 四川沃特爾水處理設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆乳清廢水的制備 模擬工業(yè)上堿溶酸沉法制備大豆分離蛋白的流程用以生產(chǎn)大豆乳清廢水[18]。首先，按照質(zhì)量比1:5 的比例，將低溫脫脂豆粕與自來水混合，加入6.0 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)混合液pH 至8.0。其次，利用JJ-1B 300 W 恒速電動攪拌器在300 r/min 下攪拌該混合物5.0 h 以促進大豆蛋白的溶解，隨后放入落地離心機，在5000 r/min下離心該混合物10 min，取上清液。在上清液中加入6.0 mol/L 鹽酸溶液調(diào)節(jié)其pH 至4.5，并靜置5.0 h以沉淀大豆分離蛋白。最后，在5000 r/min 下離心懸濁液10 min，取上清液即為大豆乳清廢水。

1.2.2 大豆乳清蛋白的制備 大豆乳清蛋白受熱易變性沉淀[19]，因而企業(yè)所生產(chǎn)的大豆乳清蛋白產(chǎn)品為不溶性的固體沉淀。鑒于此，本文利用熱沉淀法從大豆乳清廢水中快速提取大豆乳清蛋白作為制備抗氧化肽的原料。將大豆乳清廢水煮沸1 min，隨后放入離心機并在5000 r/min 下離心10 min，取沉淀。用超純水清洗沉淀3 次后，利用冷凍干燥機將其在溫度-50 ℃和真空度20 Pa 條件下干燥48 h，即得大豆乳清蛋白樣品。利用凱氏定氮法測定其蛋白含量為85.6%±2.3%

1.2.3 大豆乳清蛋白的酶解 大豆乳清蛋白的酶解在一個自組裝的超聲-恒溫反應體系（見圖1）中進行。在該體系中，低溫恒溫反應浴中的水，通過兩個水流方向相反的蠕動泵（流量100 mL/min），與超聲波清洗器（功率100 W）內(nèi)的水形成循環(huán)水。該體系可將由超聲震蕩所產(chǎn)生的熱量迅速帶離超聲波清洗器，并被低溫恒溫反應浴消除，以維持水溫始終保持在蛋白酶的最適溫度。

圖1 超聲-恒溫反應體系Fig.1 Ultrasound-thermostatic reaction system

具體酶解工藝操作如下：首先，將大豆乳清蛋白凍干粉末與純凈水混合均勻，使用0.6 mol/L 的鹽酸或氫氧化鈉溶液將1000 mL 混合液pH 調(diào)節(jié)至蛋白酶的最適pH。其次，待反應體系的水溫達到蛋白酶的最適溫度，將裝有混合液的燒杯放入超聲波清洗器內(nèi)水浴，平衡30 min 后加入蛋白酶，并打開超聲波清洗器開關進行水解。待達到設定水解時間，將混合液在100 ℃下煮沸5 min 對蛋白酶進行滅活。最后，將混合液水浴冷卻至室溫，并在10000 r/min 下離心10 min，取上清液冷藏備用。

1.2.4 蛋白酶的篩選 以DPPH 自由基清除率、羥自由基清除率和總還原力為指標，選用單酶（胃蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶）與雙酶（中性+堿性蛋白酶、中性+胃蛋白酶和堿性+胃蛋白酶）在各蛋白酶的最適條件下對大豆乳清蛋白進行水解（水解條件見表1），篩選出最佳蛋白酶。在雙酶酶解工藝中，首先利用第一種蛋白酶（左）水解大豆乳清蛋白3 h，煮沸滅酶2 min，隨后調(diào)節(jié)混合液溫度和pH 至第二種蛋白酶（右）的最適溫度和pH，平衡30 min 后加入第二種蛋白酶，水解3 h，煮沸滅酶2 min。

表1 蛋白酶篩選實驗條件Table 1 Experimental conditions for protease screening

1.2.5 單因素實驗 以1.2.4 所篩選出的蛋白酶為最佳蛋白酶水解大豆乳清蛋白以制備抗氧化肽，以DPPH 自由基清除率為指標，進行單因素實驗。固定大豆乳清蛋白濃度5 mg/mL 和酶解時間6 h，探究酶-底物比2000、3000、4000、5000 和6000 U/g 大豆乳清蛋白對大豆乳清蛋白水解液抗氧化活性的影響；固定酶-底物比5000 U/g 大豆乳清蛋白和酶解時間6 h，探究大豆乳清蛋白濃度3、5、7、9 和11 mg/mL對大豆乳清蛋白水解液抗氧化活性的影響；固定大豆乳清蛋白濃度9 mg/mL 和酶-底物比5000 U/g 大豆乳清蛋白，探究酶解時間4、5、6、7 和8 h 對大豆乳清蛋白水解液抗氧化活性的影響。

1.2.6 響應面優(yōu)化試驗 根據(jù)1.2.5 單因素實驗的結果，以酶-底物比、酶解時間和大豆乳清蛋白濃度為影響因素，以DPPH 自由基清除率為響應值，利用Design Expert V8.0.6.1 軟件，按照Box-Behnken 試驗設計原理，進行三因素三水平的響應面試驗設計。具體試驗因素與水平見表2。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments

1.2.7 大豆乳清蛋白酶解產(chǎn)物體外抗氧化活性的測定

1.2.7.1 總還原力的測定 采用普魯士藍法[20]測定大豆乳清蛋白酶解產(chǎn)物的總還原力。具體操作如下：首先，取1 mL 大豆乳清蛋白酶解產(chǎn)物溶液或抗壞血酸溶液和1 mL 純凈水分別為待測溶液和空白對照，向其中分別加入2 mL 磷酸緩沖溶液（pH7.0），隨后將兩種混合液置于低溫恒溫反應浴中，在50 ℃下水浴20 min。其次，待水浴結束后，向兩混合液中分別加入2 mL 三氯乙酸溶液（100 mg/mL），混勻后放入落地離心機，在轉(zhuǎn)速5000 r/min 和溫度5 ℃下離心10 min，取上清液。最后，取兩種上清液2 mL，分別先后加入2 mL 純凈水和0.5 mL 三氯化鐵溶液（1 mg/mL），混勻后靜置10 min，隨后在700 nm 下利用紫外可見分光光度計測量待測溶液的吸光度（OD700）。

1.2.7.2 DPPH 自由基清除率的測定 參考梁星等[21]所報道的方法測定DPPH 自由基清除率，具體操作如下：取三個試管標記為a、b 和c 號，向a 號和c 號試管中分別加入2 mL 純凈水，向b 號和c 號試管中分別加入2 mL WSP 酶解產(chǎn)物溶液或抗壞血酸溶液，向a 號和c 號管中分別加入2 mL DPPH 溶液（0.1 mmol/L），混合均勻。室溫避光靜置30 min 后，以純凈水為空白對照，利用紫外可見分光光度計在517 nm 處測量3 個試管中溶液的吸光度。DPPH 自由基清除率（RDPPH）的計算公式見式（1）。

式中，Aa、Ab和Ac分別為a、b 和c 號試管中溶液的吸光度值。

1.2.7.3 羥基自由基清除率的測定 參考薛山等[22]所報道的方法測定羥基自由基清除率，具體操作如下：首先，取三個試管標記為1、2 和3 號，向其中分別加入2 mL 硫酸亞鐵溶液（6 mmol/L），隨后向1 號試管中加入2 mL 純凈水，向2 號和3 號試管中加入2 mL 大豆乳清蛋白酶解產(chǎn)物溶液或抗壞血酸溶液，混合均勻。其次，向三個試管中分別加入2 mL 雙氧水溶液（6 mmol/L），混合均勻后靜置10 min。最后，到達靜置時間后，向1 號和2 號試管中加入2 mL水楊酸溶液（6 mmol/L），并向3 號試管中加入2 mL純凈水，混合均勻后靜置30 min，隨后以純凈水為空白對照，在510 nm 下利用紫外可見分光光度計測量3 個試管中溶液的吸光度。羥基自由基清除率（ROH）的計算公式見式（2）。

式中，A1、A2和A3分別為1、2 和3 號試管中溶液的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次實驗至少重復3 次，隨后利用Microsoft Excel Plus 2013 進行方差分析（顯著水平設置為P<0.05），利用Origin Pro 9.0 軟件進行繪圖，利用Design-Expert 8.0.6 軟件進行響應面設計及分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

不同蛋白酶的酶切位點不同，因而酶解所產(chǎn)生的多肽就會多種多樣[23]。因此，利用3 種單酶和3 種雙酶來水解大豆乳清蛋白（具體實驗條件見表1），并考察了蛋白酶種類對水解產(chǎn)物體外抗氧化活性的影響，結果如圖2 所示。由圖可知，利用單酶水解時，胃蛋白酶水解產(chǎn)物的總還原力（0.140±0.03）、DPPH自由基清除率（37.3%±1.6%）和羥基自由基清除率（94.8%±0.8%）均顯著高于中性蛋白酶和堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物（P<0.05）。這是因為大豆乳清蛋白中蛋白成分復雜，而胃蛋白酶具有廣泛的特異性，并且可以水解含有苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基肽鏈中的肽鍵，而這些氨基酸與多肽抗氧化活性緊密相關[24]。利用雙酶水解時，相比胃蛋白酶水解產(chǎn)物，中性和堿性蛋白酶組合水解產(chǎn)物的總還原力無顯著性提高（P>0.05），DPPH 自由基清除率和羥基自由基清除率反而有所降低（P<0.05）。堿性和胃蛋白酶組合水解產(chǎn)物的抗氧化性與胃蛋白酶水解產(chǎn)物的抗氧化性無顯著性差異（P>0.05）。值得注意的是，中性和胃蛋白酶組合水解產(chǎn)物的總還原力、DPPH 自由基清除率和羥基自由基清除率分別為0.245±0.010、45.4%±1.7%和99.2%±0.4%，均顯著高于胃蛋白酶水解產(chǎn)物的對應值（P<0.05）。這可能是因為中性蛋白酶使得胃蛋白酶的酶切位點更加暴露，因而強化了胃蛋白酶對大豆乳清蛋白的水解，促進了更多抗氧化肽的釋放[25-26]。綜上，選擇中性蛋白酶和胃蛋白酶順序雙酶組合作為水解大豆乳清蛋白的最適酶。

2.2 單因素實驗

在“2.1”的實驗結果的基礎上，以中性蛋白酶和胃蛋白酶組合為最適酶，以DPPH 自由基清除率為指標，考察酶-底物比、大豆乳清蛋白濃度和酶解時間對大豆乳清蛋白水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響。

如圖2 所示，大豆乳清蛋白水解產(chǎn)物的總還原力數(shù)值偏低、而羥基自由基清除率的數(shù)值偏高，相比較而言DPPH 自由基清除率的數(shù)值較為適中。此外，當DPPH 自由基清除率較高時，總還原力和羥基自由基清除率也均較高，因而DPPH 自由基清除率可用于指示大豆乳清蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化性。因此，為了簡化實驗過程，選取DPPH 自由基清除率作為抗氧化活性的表征指標[27]。

2.2.1 酶-底物比對酶解效果的影響 圖3 展示了酶-底物比對大豆乳清蛋白水解液DPPH 自由基清除率影響的實驗結果。方差分析結果顯示酶-底物比對大豆乳清蛋白水解液DPPH 自由基清除率的影響顯著（P<0.05）。具體結果如下：隨著酶-底物比由2000 U/g 大豆乳清蛋白增加到6000 U/g 大豆乳清蛋白，大豆乳清蛋白水解液的DPPH 自由基清除率由33.2%±0.6%增加到53.0%±0.8%，隨后降低到47.7%±0.7%。最大DPPH 自由基清除率出現(xiàn)在5000 U/g大豆乳清蛋白處。隨著酶-底物比由2000 U/g 大豆乳清蛋白增加到5000 U/g 大豆乳清蛋白，酶與底物的結合量增加，酶解反應速率提高，促進了抗氧化肽的釋放，因此DPPH 自由基清除率會逐漸提高。但是當酶-底物比過多時，釋放的抗氧化肽會被過度水解，導致抗氧化活性降低[28]，所以，當酶-底物比超過5000 U/g 大豆乳清蛋白時，DPPH 自由基清除率逐漸降低。鑒于上述結果，5000 U/g 大豆乳清蛋白選為最適酶-底物比。

圖3 酶-底物比對大豆乳清蛋白水解液DPPH 自由基清除率的影響Fig.3 Effect of enzyme-substrate ratio on scavenging rate of DPPH radical of whey soy proteins hydrolysates

2.2.2 大豆乳清蛋白濃度對酶解效果的影響 圖4描述了大豆乳清蛋白濃度對大豆乳清蛋白水解液DPPH 自由基清除率影響的實驗結果。由圖4 可知，隨著大豆乳清蛋白濃度由3 mg/mL 增加到9 mg/mL，大豆乳清蛋白水解液DPPH 自由基清除率由43.5%±0.7%增加到62.2%±0.6%（P<0.05）。隨著大豆乳清蛋白濃度的繼續(xù)增加，DPPH 自由基清除率未發(fā)生顯著的變化（P>0.05）。當酶-底物比一定的情況下，由米氏方程可知，隨著底物濃度的增加，酶催化反應速率會增加，但是當?shù)孜餄舛仍黾拥捷^大程度時，酶催化反應的速率增加速率較慢[29]。酶催化反應速率的增加，會強化抗氧化肽的釋放，所以隨著大豆乳清蛋白濃度的增加DPPH 清除率逐漸增加。當大豆乳清蛋白濃度超過9 mg/mL 時，酶催化反應速率不再大幅度增加，導致抗氧化肽釋放變緩，導致DPPH 自由基清除率不再顯著增加。綜上，9 mg/mL 選擇為最佳的底物濃度。

圖4 大豆乳清蛋白濃度對大豆乳清蛋白水解液DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of whey soy proteins concentration on scavenging rate of DPPH radical of whey soy proteins hydrolysates

2.2.3 酶解時間對酶解效果的影響 酶解時間對大豆乳清蛋白水解液DPPH 自由基清除率影響的實驗結果如圖5 所示。隨著酶解時間的增加，大豆乳清蛋白分子上的特異性位點逐漸被反應，水解液中抗氧化肽的釋放量逐漸增加[30]。因此，隨著酶解時間由4 h 增加到6 h 時,大豆乳清蛋白水解液DPPH 自由基清除率由46.9%±0.9%增加到62.2%±0.6%（P<0.05）。然而，隨著酶解時間繼續(xù)增加到8 h，DPPH自由基清除率降低到53.9%±0.9%。這可能是因為釋放的抗氧化肽鏈上仍存在特異性位點，隨著酶解時間的延長，大豆乳清蛋白分子上的特異性位點被完全反應，蛋白酶進一步與抗氧化肽結合，使得本來活性較高的抗氧化肽遭受了過度酶切，從而導致其活性降低[31]。綜上，6 h 選擇為最佳的酶解時間。

圖5 酶解時間對大豆乳清蛋白水解液DPPH 自由基清除率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on scavenging rate of DPPH radical of whey soy proteins hydrolysates

2.3 響應面試驗與分析

2.3.1 試驗設計與結果 在2.2 小節(jié)單因素實驗的基礎上，以酶-底物比（A）、酶解時間（B）和大豆乳清蛋白濃度（C）為因素，以DPPH 自由基清除率（RDPPH）為響應值，進行三因素三水平的響應面試驗設計，具體試驗方案及結果如表3 所示。

表3 大豆乳清蛋白酶解響應面試驗設計與結果Table 3 Response surface design and results for enzymatic hydrolysis of whey soy proteins

利用Design Expert V8.0.6.1 軟件對表3 中的實際實驗條件及對應結果進行多元回歸擬合，得到擬合方程：RDPPH（%）=-481.13313+0.091863A+77.73250B+12.92625C-2.47500×10-3AB+9.00000×10-4AC-0.10000BC-7.84750×10-6A2-5.29750B2-0.89312C2。

2.3.2 方差分析 多元回歸的方差分析結果如表4所示。分析結果表明，相對于殘差，多元回歸模型擬合所引起的變異極顯著（P<0.01），失擬項所引起的變異不顯著（P>0.05）。并且，多元回歸的決定性系數(shù)和校正決定系數(shù)接近于1 且相差較小。由此可知，2.3.1 中所描述的多元回歸方程模型能較好地預測和分析酶-底物比、酶解時間和大豆乳清蛋白濃度及其交互作用對大豆乳清蛋白水解液DPPH 自由基清除率的影響規(guī)律[32]。此外，模型方程中A、C、AB、A2、B2、C2對水解液DPPH 自由基清除率的影響極顯著（P<0.01），而B 和AC 的影響顯著（P<0.05）。通過對比F值大小，可知各因素對水解液DPPH 自由基清除率的影響順序為：酶-底物比（A）>大豆乳清蛋白濃度（C）>酶解時間（B）。

表4 多元回歸的方差分析結果Table 4 Results of analysis of variance for multiple regression

2.3.3 雙因素交互作用影響分析 酶-底物比、酶解時間和大豆乳清蛋白濃度三因素兩兩交互作用對大豆乳清蛋白水解液DPPH 自由基清除率影響的結果如圖6 所示。由圖6 可知，隨著各因素的增大，DPPH自由基清除率均是先升高然后降低，與單因素實驗結果相一致。對比圖6a～圖6c 可知，DPPH 自由基清除率隨酶-底物比和酶解時間以及酶-底物比和大豆乳清蛋白濃度變化的曲面較為陡峭，且其等高線呈現(xiàn)橢圓形；而DPPH 自由基清除率隨酶解時間和大豆乳清蛋白濃度變化的曲面則較為平緩，且其等高線則近似于圓形。以上結果表明，酶-底物比和酶解時間的交互作用和酶-底物比和大豆乳清蛋白濃度的交互作用對大豆乳清蛋白水解液DPPH 自由基清除率的影響顯著，而酶解時間和大豆乳清蛋白濃度對大豆乳清蛋白水解液DPPH 自由基清除率的影響不顯著[33]。

圖6 酶-底物比、酶解時間和大豆乳清蛋白濃度交互作用對大豆乳清蛋白水解液DPPH 自由基清除率影響的曲面圖Fig.6 Surface maps for effects of interactions among enzymesubstrate ratio,hydrolysis time and whey soy proteins concentration on scavenging rate of DPPH radical of whey soy proteins hydrolysates

2.3.4 最佳酶解工藝參數(shù)的確定 利用Design Expert V8.0.6.1 軟件對大豆乳清蛋白酶解工藝進行優(yōu)化，得出理論最佳工藝參數(shù)為酶-底物比5000 U/g 大豆乳清蛋白、酶解時間6 h 和大豆乳清蛋白濃度9.0 mg/mL，對應的DPPH 自由基清除率預測值為62.52%。按照上述實驗條件，進行3 次驗證性實驗，測定DPPH 自由基清除率為62.3%±1.1%，與預測值相近，說明該擬合模型所優(yōu)化出的大豆乳清蛋白酶解工藝條件較為準確。

2.4 大豆乳清蛋白抗氧化肽的體外抗氧化活性評價

在“2.3.4 小節(jié)”所確定的最佳工藝條件下，對大豆乳清蛋白進行水解。水解產(chǎn)物經(jīng)離心去除固體雜質(zhì)后，利用截留分子量為30 kD 的超濾管分離上清液中的抗氧化肽，凍干后溶于純凈水中配制成不同濃度的抗氧化肽溶液。以抗壞血酸溶液為參比，測定抗氧化肽溶液的總還原力、DPPH 自由基清除率和羥基自由基清除率。實驗結果如圖7 所示。由圖可知，隨著濃度的增加，大豆乳清蛋白抗氧化肽和抗壞血酸的總還原力、DPPH 自由基清除率和羥基自由基清除率都顯著增加（P<0.05）。此外，在同一濃度下，抗氧化肽的總還原力和DPPH 自由基清除率均顯著低于抗壞血酸的對應數(shù)值（P<0.05），而羥基自由基清除率隨抗壞血酸和抗氧化肽濃度變化的趨勢較為接近。利用Origin Pro 9.0 軟件對圖7 中總還原力、DPPH 自由基清除率和羥基自由基清除率隨濃度變化的數(shù)據(jù)進行多項式擬合，擬合結果如表5 所示，其結果均顯著（P<0.05）。利用擬合公式分別計算總還原力為0.5，DPPH 自由基清除率和羥基自由基清除率為50%時所需的大豆乳清蛋白抗氧化肽和抗壞血酸溶液用量，即為半數(shù)有效量 IC50[34]。計算結果顯示，大豆乳清蛋白抗氧化肽總還原力、DPPH 自由基清除率和羥基自由基清除率的IC50值分別為0.128、0.221 和0.185 mg/mL，分別是抗壞血酸IC50值的2.56、40.76、1.47 倍，表明抗氧化肽的活性略低于抗壞血酸。綜合來看，大豆乳清蛋白抗氧化肽有較好的抗氧化活性。

表5 圖7 中數(shù)據(jù)的多項式擬合結果Table 5 Polynomial fitting results of the data in figure 7

圖7 總還原力（A）、DPPH 自由基清除率（B）和羥基自由基清除率（C）隨大豆乳清蛋白抗氧化肽與抗壞血酸濃度的變化曲線Fig.7 Variations of total reducing force (A),scavenging rate of DPPH radical (B) and scavenging rate of hydroxyl radical (C)with concentrations of whey soy proteins antioxidative peptides and ascorbic acid

3 結論

在超聲恒溫反應體系中，采用單因素實驗和響應面試驗設計確定了酶解大豆乳清蛋白制備抗氧化肽的最佳工藝條件。即中性蛋白酶和胃蛋白酶順序酶解為水解大豆乳清蛋白的最適酶，酶-底物比5000 U/g 大豆乳清蛋白、酶解時間6 h 和大豆乳清蛋白濃度 9.0 mg/mL。在此條件下，大豆乳清蛋白水解液的DPPH 自由基清除率為62.3%±1.1%。利用超濾從水解液中分離出分子量小于30 kDa 的抗氧化肽，其總還原力、DPPH 自由基清除率和羥基自由基清除率IC50值分別為0.128、0.221 和0.185 mg/mL，分別是抗壞血酸IC50值的2.56、40.76 和1.47 倍，表明抗氧化肽的活性略低于抗壞血酸。綜上可得，大豆乳清蛋白可用于制備抗氧化活性較好的活性肽，這對有效提高大豆乳清蛋白的應用價值有重要的意義。