霍山石斛茶飲的制備工藝優(yōu)化及其免疫調(diào)節(jié)作用

黃 科，林啟焰，楊 迎，侯婷婷，韓邦興，劉 東,

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230012；2.安徽省中藥生態(tài)農(nóng)業(yè)工程研究中心，安徽六安 237012；3.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安 237012）

霍山石斛（Dendrobium hooshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng，蘭科）的莖在許多東南亞國(guó)家被用作泡茶、湯和粥的原料，已有數(shù)百年的歷史[1]，其中霍山石斛是蘭科石斛屬（Dendrobium）的一種重要的食用藥用植物[2]。主產(chǎn)地為安徽大別山，常生長(zhǎng)于石縫，樹木以及地勢(shì)陡峭之地?；羯绞哂卸喾N活性成分，如多糖類、雙芐基類、倍半萜類、酚類等化學(xué)成分，其中多糖類成分是其主要成分，藥理活性也多來(lái)源于霍山石斛多糖[3]。近年來(lái)，霍山石斛被報(bào)道具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用[3-6]，因此霍山石斛的價(jià)值也飛速上漲，但是關(guān)于霍山石斛的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)卻還處于探索之中。目前關(guān)于霍山石斛的產(chǎn)品主要有石斛花茶，石斛鮮葉速溶粉，石斛功能性酸奶等[7]，仍需進(jìn)一步的研究和探索。

茶是世界上最暢銷的飲料，根據(jù)發(fā)酵程度分為綠茶、烏龍茶和紅茶[8]，其中紅茶在世界范圍內(nèi)受到廣泛的追捧和喜愛(ài)[9]。紅茶作為一種健康飲料，對(duì)人體有許多有益的作用，如增強(qiáng)免疫力、降壓、抗腫瘤、抗癌等[10-13]。而茶多酚是茶葉中主要的活性成分，有報(bào)道表明其具有免疫調(diào)節(jié)作用[14-15]。紅茶中的祁門紅茶作為中國(guó)四大紅茶之一，具有口感好，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富等優(yōu)點(diǎn)[16]。而作為一種日常飲品來(lái)說(shuō)，祁門紅茶具有容易被人接受，價(jià)格親民等優(yōu)勢(shì)，因此在將來(lái)，茶類資源會(huì)得到更為充分的利用，而增強(qiáng)其核心競(jìng)爭(zhēng)力便要對(duì)其進(jìn)行改良和創(chuàng)新。

隨著年齡的增長(zhǎng)，大多數(shù)人免疫力的下降是不可避免的，部分人群也會(huì)因?yàn)楣ぷ?，生活?jié)奏等原因?qū)е旅庖吡ο陆礫17-18]。而免疫能力的下降對(duì)機(jī)體免疫外界病原微生物有著巨大影響?；羯绞c祁門紅茶都具有調(diào)節(jié)免疫的功效，同時(shí)廣大人民對(duì)紅茶的接受程度性較高，因此開(kāi)發(fā)一款具有免疫調(diào)節(jié)功能，同時(shí)能為廣大消費(fèi)者接受的飲品不僅是對(duì)茶類資源的充分利用，對(duì)霍山石斛的資源開(kāi)發(fā)也有著重要意義。本研究主要是通過(guò)對(duì)祁門紅茶和霍山石斛有效成分的提取條件優(yōu)化，再以細(xì)胞免疫活性為指標(biāo)制備出增強(qiáng)免疫能力的茶飲，同時(shí)進(jìn)一步探索其體外免疫活性，為后續(xù)的霍山石斛資源的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

霍山石斛干莖（生產(chǎn)批號(hào)：20220622133612）中國(guó)中藥霍山石斛科技有限公司；祁門紅茶（生產(chǎn)批號(hào)：SC11434102405025）祁門縣祁雅茶業(yè)有限公司；苯酚（生產(chǎn)批號(hào)：200705）西隴科學(xué)股份有限公司；RAW264.7 細(xì)胞T25（批號(hào)：CL-0190）武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）培養(yǎng)基（生產(chǎn)批號(hào)：8121701）南京錦在生物科技有限公司；PBS（磷酸緩沖鹽溶液）（生產(chǎn)批號(hào)：8122056）賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；胎牛血清 武漢普諾賽生命科技有限公司；CCK-8（Cell Counting Kit-8）試劑 亞科因生物技術(shù)有限公司；冰醋酸（生產(chǎn)批號(hào)：20181101）天津市大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇（生產(chǎn)批號(hào)：E809056）、環(huán)磷酰胺（生產(chǎn)批號(hào)：Art.No.C849559-500 mg）上海麥克林生化科技有限公司；中性紅染劑 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；清潔級(jí)KM 小鼠（許可證號(hào)：SCXK（豫）2020-0005）（生產(chǎn)批號(hào)：No.410000000000002551）河南斯克貝斯生物科技股份有限公司；小鼠IL-2、IL-6、TNF-αELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：YXL-20176、YNL-20188、YXL-20852）四川成都源諾天成科技有限公司；4%多聚甲醛（生產(chǎn)批號(hào)：22105339）合肥蘭杰柯科技有限公司。

UPT-II-10 純水機(jī) 上海杲森儀器設(shè)備有限公司；H1-16K 離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司；Synergy H1 多功能酶標(biāo)儀 合肥遠(yuǎn)明科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 祁門紅茶與霍山石斛煎煮工藝 稱取一定量的祁門紅茶與霍山石斛，分別按照不同料液比加入超純水，經(jīng)過(guò)不同煎煮時(shí)間和次數(shù)進(jìn)行提取，分別得到霍山石斛與祁門紅茶提取液。

1.2.1.1 單因素提取實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取祁門紅茶1.0 g，放入圓底燒瓶中，用冷凝回流法煎煮提取，以煎煮后提取液的茶多酚得率為指標(biāo)，以福林酚法[19]測(cè)定提取液中的多酚含量，考察不同料液比（g/mL）（1:15、1:30、1:45、1:60、1:80）、提取時(shí)間（5、15、25、35、45 min）、提取次數(shù)（1、2、3、4、5）對(duì)祁門紅茶煎煮效果的影響。在固定提取時(shí)間為25 min、提取次數(shù)為3 次的條件下，考察料液比（g/mL）（1:15、1:30、1:45、1:60、1:80）對(duì)祁門紅茶提取效果的影響；在固定料液比為1:80（g/mL）、提取次數(shù)為3 次的條件下，考察提取時(shí)間（5、15、25、35、45 min）對(duì)祁門紅茶提取效果的影響；在固定料液比為1:80（g/mL）、提取時(shí)間為45 min 的條件下，考察提取次數(shù)（1、2、3、4、5）對(duì)祁門紅茶提取效果的影響。

準(zhǔn)確稱取霍山石斛粉末1.0 g，放入圓底燒瓶中，用冷凝回流法煎煮提取，以石斛多糖得率為指標(biāo)，以硫酸苯酚法[20]測(cè)定提取液中的多糖含量，考察不同料液比（g/mL）（1:20、1:40、1:60、1:80、1:100）、提取時(shí)間（20、40、60、80、100 min）、提取次數(shù)（1、2、3、4、5）對(duì)霍山石斛提取效果的影響。在固定提取時(shí)間為60 min、提取次數(shù)為3 次的條件下，考察料液比（g/mL）（1:20、1:40、1:60、1:80、1:100）對(duì)霍山石斛提取效果的影響；在固定料液比為1:100（g/mL）、提取次數(shù)為3 次的條件下，考察提取時(shí)間（20、40、60、80、100 min）對(duì)祁門紅茶提取效果的影響；在固定料液比為1:100（g/mL）、提取時(shí)間為60 min 的條件下，考察提取次數(shù)（1、2、3、4、5）對(duì)祁門紅茶提取效果的影響。

1.2.1.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別對(duì)祁門紅茶和霍山石斛的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，因素水平如表1、表2 所示。

表1 祁門紅茶提取工藝正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment for Keemum black tea extraction process

表2 霍山石斛提取工藝正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of the orthogonal experiment for Dendrobium huoshanensis extraction process

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 采用福林酚法和硫酸苯酚法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和作為后續(xù)測(cè)試提取液中指標(biāo)成分的檢測(cè)方法。

茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線：以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)（X），反應(yīng)液吸光度為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為：Y=0.0052X+0.0137（R2=0.9984）。

多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)（X），反應(yīng)液吸光度為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為：Y=8.4223X-0.0058（R2=0.9990）。

1.2.1.4 得率的計(jì)算

注：C1為石斛多糖濃度（g/mL），V1為石斛水提物總體積（mL），M1為霍山石斛質(zhì)量（g）；C2為祁門紅茶多酚濃度（g/mL），V2為祁門紅茶水提物總體積（mL），M2為祁門紅茶質(zhì)量（g）。

1.2.2 茶與石斛提取液混合液對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響 根據(jù)文獻(xiàn)[21]方法，將霍山石斛提取液和祁門紅茶提取液按照不同比例混合，再將其稀釋成不同的濃度梯度后過(guò)0.22 μm 微孔濾膜除菌。將購(gòu)買的RAW264.7 細(xì)胞在添加了10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37 ℃，5% CO2的潮濕環(huán)境。培養(yǎng)一段時(shí)間后，將1×105的RAW 264.7 細(xì)胞接種在96 孔板中，每組平行6 孔，并培養(yǎng)24 h 以供其貼壁生長(zhǎng)。用不同配比（100%石斛，100%祁門紅茶，75%的祁門紅茶加25%霍山石斛，50%祁門紅茶加50%霍山石斛，25%祁門紅茶加75%霍山石斛）和不同濃度（0、2.5、5、10、20、40、50、100 μg/mL）的茶與石斛提取混合液（KTDH）處理細(xì)胞24 h，每孔加入10 μL CCK-8 試劑后，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育RAW 264.7 細(xì)胞4 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值。

1.2.3 茶與石斛提取液混合液對(duì)細(xì)胞吞噬活力的影響 RAW264.7 細(xì)胞接種于96 孔板中，每組平行6 孔，使每孔細(xì)胞為1×105。培養(yǎng)24 h 后，棄去上清液。用10 μL 不同配比（100%石斛，100%祁門紅茶，75%的祁門紅茶加25%霍山石斛，50%祁門紅茶加50%霍山石斛，25%祁門紅茶加75%霍山石斛）和不同濃度（2.5、5、10、20、40、50、100 μg/mL）的茶與石斛提取混合液（KTDH）和10 μL 的10 μg/mL LPS 預(yù)處理RAW264.7 細(xì)胞24 h，然后加入100 μL的5%中性紅溶液，將RAW264.7 細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上清液，用pH7.4 的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2 次。最后加入200 μL 細(xì)胞裂解緩沖液（乙醇:1%冰醋酸=1:1），室溫孵育30 min，使用酶標(biāo)儀在540 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值。根據(jù)不同配比對(duì)免疫細(xì)胞的影響篩選出最佳配方以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.4 茶與石斛提取液混合液對(duì)環(huán)磷酰胺造成的免疫抑制的預(yù)防作用

1.2.4.1 動(dòng)物分組與處理 KM 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后用于實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)之前和在實(shí)驗(yàn)期間，將小鼠飼養(yǎng)在溫度（25±2）℃和12 h 明暗循環(huán)的受控環(huán)境條件下，并且充足飼料和水源的條件下自由進(jìn)食。將小鼠隨機(jī)分為5 組（n=10）：正常對(duì)照組（NC）、Cy（環(huán)磷酰胺）模型組（MC）、Cy+低劑量組（KTDH（100））、Cy+中劑量組（KTDH（200））、Cy+高劑量組（KTDH（400））。第1～10 d 給NC 組和MC 組灌胃生理鹽水，給KTDH（400）組，KTDH（200）組和KTDH（100）組分別以400、200、100 mg/kg 劑量的KTDH灌胃小鼠；從第8～10 d，除NC 組外，其余各組小鼠腹腔注射80 mg/kg Cy，NC 組注射等量生理鹽水，每天一次，連續(xù)3 d。末次給藥后24 h 禁食禁水，稱量體重，取血，取脾臟，脫脊椎處死小鼠。

1.2.4.2 指標(biāo)測(cè)定及病理形態(tài)觀察 摘眼球取血后，靜置1 h，離心（6000×g，3 min，4 ℃）獲得血清。按照試劑盒說(shuō)明通過(guò)試劑盒檢測(cè)血清中IL-2、IL-6、TNF-α水平。

將脾臟切片依次置于二甲苯I 中20 min，二甲苯II 中20 min，無(wú)水乙醇I 中5 min，無(wú)水乙醇II 中5 min，75%乙醇中5 min，最后用自來(lái)水沖洗。切片浸蘇木精染色液3～5 min 后，用自來(lái)水沖洗，用分化液分化，再用自來(lái)水沖洗，反藍(lán)液反藍(lán)，最后用流水沖洗。切片在85%、95%梯度酒精中脫水5 min，在伊紅染色液中染色5 min。切片先后置于無(wú)水乙醇I 中5 min、無(wú)水乙醇II 中5 min、無(wú)水乙醇III 中5 min、二甲苯I 中5 min、二甲苯II 中5 min，最后用中性膠密封。顯微鏡檢查后采集圖像并進(jìn)行分析。

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)皆經(jīng)過(guò)皖西學(xué)院科學(xué)研究倫理審查委員會(huì)的許可，批準(zhǔn)編號(hào)為202207001。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS.26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 2019b 作圖，所有檢測(cè)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，采用單因素方差分析（ANOVA）比較各組間的均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 祁門紅茶提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

料液比對(duì)祁門紅茶的提取效果的影響如圖1 中所示，茶多酚得率在料液比小于等于1:80（g/mL）時(shí)隨著料液比的升高而逐漸升高且后續(xù)增多的量逐漸減少，其主要原因應(yīng)該是由于溶劑的增多導(dǎo)致多酚溶出率的增加。得率在料液比1:80（g/mL）時(shí)達(dá)到最高值，多酚得率為（8.16±0.37）%?？紤]到濃度過(guò)低會(huì)影響后續(xù)產(chǎn)品保健效果，因此選取1:80（g/mL）的料液比進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)祁門紅茶多酚得率的影響（n=3）Fig.1 Effects of solid-liquid ratio,extraction time and extraction times on the yield of polyphenols from Keemun black tea (n=3)

提取時(shí)間對(duì)祁門紅茶的提取效果如圖1 中所示，茶多酚得率在45 min 時(shí)提取效果最佳，多酚得率為（8.25±0.49）%?？赡苁且?yàn)樘崛r(shí)間較長(zhǎng)，茶葉完全舒展之后接觸面積增大導(dǎo)致多酚溶出率增加?？紤]到后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)的因素，提取時(shí)間更長(zhǎng)對(duì)多酚含量的影響已經(jīng)很小，因此綜合時(shí)間成本考慮選取45 min 的提取時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

提取次數(shù)對(duì)祁門紅茶的提取效果影響如圖1 所示，在提取次數(shù)達(dá)到3 次時(shí)，其提取效果較好，多酚得率為（8.13±0.05）%，后續(xù)繼續(xù)增加提取次數(shù)對(duì)多酚得率的影響并不大，綜合考慮性價(jià)比和提取效率等因素，將提取次數(shù)定為3 次。

2.2 霍山石斛提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

料液比對(duì)霍山石斛多糖得率的影響如圖2 中所示，其多糖得率隨著料液比的增加逐漸增加，在料液比1:100（g/mL）時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)的多糖得率為（63.83±8.34）%?？紤]到后續(xù)濃度較低會(huì)對(duì)產(chǎn)品的保健效果有影響，因此選取料液比1:100（g/mL）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)霍山石斛多糖得率的影響（n=3）Fig.2 Effects of solid-liquid ratio,extraction time and extraction times on polysaccharide yield of Dendrobium huoshanensis (n=3)

提取時(shí)間對(duì)霍山石斛多糖得率的影響如圖2所示，多糖得率在60 min 時(shí)達(dá)到最大值，其主要原因應(yīng)是提取液中多糖含量過(guò)高時(shí)，提取時(shí)間過(guò)久反而導(dǎo)致溶液過(guò)于粘稠，導(dǎo)致石斛粉末成團(tuán)，接觸面積下降，導(dǎo)致溶出率下降。因此最后多糖得率為（68.11±1.01）%。因此選取最佳提取時(shí)間為60 min 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

提取次數(shù)對(duì)霍山石斛多糖得率的影響如圖2 所示，多糖得率在提取次數(shù)為3 次時(shí)最高，為（53.57±2.40）%。主要原因可能是在多次提取中石斛粉末多次反復(fù)接觸溶劑導(dǎo)致提取率升高。且后續(xù)增加提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響并不大，因此選取最佳提取次數(shù)3 次進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

祁門紅茶的正交試驗(yàn)結(jié)果由表3 所示，根據(jù)極差分析，對(duì)祁門紅茶的提取因素影響程度大小順序?yàn)镃>A>B，也就是提取次數(shù)>料液比>提取時(shí)間。因此可以確定在實(shí)際操作中提取次數(shù)對(duì)祁門紅茶提取效果影響最大，提取時(shí)間影響最小。由表3 可知其組別中得率最高的提取條件為A3B1C3，而根據(jù)各條件K 值推斷得出的最佳提取條件則是A3B3C3，對(duì)兩種方法進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩種提取條件無(wú)顯著性差異，為了節(jié)約時(shí)間成本，因此最終選用A3B1C3作為最后的提取條件。將該條件經(jīng)過(guò)3 次重復(fù)性驗(yàn)證，確定其方法具有穩(wěn)定性和較好的提取效果。

表3 祁門紅茶正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test of Keemun black tea

霍山石斛的正交試驗(yàn)結(jié)果如表4 所示，根據(jù)極差分析，影響霍山石斛多糖得率的各提取因素的主次順序?yàn)锳>C>B，也就是料液比>提取次數(shù)>提取時(shí)間。說(shuō)明在提取過(guò)程中料液比對(duì)霍山石斛多糖得率的影響最大，提取時(shí)間影響最小。由表4 可知，最佳提取條件為A2B3C2。將該條件經(jīng)過(guò)3 次重復(fù)性驗(yàn)證，確定其方法具有穩(wěn)定性和較好的提取效果。

表4 霍山石斛正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test of Dendrobium huoshanensis

2.4 提取混合液對(duì)免疫細(xì)胞增殖活力與吞噬活力的影響

以不同濃度的KTDH（0、2.5、5、10、20、40、50、100 μg/mL）孵育RAW264.7 細(xì)胞24 h，觀察KTDH對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的毒性作用。從圖3 可以看出，KTDH（100%霍山石斛）對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有明顯增強(qiáng)甚至略有降低，該結(jié)果可能是由于霍山石斛多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，而其他成分對(duì)細(xì)胞有微弱毒性，細(xì)胞吞噬過(guò)程中二者皆有攝入，因此導(dǎo)致本組的免疫細(xì)胞活力增強(qiáng)不明顯甚至降低。KTDH（100%祁門紅茶）對(duì)細(xì)胞的抑制作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)可能是由于祁門紅茶中的細(xì)胞毒性成分含量較高。KTDH（75%霍山石斛加25% 祁門紅茶）對(duì)細(xì)胞的抑制趨勢(shì)與KTDH（100%霍山石斛）相似，皆呈現(xiàn)抑制效果，但KTDH（75%霍山石斛加25% 祁門紅茶）抑制作用更強(qiáng)，原因可能是由于加入了祁門紅茶配比的提取液整體中具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)增多。KTDH（50%霍山石斛加50%祁門紅茶）和KTDH（25%霍山石斛加75%祁門紅茶）在一定濃度范圍內(nèi)顯著增強(qiáng)細(xì)胞活力（P<0.05），且增強(qiáng)幅度相似的原因有可能是因?yàn)榛羯绞亩嗵浅煞趾推铋T紅茶的多酚成分發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)作用[6,10]。

圖3 不同濃度和比例的混合溶液對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響（n=6）Fig.3 Effects of different concentrations and ratios of mixed solution on cell proliferation activity (n=6)

以不同濃度的KTDH（2.5、5、10、20、40、50和100 μg/mL）和LPS（10 μg/mL）孵育細(xì)胞24 h，用中性紅染色法檢測(cè)細(xì)胞的吞噬活性。從圖4 中可以看出，除KTDH（100%霍山石斛）和KTDH（25%霍山石斛加75%祁門紅茶）外，其他處理對(duì)細(xì)胞吞噬活性的增強(qiáng)效果都不如LPS，KTDH（25%霍山石斛加75%祁門紅茶）的免疫增強(qiáng)效果強(qiáng)于KTDH（100%霍山石斛）。綜合考慮，選擇KTDH（25%霍山石斛加75%祁門紅茶）作為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的給藥配方。

圖4 不同濃度和比例的混合溶液對(duì)細(xì)胞吞噬活性的影響（n=6）Fig.4 Effects of different concentrations and ratios of mixed solution on cell phagocytic activity (n=6)

2.5 茶與石斛提取液混合液對(duì)環(huán)磷酰胺造成的免疫抑制的預(yù)防作用

通過(guò)建立環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的動(dòng)物模型，探討KTDH對(duì)血液生化指標(biāo)的影響；采用相關(guān)試劑盒檢測(cè)血清IL-2、IL-6 和TNF-α水平。不同組小鼠IL-2 和IL-6的含量如圖5a 和圖5b 所示，與NC 組相比，MC 組IL-2 和IL-6 水平顯著降低（P<0.05）。同時(shí)，圖5a 顯示各濃度KTDH 對(duì)IL-2 水平的恢復(fù)均有積極作用（P<0.01），圖5b 顯示KTDH（400）對(duì)IL-6 水平的恢復(fù)有積極作用（P<0.01）。從圖5c 可以看出，與NC 組相比，MC 組的TNF-α水平明顯升高（P<0.01）。KDTH（400）對(duì)TNF-α水平的恢復(fù)起正向作用（P<0.01），而KDTH（100）對(duì)TNF-α水平的恢復(fù)起負(fù)向作用（P<0.05）。

圖5 不同濃度KTDH 對(duì)血清細(xì)胞因子水平的影響（n=10）Fig.5 Effect of different concentrations of KTDH on serum cytokine levels (n=10)

如圖6 所示，NC 組和KDTH（400）組細(xì)胞形態(tài)相似。脾髓、脾體形態(tài)結(jié)構(gòu)規(guī)整有序。脾臟內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量多，排列緊密。脾紅髓形態(tài)正常，無(wú)異常充血。MC 組脾體結(jié)構(gòu)疏松，淋巴細(xì)胞數(shù)量較少。而且，脾的紅髓淤血也很嚴(yán)重。與MC 組比較，KTDH組（100、200、400 mg/kg）脾小體數(shù)量和面積增加，紅髓充血程度也不同程度減輕。因此，環(huán)磷酰胺可能部分通過(guò)減少脾小體發(fā)揮免疫抑制作用，而KTDH 可能通過(guò)保護(hù)脾小體，恢復(fù)淋巴細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)免疫功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，祁門紅茶與霍山石斛的提取物混合液對(duì)于環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫力低下有明顯預(yù)防作用。

圖6 不同濃度KTDH 對(duì)脾臟的影響Fig.6 Effects of different concentrations of KTDH on the spleen

3 結(jié)論與討論

環(huán)磷酰胺是臨床上常用的用于腫瘤治療和血液及骨髓移植的藥物，具有良好的免疫抑制效果[22]。因此，通過(guò)注射環(huán)磷酰胺在小鼠中誘導(dǎo)免疫抑制是一種被廣泛接受的免疫抑制模型。白細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，血清中IL-2、IL-6 和TNF-α的水平變化是反映免疫活動(dòng)的重要指標(biāo)[23-24]。細(xì)胞因子作為機(jī)體免疫應(yīng)答系統(tǒng)中的重要因素，不僅可以單獨(dú)起效，還可以與其他細(xì)胞因子相互誘生，相互影響而在免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[25]。因此IL-2、IL-6 和TNF-α水平變化在一定程度上會(huì)影響到免疫反應(yīng)的進(jìn)程。有報(bào)道表明，霍山石斛多糖可通過(guò)激活p38、ERK、JNK 和核NF-κB 易位，顯著刺激RAW 264.7 巨噬細(xì)胞分泌NO、TNFα、IL-6 和IL-10，具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性[26]。而關(guān)于茶多酚的研究表明其對(duì)白細(xì)胞介素的表達(dá)具有一定的抑制作用[27]。因此推測(cè)霍山石斛與祁門紅茶之間的配伍可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，不僅可以預(yù)防免疫系統(tǒng)被抑制，還可以在免疫系統(tǒng)活動(dòng)過(guò)強(qiáng)時(shí)抑制其炎癥相關(guān)因子的分泌，機(jī)制可能是與IL-2、IL-6 和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)通路相關(guān)。

本研究通過(guò)KTDH 連續(xù)灌胃10 d，隨后腹腔注射環(huán)磷酰胺的方法，研究了KTDH 對(duì)免疫抑制的預(yù)防作用。結(jié)果表明，模型組IL-6、IL-2 水平顯著性降低（P<0.05），這與之前的研究一致。經(jīng)KTDH 治療后，小鼠血清中細(xì)胞因子IL-6、IL-2 水平較模型組有明顯升高，證明KTDH 可能是通過(guò)提高IL-6、IL-2 血清水平改善免疫功能。有研究表明，環(huán)磷酰胺可引起炎癥反應(yīng)[28]。從血清TNF-α水平的變化來(lái)看，環(huán)磷酰胺明顯引起炎癥反應(yīng)，從而使血清TNF-α水平顯著升高（P<0.01）。經(jīng)KTDH 處理后，高劑量組TNF-α水平明顯受到抑制（P<0.01）。表明高劑量KTDH 可抑制環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，祁門紅茶與霍山石斛的提取物混合液對(duì)于環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫力低下有明顯預(yù)防效果，可以作為日常生活中的免疫調(diào)節(jié)劑以及在臨床上對(duì)病患的免疫預(yù)防起到一定作用。本研究為探究中草藥與一些常規(guī)飲品的配伍奠定基礎(chǔ)以及開(kāi)發(fā)方向。同時(shí)，此研究對(duì)于霍山石斛資源和紅茶的資源開(kāi)發(fā)具有重要意義，對(duì)未來(lái)的本草產(chǎn)品和茶產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用也具有指示意義。最后，本研究為霍山石斛茶飲作為一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，并為未來(lái)發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)具有醫(yī)療價(jià)值的本草產(chǎn)品提供了豐富的理論支持和數(shù)據(jù)支持。