Box-Behnken 設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化桔梗醇提工藝及醇提物美白活性分析

蔡鐵全，龐會娜，黃意情，萬志強(qiáng),，嚴(yán)銘銘,3,

（1.國家市場監(jiān)督管理總局食品審評中心，北京 100070；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)東北亞中醫(yī)藥研究院，吉林長春 130117；3.吉林省中藥保健食品科技創(chuàng)新中心，吉林長春 130117）

桔梗為桔?？浦参锝酃＃≒latycodon gradiflorum（Jacq.）A.DC.）的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為下品[1-2]，具有利咽，宣肺[3-4]，祛痰[5]，排膿等功效，為我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食兼用中藥材之一[6]?，F(xiàn)代研究表明，桔梗的化學(xué)成分主要包括皂苷類[7]、黃酮類[8]、脂肪油、脂肪酸[9]、無機(jī)元素[10]等成分，具有抗氧化[11]、降血糖[12]、抗腫瘤[13]等生物活性。經(jīng)查閱文獻(xiàn)可知，近年來桔梗研究主要集中在抗腫瘤、心血管保護(hù)及提高人體免疫力方面[14]，而在桔梗美白活性方面的研究上，除本課題組前期研究外并未見其相應(yīng)的研究。

人體的皮膚顏色除了受遺傳因素的影響外，還會受到外界因素的影響，如紫外線、光照時間、海拔等，而這些因素就是造成膚色差異的原因。自古以來，中國女性就有對美的追求，所以對色素沉著、雀斑等皮膚問題也越來越重視，從而使美白成為人們生活中不可或缺的一部分[15]。傳統(tǒng)的美白劑（氫醌、鉛粉等）細(xì)胞毒性大，副作用較強(qiáng)，已經(jīng)無法滿足現(xiàn)代人追求美白所要求的安全、滋潤、溫和等條件，同時“致癌”事件屢發(fā)也讓人們對美白產(chǎn)品安全性的擔(dān)憂日益增加。隨著美白保健品的研究與開發(fā)，發(fā)現(xiàn)從植物中提取的活性成分更具有安全、高效的特性，其作為美白保健產(chǎn)品的有效組分深入人心。如今，研發(fā)更多天然植物原料已是美白保健品領(lǐng)域研究的熱點之一[16-17]。

我國作為桔梗生產(chǎn)大國，在桔梗美白保健品的研發(fā)方面具有很大上升空間，因此，從桔梗中尋找和提取功能性物質(zhì)對桔梗美白保健品的研究與開發(fā)具有重要意義。因此，本實驗以酶抑制活性和抗氧化為考察指標(biāo)，優(yōu)化桔梗醇提工藝，探究桔梗醇提物體外美白功效，為其進(jìn)一步研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桔梗藥材（批號：C359180401b）吉林省仙草醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院姜大成教授鑒定為桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.的干燥根；B16F10 小鼠黑色素瘤細(xì)胞 中國上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；桔梗皂苷D 標(biāo)準(zhǔn)品（批號：24588-201708）、熊果苷對照品（批號：21402-201823）、桔梗對照藥材（批號：121028-201612）中國食品藥品檢定研究院；氫氧化鈉、DPPH、ABTS+、過二硫酸鉀、乙酰丙酮、埃爾利希國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酪氨酸酶（≥500 U/mg）、L-酪氨酸、透明質(zhì)酸酶（400～1000 U/mg）、透明質(zhì)酸鈉 北京索萊寶科技有限公司。

ALB-224 萬分之一分析天平、AB265-S 十萬分之一分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-250 超聲波清洗器 昆山市儀器有限公司；HX-400A高速中藥粉碎機(jī) 浙江省永康市溪岸五金藥具廠；LC-2010AHT 高效液相色譜儀 日本島津公司；ELSD 6000 蒸發(fā)光散射檢測器 Alltech CHROM Thermo；DZTW 電子調(diào)溫電熱套 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2.1 桔梗醇提物的制備 將桔梗藥材進(jìn)行粉碎，過65 目，稱取適量藥粉，加8 倍量的95%乙醇，加熱回流提取3 次，每次1.5 h，濾過，合并濾液，濃縮至浸膏，80 ℃干燥，粉碎，過80 目，即得桔梗醇提物（PGE-ME5）[18]。

1.2 實驗方法

1.2.2 指標(biāo)的測定

1.2.2.1 桔?？傇碥仗崛÷实臏y定 參考但漢龍等[19]的方法，稍作修改，分別吸取0.5 mg/mL 的桔梗皂苷D 對照品0、0.2、0.4、0.6、1.2、1.4 mL，揮干后，首先加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，然后加入0.8 mL 的高氯酸，混勻之后于水浴中以60 ℃的溫度加熱15 min，放冷后加入冰醋酸5 mL 震蕩混勻后，于550 nm 處測定其吸光度值并記錄。將桔梗皂苷D 取樣量的質(zhì)量和吸光度值分別作為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0016X+0.0148，R2=0.9992。精密配制1.0 mg/mL 的桔梗醇提物，按照上述方法進(jìn)行測定，桔?？傇碥仗崛÷实挠嬎愎饺缦拢?/p>

式中：Y 為樣品的吸光度值；m 為所測樣品對應(yīng)藥材的質(zhì)量，mg。

1.2.2.2 桔梗皂苷D 提取率的測定 桔梗皂苷D 提取方法按2015 年版《中國藥典》項下方法提取，測定前過0.45 μm 有機(jī)濾膜，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）法對其進(jìn)行測定，選用反向C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm），選用乙腈和水作為流動相，以1.0 mL/min 流速進(jìn)行等度洗脫，流動相乙腈:水的比例為25:75，蒸發(fā)光散色檢測器的溫度是103.8 ℃，氣體流量為2.8 L/min。對照品溶液進(jìn)樣量為5、10 μL，供試品溶液進(jìn)樣量為15 μL，采用外標(biāo)兩點法對數(shù)方程進(jìn)行計算[18]，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=2.8978X+13.362，R2=0.9994，桔梗皂苷D 的提取率計算公式如下：

式中：Y 為樣品的吸光度值，m 為所測樣品對應(yīng)藥材的質(zhì)量，mg。

1.2.2.3 熊果苷提取率的測定 精密稱取0.5 g 桔梗醇提物于具塞錐形瓶中，加甲醇提取溶劑10 mL，稱重，超聲30 min 進(jìn)行提取，放至室溫后補(bǔ)足失重，含量測定前過0.45 μm 有機(jī)濾膜，選用反向C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm），采用HPLC-ELSD 法測定熊果苷單體，以乙腈和0.1%甲酸水作為流動相（乙腈:0.1%甲酸水=5:95），以0.8 mL/min 的流速等度洗脫，蒸發(fā)光散色檢測器的溫度為105 ℃，氣體流量是2.8 L/min。對照品溶液進(jìn)樣量為5、10 μL，供試品溶液進(jìn)樣量為15 μL，采用外標(biāo)兩點法對數(shù)方程計算[18]，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=4.3033X+12.762，R2=0.9996，熊果苷的提取率計算公式如下：

式中：Y 為樣品的吸光度值，m 為所測樣品對應(yīng)藥材的質(zhì)量，mg。

1.2.3 單因素實驗 溶媒量8 倍，提取時間1 h，提取次數(shù)3 次作為固定的反應(yīng)條件，選擇提取時間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）、提取次數(shù)（1、2、3、4 次）、溶媒量（6、7、8、9、10 倍）進(jìn)行單因素實驗，平行3 次，考察其對桔梗總皂苷、桔梗皂苷D、熊果苷的提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面設(shè)計試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以提取次數(shù)（A）、提取時間（B）、溶媒量（C）為影響因素，以桔?？傇碥?、桔梗皂苷D、熊果苷的提取率為綜合評分（綜合評分=（30%×桔梗皂苷D 提取率/桔梗皂苷D 提取率最大值+30%×熊果苷提取率/熊果苷提取率最大值+40%×桔?？傇碥仗崛÷?桔?？傇碥仗崛÷首畲笾担?00）作為評價指標(biāo)（Y），用Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計[20-23]，因素水平見表1。

1.2.5 桔梗醇提物美白活性研究

1.2.5.1 酪氨酸酶活性抑制實驗 根據(jù)文獻(xiàn)修改如下[24]，用磷酸緩沖溶液將待測樣品和熊果苷配制成質(zhì)量濃度為3.125、6.25、12.5、18.75、25 mg/mL 的溶液備用，在96 孔板中設(shè)置240 μL 總反應(yīng)體系（見表2），按照表2 數(shù)據(jù)將試劑依次加入，震蕩混勻后，37 ℃水浴中反應(yīng)20 min 后，于475 nm 下測定吸光度，酪氨酸酶抑制率計算公式如下：

表2 酪氨酸酶催化反應(yīng)體系（μL）Table 2 Tyrosinase catalytic reaction system (μL)

酪氨酸酶抑制率(%)=[(A-B)/(C-D)]/(A-B)×100

式中：A：等量緩沖液代替樣品溶液的吸光度；B：等量緩沖液代替樣品溶液和酪氨酸酶溶液的吸光度；C：樣品溶液吸光度；D：等量緩沖液代替酪氨酸酶溶液的吸光度。

1.2.5.2 透明質(zhì)酸酶活性抑制實驗 采用Elson-Morgan 法進(jìn)行透明質(zhì)酸酶體外抑制實驗，用pH5.6 的醋酸緩沖溶液配置透明質(zhì)酸鈉（0.5 mg/mL）、透明質(zhì)酸酶（600 U/mL）及待測樣品（3.125、6.25、12.5、18.75、25 mg/mL）溶液待用，將0.2 mL CaCl2溶液與0.5 mL的透明質(zhì)酸酶溶液混勻后于37 ℃下孵育20 min，然后加入待測樣品溶液0.5 mL，37 ℃下孵育20 min，加入0.5 mL 的透明質(zhì)酸鈉溶液37 ℃孵育30 min，取出后加入0.1 mL 的NaOH，冰水浴中冷卻8 min，加入0.1 mL 的埃爾利希，常溫下放置20 min 后，于555 nm 下測定吸光度[18]。透明質(zhì)酸酶抑制率計算公式如下：

透明質(zhì)酸酶抑制率(%)=[(A-B)/(C-D)]/(A-B)×100

式中：A：醋酸緩沖液代替樣品的吸光度；B：醋酸緩沖液代替樣品和透明質(zhì)酸酶的吸光度；C：樣品吸光度；D：醋酸緩沖液代替透明質(zhì)酸酶的吸光度。

1.2.5.3 細(xì)胞黑色素生成抑制活性 將B16F10 黑色素瘤細(xì)胞接種到24 孔的培養(yǎng)板中，每個孔的細(xì)胞個數(shù)為1×104個，細(xì)胞貼壁后，加入α-黑素細(xì)胞刺激激素（100 nmol/Lα-MSH）繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后加入不同濃度（100、150、200 μg/mL）的PGE-ME5 提取物和熊果苷，分別培養(yǎng)24、48、72 h，每組5 個復(fù)孔，給藥時間結(jié)束后，去除培養(yǎng)基，用PBS（pH7.2）洗滌細(xì)胞兩次，加入200 μL 含有1% tritonx-100 的PBS，通過冷凍和解凍使細(xì)胞破裂。以12000 r/min 離心30 min 后去除上清液，在細(xì)胞顆粒中加入300 μL 含10%二甲基亞砜的1 mol/L NaOH，在80 ℃下反應(yīng)2 h 以溶解細(xì)胞的黑色素[25]，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測量溶解的黑色素的吸光度值。

黑色素抑制率(%)=(給藥組A450-空白組A450)/(對照組A450-空白組A450)×100

1.2.6 桔梗醇提物體外抗氧化活性研究

1.2.6.1 DPPH 自由基清除能力測定 根據(jù)文獻(xiàn)[26]修改如下：將配制好的桔梗醇提物溶液2 mL 加入到2 mL 0.004% 的DPPH 溶液中，渦旋，避光反應(yīng)30 min 后，于517 nm 下測定吸光度值A(chǔ)1；以等量乙醇溶液代替DPPH 溶液，得吸光度值A(chǔ)2；以等量蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照，得吸光度值A(chǔ)0。以VC作為陽性對照。按下列公式計算：

DPPH 自由基清除率(%)=(A0-A1+A2)/A0×100

1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力測定 根據(jù)文獻(xiàn)[27]修改如下：使用pH7.4 PBS 緩沖溶液對ABTS+工作液進(jìn)行稀釋，使其在734 nm 處的吸光度值范圍在0.5～0.9 之間即可；取10 μL 桔梗醇提物樣品溶液與0.2 mL ABTS+工作液進(jìn)行混合，室溫下避光反應(yīng)6 min，于734 nm 波長測定吸光度，以VC為陽性對照，按下列公式計算：

ABTS+自由基清除率(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式中：A1：樣品+ABTS+測得的吸光度值；A0：PBS+ABTS+測得的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3 次，采用Origin 2019 和Design-Expert V8.0.6 進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)分析及圖像繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取次數(shù)對桔梗醇提物桔梗皂苷D、熊果苷、桔梗總皂苷提取率的影響 結(jié)果如圖1 所示，桔梗美白活性提取物中桔梗皂苷D、熊果苷、桔梗總皂苷的提取率的高低與提取次數(shù)有關(guān)，隨著提取次數(shù)的增加，各指標(biāo)性成分的提取率呈現(xiàn)先升高后趨于平緩的趨勢，當(dāng)提取次數(shù)小于3 時，各指標(biāo)性成分隨著提取次數(shù)的增加，其提取率顯著升高（P<0.01），當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到3 次時，桔梗總皂苷的提取率基本達(dá)到最高值。其原因可能是當(dāng)提取次數(shù)較低時，各指標(biāo)性成分并未完全溶出，因此當(dāng)提高提取次數(shù)時，目標(biāo)提取物的提取率則會相應(yīng)的提高，當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到一定值時，各指標(biāo)性成分的提取率會達(dá)到最高值，因此再增加提取次數(shù)時，各個指標(biāo)成分的提取率將增加不明顯?？紤]到當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到3 時，桔梗皂苷D 和熊果苷的提取率并未達(dá)到最高值，因此選擇2、3、4 次進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

圖1 提取次數(shù)對桔梗醇提物各指標(biāo)成分提取率的影響Fig.1 Effect of extraction times on extraction rate of each index component of Platycodon grandiflorum ethanol extract

2.1.2 提取時間對桔梗醇提物桔梗皂苷D、熊果苷、桔梗總皂苷提取率的影響 提取時間是影響各指標(biāo)性成分提取率的關(guān)鍵因素之一，充足的提取時間有利于各指標(biāo)性成分的溶出。結(jié)果如圖2 所示，桔梗醇提取物中，桔梗皂苷D 和熊果苷的提取率在測定時間內(nèi)（0.5～2.5 h）變化不顯著（P>0.05），當(dāng)提取時間在0.5～1.0 h 時，桔?？傇碥盏奶崛÷曙@著升高（P<0.01），而當(dāng)提取時間到達(dá)1.0～2.5 h 時，桔梗總皂苷的提取率基本保持不變，其原因可能是隨著時間的進(jìn)一步增加，溶解度達(dá)到飽和時，桔?？傇碥詹辉俦蝗芙?，提取率不再有明顯提高[28]。因此選擇0.5、1.0、1.5 h 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

圖2 提取時間對桔梗醇提物各指標(biāo)成分提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of each index component of Platycodon grandiflorum ethanol extract

2.1.3 溶媒量對桔梗醇提物桔梗皂苷D、熊果苷、桔?？傇碥仗崛÷实挠绊?溶媒量是影響細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的主要因素，適當(dāng)?shù)娜苊搅繉Ω髦笜?biāo)性成分的溶出是有利的，還可以節(jié)約提取溶液[29]。從圖3 中可以看出，當(dāng)溶媒量為6 倍時，桔?？傇碥盏奶崛÷拭黠@較低，而后隨著溶媒量的增加各指標(biāo)性成分的提取率有了一定的提高，其中當(dāng)溶媒量由6 提高到8 時，桔梗總皂苷的提取率顯著升高（P<0.01）。這是因為適當(dāng)增大溶媒量，能擴(kuò)大指標(biāo)性成分在桔梗內(nèi)外的濃度差，有利于指標(biāo)性成分的溶出，但溶媒量對于各指標(biāo)性成分溶出的增強(qiáng)效應(yīng)也是有一定的界限的，因此當(dāng)達(dá)到一定的溶媒量時，再繼續(xù)提高溶媒量也不會顯著地增加指標(biāo)性成分的提取率[30]。因此選擇7、8、9 倍進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

圖3 溶媒量對桔梗醇提物各指標(biāo)成分提取率的影響Fig.3 Effect of solvent amount on extraction rate of each index component of Platycodon grandiflorum ethanol extract

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立與數(shù)據(jù)分析 在單因素實驗基礎(chǔ)上，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以提取次數(shù)（A）、提取時間（B）、溶媒量（C）為影響因素，以桔?？傇碥铡⒔酃Ｔ碥誅、熊果苷提取率的綜合評分（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行3 因素3 水平共17 個試驗設(shè)計，結(jié)果如表3 所示，得到關(guān)于提取次數(shù)（A）、提取時間（B）和溶媒量（C）綜合評分的二元多項回歸方程：Y=9.68-0.08A-0.036B+0.32C-2.50E-0.3AB+0.023AC-0.015BC-0.95A2-0.44B2-0.27C2。

表3 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Box-Behnken response surface test design and results

對所得實驗數(shù)據(jù)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，本模型的F值為110.73，P<0.0001，模型顯著；失擬項F值為0.095，P值為0.9591>0.05，失擬不顯著；模型的調(diào)整決定系數(shù)R2adj值為0.9158，擬合度較高，表明本模型對綜合評分進(jìn)行的分析和預(yù)測是準(zhǔn)確有效的。由回歸模型和方差分析可知，方程一次項A、C 對綜合評分的影響達(dá)到顯著水平（P<0.05）；方程二次項A2、B2、C2對綜合評分的影響達(dá)到極顯著水平（P<0.01），而AB、AC、BC 之間的交互作用對綜合評分的影響并不顯著，根據(jù)F值可知，各因素對綜合評分影響的大小順序為：C（溶媒量）>A（提取次數(shù)）>B（提取時間）。

表4 二次回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis of quadratic regression model

2.2.2 驗證實驗 運用Design-Expert V8.0.6 軟件對模型進(jìn)行解析，得到了一組桔梗醇提物的最佳提取條件：提取次數(shù)2.96 次，提取時間0.97 h，溶媒量8.58 倍。根據(jù)工業(yè)化生產(chǎn)等實際情況進(jìn)行調(diào)整，最終確定的最佳工藝參數(shù)為：提取次數(shù)3 次，提取時間1 h，溶媒量8 倍。按照上述優(yōu)選提取工藝參數(shù)制備的提取物作為桔梗最佳美白活性提取物（PGEME5）。通過三次平行驗證實驗得，PGE-ME5 中桔梗皂苷D、熊果苷、桔?？傇碥盏奶崛÷剩c預(yù)測值相差不大，指標(biāo)性成分桔梗皂苷D、熊果苷、桔?？傇碥盏奶崛÷史謩e為0.122%±0.003%、0.128%±0.005%、0.582%±0.007%，表明工藝合理穩(wěn)定，可為后續(xù)相關(guān)規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

2.3 PGE-ME5 美白活性實驗結(jié)果

2.3.1 對酪氨酸酶及透明質(zhì)酸酶的抑制結(jié)果 熊果苷是常見的美白劑，它通過競爭性抑制人類酪氨酸酶活性而減少色素沉著，在研究中常用作陽性對照[31]，PGE-ME5 對酪氨酸酶及透明質(zhì)酸酶的抑制效果如圖4 所示，實驗結(jié)果表明，隨著PGE-ME5 的濃度升高，其對酪氨酸酶及透明質(zhì)酸酶的抑制率呈上升的趨勢，與陽性藥熊果苷相比，當(dāng)給藥濃度為18.75 mg/mL時，其抑制效果相當(dāng)，抑制率分別為92.39%、88.26%，其原因可能是PGE-ME5 中含有多種美白活性成分（熊果苷、桔梗總皂苷等），因此表現(xiàn)出良好的美白活性。

圖4 PGE-ME5 對酪氨酸酶及透明質(zhì)酸酶抑制率Fig.4 Inhibition rate of PGE-ME5 on tyrosinase and hyaluronidase

2.3.2 抑制細(xì)胞黑色素結(jié)果 與空白對照組比較，以100 nmol/Lα-MSH 刺激的B16F10 細(xì)胞（對照組）的黑色素含量明顯高于未刺激的細(xì)胞，表明造模成功；隨著PGE-ME5 提取物濃度的增加，使α-MSH 刺激的B16F10 細(xì)胞中黑色素含量呈劑量依賴性顯著減少。當(dāng)給藥時間為48 h 時，α-MSH 刺激的B16F10細(xì)胞中黑色素生成抑制效果最佳，結(jié)果見圖5。

圖5 PGE-ME5 對細(xì)胞黑色素的抑制率Fig.5 Inhibition rate of PGE-ME5 on cell melanin

2.4 PGE-ME5 體外抗氧化活性實驗結(jié)果

PGE-ME5 對DPPH·、ABTS+自由基清除效果如圖6 所示，實驗結(jié)果表明，隨著PGE-ME5 的濃度升高，其對DPPH·及ABTS+自由基的清除率呈上升的趨勢，與陽性藥VC相比，其抑制效果相當(dāng)，當(dāng)給藥濃度達(dá)到3.13 mg/mL 時，對DPPH 自由基的清除率達(dá)到最高值為97.19%，當(dāng)給藥濃度達(dá)到4.69 mg/mL時，對ABTS+自由基的清除率達(dá)到最高值為80.57%，該實驗結(jié)果表明PGE-ME5 具有良好的抗氧化活性。

圖6 PGE-ME5 對DPPH、ABTS+自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of PGE-ME5 to DPPH and ABTS+free radicals

3 結(jié)論

本研究利用響應(yīng)面法對桔梗醇提工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳提取工藝為：提取次數(shù)3 次，提取時間1 h，溶媒量8 倍，在此條件下提取得到的桔梗美白活性提取物（PGE-ME5）中桔梗皂苷D、熊果苷、桔梗總皂苷的提取率分別為0.122%±0.003%、0.128%±0.005%、0.582%±0.007%。美白功效評價結(jié)果顯示，PGE-ME5具有良好的美白活性，對酪氨酸酶和透明質(zhì)酸酶的抑制率分別為92.39%和88.26%，此時的給藥濃度為18.75 mg/mL，且對B16F10 細(xì)胞中黑色素的生成具有良好的抑制效果?？寡趸Y(jié)果表明，PGE-ME5 具有良好的抗氧化活性，對DPPH·、ABTS+自由基的清除率，分別為97.19%、80.57%。

皮膚的顏色主要是由黑色素決定的。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)源性刺激物作用時，就會激活酪氨酸酶，促進(jìn)黑色素的生成[32]。另外，活性氧（ROS）在黑色素生成過程中也起到十分重要的作用，ROS 在酪氨酸酶催化氧化過程中既是引發(fā)劑也是反應(yīng)物，并通過相關(guān)蛋白的作用來誘導(dǎo)黑色素合成基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致黑色素含量的升高[33]。故抑制酪氨酸酶活性、抗氧化是目前公認(rèn)美白的兩個關(guān)鍵靶點。

DPPH 法及ABTS 法為兩大常用的體外抗氧化評價實驗，廣泛用于評價植物提取物的抗氧化性能[34]。而本實驗發(fā)現(xiàn)PGE-ME5 在抗氧化、抑制酪氨酸酶活性上均顯示出良好的作用，由此初步得出，桔梗醇提物作為一種抗氧化劑可能是通過阻斷或減弱酪氨酸酶活性、抑制酶表達(dá)，從而達(dá)到協(xié)同美白效果，具體的美白作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究，綜上所述，PGE-ME5 具有良好的美白及抗氧化活性，因此，桔梗醇提物可能會成為潛在的天然美白活性成分，用于美白保健產(chǎn)品的研發(fā)。