極端紅曲霉高粱發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化性和抗炎性

師建全，王 凱，肖 冬，鄭羽西，陰耕云，李 焞

（1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南昆明 650231；2.茅臺學(xué)院，貴州仁懷 564500；3.上海全麗生物科技有限公司，上海 200000）

極端環(huán)境下生長的微生物，為了適應(yīng)生存，經(jīng)自然選擇，通常具有獨特的菌體結(jié)構(gòu)、響應(yīng)機制和代謝系統(tǒng)，以應(yīng)答因強烈脅迫因子帶來的高水平氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）[1]。從生物技術(shù)的角度來看，這種代謝系統(tǒng)和基因表達的可塑性使得極端微生物應(yīng)用前景廣闊，因為它們能夠適應(yīng)不利的環(huán)境，并在特定條件下提供高效、豐富和獨特的代謝產(chǎn)物[2]。極端微生物發(fā)酵產(chǎn)物在對抗環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的OS 方面的巨大潛力，引起了全球?qū)W者的廣泛關(guān)注，但是目前研究主要集中于環(huán)境領(lǐng)域[3-4]。

由于其獨特的口感和高品質(zhì)，醬香白酒（Moutaiflavor Baijiu,MFB）已成為中國最受歡迎的酒類種類，并成為了中國文化和日常生活中不可替代的一部分[5]。作為MFB 最著名的產(chǎn)地，中國貴州省茅臺鎮(zhèn)擁有持續(xù)數(shù)百年的釀酒歷史。MFB 獨特的脅迫式發(fā)酵工藝長期對本地釀酒微生物進行馴化，促成了以高鹽度（釀造環(huán)境中由于底物的反復(fù)添加而導(dǎo)致鹽分的富集）、高酸度和高酒精度為特征的釀酒微生態(tài)環(huán)境[6]中富集了多種獨特的極端微生物，而這些特殊的菌群也賦予了MFB 獨一無二的醬香風(fēng)格。除此之外，這些極端微生物的發(fā)酵產(chǎn)物也被廣泛報道含有大量的生物活性物質(zhì)，如有機酸、多酚、黃酮、氨基酸、三萜類、維生素等[7-8]，這些活性物質(zhì)都被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、保健食品和其它健康產(chǎn)品。

通過深入挖掘MFB 釀造環(huán)境的微生物資源，在之前的研究中成功分離并報道了一株編號YX-1125的極端絲狀真菌[6]。經(jīng)真菌形態(tài)鑒定與ITS 和BenA序列分析，確定為叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）。值得注意的是，通過調(diào)節(jié)發(fā)酵條件至接近MFB 極端釀造環(huán)境，該菌種短鏈脂肪酸（SCFAs）產(chǎn)量（19.8 g/L）實現(xiàn)了目前同類文獻報道最高水平[6]。許多文章證實了微生物來源的SCFAs 對人體的有益作用，包括緩解炎癥和選擇性抑制有害微生物生長等[9-11]。因此，在這篇研究中，基于該菌種與高粱發(fā)酵產(chǎn)物濾液（Monascusand Sorghum Fermentation Filtrate,MSFF）開發(fā)出了一種全新的抗氧化與抗炎癥原料，并利用多項實驗評估了該發(fā)酵濾液的成分、安全性與生物活性。據(jù)所知，這是極端微生物發(fā)酵產(chǎn)物作為生物活性成分首次被研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高粱 仁懷市茅臺鎮(zhèn)產(chǎn)自被稱為“紅纓子”的有機糯高粱（貴州，中國），這種高粱是茅臺鎮(zhèn)生產(chǎn)醬香白酒的主要原料，總淀粉含量83.40%，其中96.27%為支鏈淀粉[12-13]。高粱在使用前一直保存于4 ℃，并被粉碎為目數(shù)100 的粉末待用；菌種YX-1125 獲取于貴州省茅臺鎮(zhèn)MFB 釀造環(huán)境中[6]，目前保藏于China General Microbiological Culture Center（編號CGMCC 21938）；菌株YX-1125 馬鈴薯葡萄糖瓊脂上30 ℃保存5 d 后，放入冰箱4 ℃（短期）或-20 ℃（長期）保存；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，編號KN-819）保藏于茅臺學(xué)院；α-淀粉酶（采用地衣芽孢桿菌誘變篩選的高產(chǎn)菌株，10000 U/g）山東隆大生物工程有限公司；復(fù)合糖化酶（由去除轉(zhuǎn)苷酶的葡萄糖淀粉酶和普魯蘭酶組成的復(fù)合型糖化酶組成，其中糖化酶是由黑曲霉優(yōu)良菌種經(jīng)深層發(fā)酵精制提煉而成，普魯蘭酶是由地衣芽孢桿菌菌種經(jīng)深層發(fā)酵提煉而成，100000 U/mL）山東隆大生物工程有限公司；人角質(zhì)細胞（HaCaT 細胞）、小鼠單核巨噬細胞（RAW264.7，目錄號BNCC342033）中科院細胞庫；ELISA 試劑盒 美國Biolegend 公司；3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）美國Sigma-Aldrich 公司；抗β-肌動蛋白、MMP-1 和MMP-9 的一抗 美國Abcam 公司；抗β-肌動蛋白、MMP-1 和MMP-9 的二抗 中國Proteintech 公司；研究中使用的所有其他化學(xué)物質(zhì) 均為分析純，阿拉丁生化科技有限公司。

TS-111B 恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海善志儀器設(shè)備有限公司；10QS 鼓泡生物反應(yīng)器 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；Nicolet 6700 傅立葉紅外光譜儀美國賽默飛世爾科技公司；Agilent 7890N 氣相色譜聯(lián)用 配有DB-WAX 毛細管柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm），采用安捷倫MSD ChemStation 軟件進行數(shù)據(jù)分析、1290 Infinity II 高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）美國安捷倫科技有限公司；Hyperlab SMART 多參數(shù)生化分析儀 荷蘭Biostream 公司；紫外交聯(lián)儀CL-1000美國UVP 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種懸浮液的制備 每個月將菌株YX-1125（見圖1）的孢子轉(zhuǎn)移到新鮮PDA 培養(yǎng)基上保持活力。用無菌生理鹽水洗PDA 培養(yǎng)基，得到新鮮的接種孢子懸液。將制備好的孢子懸液加入到無菌種子培養(yǎng)基（葡萄糖50 g/L，酵母浸出粉2.5%）中，添加無菌生理鹽水將孢子濃度調(diào)節(jié)為106個孢子/mL。在經(jīng)過30 ℃條件下不通氣、不攪拌、不搖勻的8 h 種子培養(yǎng)以后，菌種YX-1125 的種子懸浮液將用于后續(xù)發(fā)酵的接種。菌種KN-819 同樣篩選于貴州省茅臺鎮(zhèn)MFB 釀造環(huán)境中，因其具有極強的發(fā)酵產(chǎn)有機酸能力，被用于在預(yù)發(fā)酵為菌種YX-1125 模擬同MFB 釀造類似的酸性脅迫環(huán)境。菌種KN-819 平時保存于20%甘油的儲存培養(yǎng)基中，使用前轉(zhuǎn)入MRS培養(yǎng)基。在旋轉(zhuǎn)搖床中維持30 ℃和150 r/min 進行12 h 的種子培養(yǎng)后，以14000×g 離心5 min，然后以無菌生理鹽水洗滌1 次，得接種懸浮液。

圖1 菌種YX-1125 的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristic of strain YX-1125

1.2.2 MSFF 的生產(chǎn) 如圖2 所示，MSFF 的生產(chǎn)總體來說需要液化、酸化和發(fā)酵三個階段。第一階段液化分為預(yù)糖化步驟和糖化步驟。簡單地說，首先將蒸餾水與高粱粉末的混合物，固液比1:10（w/v）加入搖瓶中，溫度控制在80 ℃水浴。隨后，在制備的泥漿中添加濃度為140 U/g 的α-淀粉酶，并在旋轉(zhuǎn)搖床中以100 r/min 的速度進行預(yù)糖化。經(jīng)過2 h 的預(yù)糖化后，將漿液冷卻到60 ℃，在振蕩培養(yǎng)箱中以140 r/min 的速度用復(fù)合糖化酶（40 U/g）糖化8 h，充分釋放支鏈淀粉中的可發(fā)酵糖。

酸化階段的目的是通過菌種KN-819 為后續(xù)脅迫式發(fā)酵營造極端酸性環(huán)境。待糖化后泥漿冷卻后，加入10%的KN-819 接種懸浮液，在42 ℃的嚴格靜止條件下培養(yǎng)至pH 降至3.5 時終止，收集液體部分用于下一步發(fā)酵階段。

最后使用發(fā)酵生產(chǎn)MSFF。依據(jù)之前的研究并做小幅改動[14-15]，該階段在一種改良的5 L 的鼓泡生物反應(yīng)器中進行。該反應(yīng)器安裝了60 個矩陣單元形成蜂窩狀結(jié)構(gòu)用于絲狀真菌YX-1125 的固定化。在進行24 h 的固定化培養(yǎng)后，種子培養(yǎng)基被替換為收集的酸化液體，并維持在35 ℃，曝氣量0.5 vvm和攪拌速率160 r/min 的條件下培養(yǎng)。96 h 后，收集發(fā)酵液，并通過1000 Da 的納濾膜過濾去除發(fā)酵液中的微生物和大分子雜質(zhì)，得到MSFF。

1.2.3 MSFF 的成分分析

1.2.3.1 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）MSFF 在Nicolet 6700光譜儀上進行FTIR 分析。樣品在透射模式下進行分析，光譜記錄在4500～400 cm-1范圍內(nèi)。在4 cm的分辨率和1 cm/s 的掃描速度的條件下掃描被收集。依據(jù)Kadiroglu 等[16]的研究，在每次測量前收集背景光譜。

1.2.3.2 氣質(zhì)聯(lián)用（Gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）采用GC-MS 分析MSFF，特別是其中的有機酸構(gòu)成，依據(jù)Mellinas 等[17]的研究并有一些改動。以二氯甲烷為溶劑進行液-液萃取，獲取有機相。采用Agilent 7890N 氣相色譜聯(lián)用5977B四極質(zhì)譜（MS），在電子沖擊（EI）電離模式（70 eV）下進行MSFF 中活性物質(zhì)的鑒定。通過與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology,NIST）質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配，確定了樣品中存在的生物活性物質(zhì)。

1.2.3.3 酚類物質(zhì)的定量方法 MSFF 中的四類主要的酚類化合物含量遵循之前報道過的方法被定量[18-20]：a.總可溶性酚酸（Total soluble phenolic acids），按沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，表示為每毫升MSFF 的mg 沒食子酸當(dāng)量，單位mg gallic acid eq/mL；b.總類黃酮，用懈皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，表示為每毫升MSFF的mg 懈皮素當(dāng)量，單位為mg quercetin eq/mL；c.總單寧（Total tannins），用表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線測定，表示為mg 表兒茶素每毫升MSFF，單位為mg epicatechin eq/mL；d.總花青素，用分光光度法測定，表示為μg 葡萄糖苷每毫升MSFF，單位為μg cyanidin-3-glucoside eq/g。所有測量獨立重復(fù)三次。

1.2.3.4 HPLC 和生化分析儀 通過HPLC 測定MSFF 中的維生素和氨基酸含量和構(gòu)成。采用Shimpack GIST C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈與0.1 mol/L 磷酸二氫鉀水溶液，比例為80:20；流速：1 mL/min；檢測波長為246 nm，進樣量10 μL，柱溫40 ℃。氨基酸與維生素的鑒別通過與購買的商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間對照進行確定。多參數(shù)生化分析儀被用于本實驗中測量MSFF 中的乳酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸等多種羥基酸，如之前論文所述[14-15]。

1.2.4 MSFF 的抗氧化性分析 采用了五種不同的方法來評估抗氧化活性：a.抗氧化力測試（Ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP），單位為mmoL eq FeSO4/mL；b.DPPH 自由基清除活性；c.螯合銅和鐵的能力；d.超氧自由基（·）清除活性；e.羥基自由基（·OH）去除活性[21]。

1.2.5 體外細胞實驗

1.2.5.1 細胞培養(yǎng) HaCaT 細胞和RAW264.7，培養(yǎng)在10% 胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）中，于加濕的37 ℃和5% CO2的條件下。細胞按照1.5×104個/孔接種于96 孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞孵育24 h 后，吸出培養(yǎng)基并用胎牛血清洗去殘余培養(yǎng)液，對照組和空白組細胞加入100 μL DMEM，樣品組細胞加入100 μL 的0.1%，0.5%和1.0%濃度的MSFF（DMEM 稀釋），每組6 個平行，在培養(yǎng)箱中孵育18 h。隨后被用1 μg/mL 脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）刺激或紫外線生成器照射至劑量5 mJ/cm2，用以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。

1.2.5.2 細胞活性測試 使用磺酰羅丹明B 測定細胞活力[22]。孵育期后，用滅菌胎牛血清沖洗一次細胞，然后用250 μL 的10%（w/v）三氯乙酸（TCA）固定到每孔中，在4 ℃下孵育1 h。然后，用慢速自來水沖洗板，用紙巾除去多余的水，在室溫下晾干（20～25 ℃）。每孔加入0.057%（w/v）磺酰羅丹明B 溶液250 μL，染色30 min。未結(jié)合的染料用1%（v/v）乙酸洗滌。蛋白結(jié)合染料溶解于250 μL 10 mmol/L三乙醇胺緩沖鹽水溶液中，并轉(zhuǎn)移100 μL 到96 孔板上，在酶標(biāo)儀中測量510 nm 處的光密度值（optical density，OD）光通過被檢測物，前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量，特定波長下細胞的濃度與被吸收的能量成定量關(guān)系，因此OD 值可用于代表細胞的存活，細胞活性（%）=樣品吸光度/對照組吸光度×100。

1.2.5.3 細胞內(nèi)活性氧的測定 細胞內(nèi)的活性氧使用活性氧熒光探針（2’,7’-dichlorodihydrofluoresceindiacetate，DCF-DA）進行，該方法也被文獻[23-24]采用。HaCaT 細胞在紫外線照射前預(yù)處理6 h，然后孵育2 h。孵育后，HaCaT 細胞用5 μmol/L 的DCF-DA在37 ℃下染色30 min，然后用胎牛血清沖洗兩次，隨后用90%的二甲基亞砜（DMSO）在胎牛血清中溶解細胞。熒光酶標(biāo)儀在485/525 nm 的激發(fā)/發(fā)射波長下測量熒光增加倍數(shù)，以及確定總的氧化應(yīng)激水平。

1.2.5.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）根據(jù)制造商的產(chǎn)品說明書，用ELISA 試劑盒對培養(yǎng)液中IL-6 和IL-8 的產(chǎn)量進行定量。酶標(biāo)儀在450 nm 處讀取吸光度。

1.2.5.5 蛋白質(zhì)印跡法 使用蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達[24]。收集處理后的細胞，用胎牛血清洗滌，然后用放射免疫沉淀法裂解得到全細胞裂解液。收集上清液用Bradford 蛋白法定量蛋白，測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞裂解物，隨后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC 膜。用抗β-肌動蛋白、MMP-1 和MMP-9 的一抗在4 ℃下孵育過夜。最后，用三乙醇胺緩沖鹽水溶液加吐溫-20 洗滌膜3 次（每次洗滌5 min），去除一級抗體，然后與相應(yīng)的偶聯(lián)二抗體（Proteintech）在室溫下孵育1 h。免疫反應(yīng)蛋白通過化學(xué)發(fā)光檢測（BeyoECL Plus，Millipore）顯示條帶。

1.2.5.6 安全性評估 RAW264.7 和HaCaT 細胞被用于評估MSFF 的細胞安全性。將細胞種在96 孔板中，200 μL 培養(yǎng)基（2.5×104個細胞/孔）。在附著過夜后，用不同濃度（0.1～50.0 mg/mL）所制備的提取物與1 μg/mL 的脂多糖處理細胞24 h。以不含MSFF和脂多糖的培養(yǎng)基為陰性對照，以不含脂多糖的培養(yǎng)基為陽性對照。采用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）法分析細胞活力，并根據(jù)490 nm 波長的吸光度測定[25-26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism software v6.0（GraphPad Software,San Diego，CA，USA）處理。參數(shù)方差分析（ANOVA）檢驗和Tukey 檢驗被用于進行樣本分析[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSFF 的成分分析

2.1.1 FTIR 分析 FTIR 分析是一種簡單易行的分析技術(shù)，用于鑒定和表征樣品的主要化合物的官能團。圖3 顯示了MSFF 的FTIR 光譜。分析結(jié)果顯示3359.55 cm-1附近出現(xiàn)的大吸收帶對應(yīng)強吸水性，伴隨著H-O-H 拉伸振動。2938.32 cm-1處較小的信號歸屬于碳水化合物或有機酸類[28]的甲基和亞甲基的C-H 拉伸振動。有機酸是由在1735.40 cm-1和1675.01 cm-1處的C=O 拉伸振動確定的[29]。芳香化合物中苯基的C-C 拉伸振動譜帶的值為1412.68 cm-1[30]，而1215.49 cm-1處的信號與C-O 拉伸振動有關(guān)[29]。

圖3 MSFF 的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of the MSFF sample

結(jié)果表明，MSFF 樣品的主要譜帶分布在有機酸和酚類物質(zhì)上，而這些主要生物活性成分均與高抗氧化活性有關(guān)。已經(jīng)有很多研究報道了發(fā)酵液中的抗氧化活性與酚類物質(zhì)含量呈正相關(guān)。例如，Verzelloni 等[31]肯定了紅酒和傳統(tǒng)香醋的抗氧化能力與它們的酚類和類黃酮含量高度相關(guān)。

2.1.2 有機酸構(gòu)成分析 通過GC-MS 和多參數(shù)生物分析儀等設(shè)備分析了MSFF 中的小分子物質(zhì)，其中有機酸的構(gòu)成如圖4 所示?？偟膩碚f，本工作中得到的有機酸構(gòu)成與之前文獻報道的菌種YX-1125代謝產(chǎn)物中的有機酸構(gòu)成類似，均以短鏈脂肪酸（SCFAs）為主，占比達95%以上。在MSFF 的SCFAs中，占比最高的為丁酸（占總有機酸的60%以上）、其次為乳酸、丙酸和乙酸。SCFAs 目前主要發(fā)現(xiàn)于腸道益生菌發(fā)酵產(chǎn)物中，由于其與各種人類健康狀況聯(lián)系緊密而日益受到全球關(guān)注。此外，剩余有機酸主要構(gòu)成為檸檬酸。

圖4 MSFF 中不同化合物種類的定量數(shù)據(jù)Fig.4 Quantitative data regarding the different compound families in MSFF

對比了高粱-植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物和MSFF 的成分和生物活性，植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)物以單一的乳酸為主，而MSFF 中以短鏈脂肪酸為主，導(dǎo)致了更好的抗炎效果，因此可以肯定相關(guān)結(jié)果是極端紅曲霉作為主導(dǎo)，但植物乳桿菌確實也起到了重要輔助作用。此外，乳酸是極端紅曲霉的主要發(fā)酵碳源之一[6]，但由于篇幅有限，本文未展示對照試驗結(jié)果，相關(guān)內(nèi)容將會在后續(xù)文章中進行展示和討論。

2.1.3 酚類物質(zhì)構(gòu)成分析 MSFF 中的酚類物質(zhì)構(gòu)成采用光譜學(xué)方法測量，結(jié)果如圖4 所示。酚類物質(zhì)中含量最高為單寧，含量為3.59 mg epicatechin eq/mL MSFF，占總酚類物質(zhì)的50%以上，該結(jié)果與之前文獻中報道的這類高粱中單寧含量較高吻合[12-13]。其次為類黃酮，含量為2.89 mg/mL，類黃酮中花色素苷經(jīng)測定含量為0.05 mg/mL，為類黃酮總含量的1.8%。含量最低的是酚酸類，占總酚類物質(zhì)含量的7.2%。

2.1.4 其它活性成分分析 通過HPLC 外標(biāo)法分析，MSFF 中總共含有7.53 mg/mL 的17 種游離氨基酸（見圖4）。其中酪氨酸0.25 mg/mL、精氨酸0.18 mg/mL、苯丙氨酸0.40 mg/mL、組氨酸0.11 mg/mL、蛋氨酸0.09 mg/mL、谷氨酸1.06 mg/mL、賴氨酸0.31 mg/mL、天門冬氨酸0.67 mg/mL、天門冬酰胺0.10 mg/mL、異亮氨酸0.50 mg/mL、亮氨酸0.65 mg/mL、蘇氨酸0.33 mg/mL、纈氨酸0.61 mg/mL、脯氨酸0.90 mg/mL、絲氨酸0.49 mg/mL、丙氨酸0.46 mg/mL 和甘氨酸0.42 mg/mL。半胱氨酸、谷氨酰胺和色氨酸未檢測出。除此之外，MSFF 還檢測出維生素C 和維生素E，其含量分別為37.59 和53.72 μg/mL。綜上，MSFF 中含有豐富和高濃度的生物活性物質(zhì)。

SCFAs，特別是乙酸、丙酸和丁酸，目前主要發(fā)現(xiàn)于腸道益生菌發(fā)酵產(chǎn)物中。它們對人體生理有許多影響，包括作為細胞的能量來源，調(diào)節(jié)與修復(fù)屏障，影響炎癥反應(yīng)[32-33]。Wang 等[34]證實，SCFAs 能夠有效抑制有害微生物的生長和炎癥。在本研究中，同樣的高水平SCFAs 也在MSFF 中被發(fā)現(xiàn)，這可能是導(dǎo)致MSFF 具有顯著的抗炎癥功效與細胞保護能力的原因。

酚類化合物是另一種被大量發(fā)現(xiàn)于MSFF 中的活性物質(zhì)。來自植物的酚類化合物的抗氧化性能已在多篇文獻中得到廣泛報道[35]。酚類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物，作為優(yōu)秀的抗氧化劑和炎癥阻斷劑，提供顯著的皮膚健康效果，并通過減緩炎癥的損傷減弱炎癥對機體的影響[36]。因其高水平抗氧化和抗菌活性、對炎癥介導(dǎo)的損傷保護作用和對MMPs 的抑制作用，富含酚類化合物的保健食品和護膚配方創(chuàng)新成分已大規(guī)模上市。Hong 等[25]證實了高粱中富含酚類化合物，且具有強力的抗氧化活性和抗炎癥活性。本研究揭示了MSFF 中也具有高水平的酚類化合物，可能是通過發(fā)酵等方式從高粱中釋放了出來。而MSFF 中占主導(dǎo)的SCFAs 加酚類化合物的組合，可能是其能夠有效抗氧化和抑制炎癥的根源。

2.2 MSFF 的抗氧化性分析

通過多種檢測方法評估了MSFF 的體外抗氧化潛力，結(jié)果如表1 所示。羥基自由基作為最常見活性氧自由基之一，其形成與過渡金屬有關(guān)，特別是銅和鐵。在沒有這些離子的情況下，過氧化氫相當(dāng)穩(wěn)定。當(dāng)這些金屬的內(nèi)穩(wěn)態(tài)受到干擾時，就會通過芬頓反應(yīng)形成羥基自由基[27]。羥基自由基被認為是活性氧中最具活性的，幾乎可以與任何生物分子（如蛋白質(zhì)和DNA）相互作用，導(dǎo)致有毒化合物的形成并導(dǎo)致細胞損傷[37]。實驗觀察到MSFF 同時具有較高的金屬螯合能力（特別是銅）和羥基自由基清除能力。由于羥基自由基的清除活性在數(shù)值上遠遠高于金屬螯合活性，推測MSFF 能夠通過去除金屬離子等多種機制在氧化起始階段阻礙氧自由基的形成和級聯(lián)反應(yīng)。

表1 MSFF 體外抗氧化活性試驗評價結(jié)果Table 1 Evaluation results of in vitro antioxidant activity tests of MSFF

MSFF 在其它自由基清除方面也有較好的效果，80%的MSFF 的DPPH 自由基和O2-自由基清除率達到了67.3%和55.8%，證明了MSFF 全面的活性氧清除能力。此外，在抗氧化能力方面，MSFF 同樣具有較高值，80% MSFF 的FRAP 值為1.24 mmol eq FeSO4/mL MSFF，相當(dāng)于每升MSFF 中含有等效于102.8 g 的維生素C（以每100 mg 維生素C 的抗氧化活性為1.51 mmol eq FeSO4計）。MSFF 的高抗氧化能力可能和其含有高水平的酚類物質(zhì)（如單寧和花青素）有關(guān)。以上測試結(jié)果均證明，MSFF 能夠抑制自由基并可作用于細胞化合物的氧化起始階段，是一種優(yōu)秀的多重靶向抗氧化劑，具有巨大的抗氧化潛力。

2.3 體外細胞實驗

2.3.1 MSFF 抑制炎癥引起的細胞凋亡效果 采用磺酰羅丹明B 法測定MSFF 對巨噬細胞細胞活力的影響。用三種不同濃度的MSFF 處理RAW264.7 細胞（0.1%、0.5%和1%）。如圖5A 所示，經(jīng)處理后的RAW264.7 細胞活力與對照組相當(dāng)，證實MSFF 在這些劑量下對該類細胞無細胞毒性（>80%細胞存活）。因此，使用這三種濃度的MSFF 進行進一步實驗。為研究MSFF 對細胞活力的影響，用MSFF 預(yù)處理RWA264.7 細胞，再引起細胞的炎癥反應(yīng)。如圖5B所示，與未產(chǎn)生炎癥的細胞相比，炎癥反應(yīng)顯著降低細胞的活力至55.4%。用0.5%的MSFF 預(yù)處理細胞，可使炎癥細胞活力提高至81.4%。此外，細胞活力的提升呈濃度依賴性。因此，結(jié)果數(shù)據(jù)表明，MSFF 在1.0%濃度下無細胞毒性且可以有效地減少炎癥引起的細胞凋亡。

圖5 體外評估MSFF 對被誘導(dǎo)炎癥細胞的影響Fig.5 In vitro assessment of MSFF on cytotoxicity and antioxidant activity in cells

2.3.2 MSFF 對炎癥產(chǎn)生的活性氧清除效果 炎癥可誘導(dǎo)活性氧過度產(chǎn)生，進而激發(fā)光老化進程。因此，通過監(jiān)測細胞內(nèi)活性氧生成來研究MSFF 對炎癥誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞氧化應(yīng)激的影響。采用DCF-DA 熒光探針檢測細胞內(nèi)活性氧的生成。如圖5C 所示，炎癥細胞的活性氧熒光強度（171.5%）明顯高于非紫外線照射細胞（100%）。然而，MSFF 處理細胞后，炎癥細胞內(nèi)活性氧均減少到130%以下，且呈濃度依耐性。相比炎癥細胞，1.0%的MSFF 處理細胞下降了35.8%（171.5% vs.110.1%）。這些結(jié)果表明，MSFF 具有減少細胞中活性氧生成的能力。該實驗結(jié)果也與2.2 體外實驗中MSFF 具有較強的抗氧化活性的結(jié)果一致。

2.3.3 MSFF 減少促炎癥細胞因子的效果 長期炎癥會增加促炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，如白細胞介素-1α（IL-1α）、IL-1β、IL-6、IL-8、前列腺素E2 和一氧化氮[38]。為了分析MSFF 是否能夠抑制促炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，研究了LPS 刺激下IL-6、IL-8 等促炎癥細胞因子的表達水平?？偟膩碚f，LPS 刺激上調(diào)了誘導(dǎo)炎癥和光老化的促炎癥細胞因子的表達，如圖6A 和圖6B 所示。與陰性對照相比，在RAW264.7 細胞中加入MSFF可以顯著抑制LPS 刺激引發(fā)的IL-6 表達，且呈劑量依賴的方式，其中1.0%的MSFF 對IL-6 的抑制效果達到了83.2%。此外，MSFF 在0.1%、0.5%和1.0%的濃度下對LPS 引發(fā)的IL-8 的抑制作用也逐漸加強，呈現(xiàn)劑量依賴的現(xiàn)象。這些結(jié)果表明MSFF 可通過降低促炎癥細胞因子含量有效抑制炎癥的生成。

圖6 MSFF 體外抗炎評價Fig.6 In vitro assessment of the anti-inflammatory of MSFF

2.3.4 MSFF 減少炎癥引起的金屬硫蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）效果 實驗評估了0.1%、0.5%和1.0%的MSFF 是否能夠減弱UV 引起的MMP-1 和MMP-9 的表達來測試其對炎癥引發(fā)的皺紋與皮膚結(jié)構(gòu)破壞的緩解效果，并與視黃酸（Retinoic acid,RA）在10 μmol/L 劑量下進行對比。除了對照組，其余各組均用劑量為5 J/cm2的UV 照射處理。圖6C 和圖6D 顯示了MMPs 的表達結(jié)果，MMP-1表達水平在UV 照射后顯著提高至267.2%，但在MSFF 和RA 處理后UV 引起的MMP-1 的表達均有顯著的下調(diào)（P<0.05）?？偟膩碚f，隨著MSFF 濃度的增加，MMP-1 的表達逐漸降低。1.0% MSFF和RA 對應(yīng)的MMP-1 均略高于無任何UV 照射的對照組水平。MMP-9 水平在UV 照射后顯著提高至192.5%，但在用0.1%、0.5%、1.0%的MSFF 和RA處理后降低至110.7%，96.2%，89.6%和92.3%。在無UV 照射的正常條件下，MMP-9 的表達與0.5%MSFF 加UV 照射的MMP-9 表達相當(dāng)。這些結(jié)果表明MSFF 能夠有效減弱UV 引起的皺紋形成相關(guān)的MMPs 表達。

2.4 安全性測試

兩種細胞系HaCaT 和RAW264.7 在MSFF 處理后，使用MTT 法在0.1～50.0 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)評估其活力。以上兩種細胞具有易于培養(yǎng)、成本低、易獲取且具有代表性等優(yōu)點，因此在本研究中被用于進行細胞活力測試。在評估的所有劑量下，兩種提取物均未觀察到顯著影響（數(shù)據(jù)未顯示，P>0.05），這表明MSFF 在這兩種細胞中具有較高的細胞相容性。

3 討論與結(jié)論

緩解炎癥和氧自由基對身體損害一直是人們積極追求的目標(biāo)。微生物發(fā)酵產(chǎn)物一直以來因其溫和、安全和高功效而備受關(guān)注，并被廣泛用于食品、藥品或護膚品領(lǐng)域[39-40]。本文中，一種新型的極端微生物YX-1125 與高粱的發(fā)酵產(chǎn)物濾液（MSFF），因其具有抗氧化和抗炎癥潛力而被研究。實驗結(jié)果顯示MSFF 因其高抗氧化活性，可以減少細胞凋亡、氧化還原失衡、促炎癥細胞因子的產(chǎn)生和MMPs 的表達。該研究首次證實了極端微生物發(fā)酵產(chǎn)物能夠應(yīng)用于健康領(lǐng)域，用于抵御氧自由基和炎癥對機體的損害。

炎癥誘導(dǎo)可通過觸發(fā)不同的細胞信號通路激活MAPKs 和NF-κB，從而觸發(fā)MMPs 的表達。MMP負責(zé)降解細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，如膠原蛋白、纖維連接蛋白、彈性蛋白和蛋白多糖，導(dǎo)致皮膚的老化與結(jié)果破壞[41]。MMPs 是一種內(nèi)肽酶，在炎癥過程中起著關(guān)鍵作，其中MMP-1（膠原酶）和MMP-9（明膠酶）分解了大部分ECM，其過量表達是老化、皺紋與疾病形成的主要原因[42-43]。本研究結(jié)果顯示MMP-1和MMP-9 的表達在紫外照射以后的HaCaT 細胞中都提高了，但是在MSFF 與視黃酸（RA）處理以后均有顯著性的下調(diào)（P<0.05）。這些結(jié)果表明MSFF 通過下調(diào)MMPs 的表達，來防止炎癥導(dǎo)致的疾病和損害。類似的，許多以前的研究也致力于研究如何抑制MMPs 的表達。Lin 等[44]利用Pholiota nameko多糖（PNPs）降低了人真皮細胞中的MMP-1、MMP-3和MMP-9 的蛋白表達，顯著減弱炎癥誘導(dǎo)的細胞衰老，證明了其抗光老化潛力。Karapetsas 等[45]研究了希臘蜂蜜提取物對UVB 處理的HaCaT 細胞的影響，結(jié)果表明蜂蜜提取物能夠顯著提高MMPs 的表達，實現(xiàn)抗老化的目的，該結(jié)果也在重組皮膚模型中得到印證。

細胞凋亡是炎癥的公認標(biāo)志。炎癥誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激過程中，細胞內(nèi)氧化還原平衡的喪失導(dǎo)致細胞損傷，最終導(dǎo)致細胞凋亡。大量證據(jù)表明，炎癥誘導(dǎo)皮膚細胞凋亡是由線粒體（內(nèi)在）和死亡受體（外在）通路[46]共同作用的。Wang 等[47]測試了Prinsepiae Nux提取物對細胞炎癥的影響，結(jié)果表明炎癥誘導(dǎo)的核因子相關(guān)因子2（Nrf 2）和血紅素氧合酶1（HO-1）缺失、活性氧過量產(chǎn)生以及促炎癥介質(zhì)基因上調(diào)均有不同程度的逆轉(zhuǎn)，有效保護了細胞免受炎癥的損傷。在本研究中，MSFF 同樣被證明能夠有效減少炎癥誘導(dǎo)的細胞凋亡，降低IL-6、IL-8 等促炎癥細胞因子的表達水平，且呈劑量依賴。1.0%的MSFF 可下調(diào)高達80%以上的UVB 引發(fā)的促炎癥細胞因子，遠遠高于以上提到的所有文獻，顯示出MSFF 十分優(yōu)秀的抗炎癥潛力，這可能和MSFF含有豐富的SCFAs 和酚類物質(zhì)等活性物質(zhì)有關(guān)。