改造枯草芽孢桿菌的乙醛酸旁路合成乙醇酸

劉宇飛，伏 聰，謝雨康，史吉平,3，孫俊松,3,

（1.中國科學院上海高等研究院，上海 201210；2.中國科學院大學，北京 100049；3.上?？萍即髮W，上海 201210）

乙醇酸（glycolate，GA）又稱作甘醇酸、羥基乙酸，是最小的α-羥基酸、分子量最小的果酸，最初是由甘蔗萃取所得的天然有機酸[1]。由分子結構可知，乙醇酸既有羧基又有羥基，擁有羧酸和醇的雙重性質，因此，具有易降解吸收、強水溶性和穿透性等特點。乙醇酸及其聚合物具有良好的生物降解性與生物相容性，可以在生物體內降解、代謝為水和二氧化碳，從而排除生物體外，所以乙醇酸及其聚合物可用來釋放多肽和蛋白質類藥物[2-5]。乙醇酸還可作為藥物中間體，用于薄荷腦與奎寧的酯類制備及其它藥品的合成；乙醇酸低聚物或衍生物可以作為食品添加劑，通過酸化方式減少有害微生物繁殖[6]。基于其優(yōu)異的化學性能，乙醇酸被越來越多地應用于食品加工和制藥行業(yè)中。

目前，國內外乙醇酸的生產主要通過化學合成實現(xiàn)。其中，甲醛氰化法、氯乙酸水解法和甲醛氫羧基化法等化學合成途徑是目前主要的生產工藝[7-10]。但是，上述工藝存有反應條件劇烈、原料含劇毒、成本高、后續(xù)分離困難以及環(huán)境污染等問題，這些問題限制的乙醇酸生產規(guī)模的擴大，也不符合綠色生產理念。因此，迫切需要找到一種綠色可持續(xù)的可以大規(guī)模生產乙醇酸的方法。近年來，生物法合成乙醇酸引起了越來越多的關注。生物法合成乙醇酸的方法分為微生物酶催化法和全生物合成方法。其中，微生物酶催化法[11]需要使用有毒且價格較高的乙二醇或者乙醇腈為原料，不能滿足工業(yè)生產的需求。相比之下，全生物合成方法在未來乙醇酸生產市場具有很好的前景。利用微生物代謝工程，已經在大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌和酵母中建立了不同的乙醇酸代謝途徑[12-14]。目前，乙醇酸合成宿主菌研究主要集中于大腸桿菌。Pereira 等[15]在大腸桿菌中構建木糖代謝途徑并加強乙醛酸循環(huán)來合成乙醇酸；Zhu 等[16]通過引入外源酶解決了NADPH 不平衡問題，通過失活異檸檬酸脫氫酶和過表達乙醛酸還原酶等，進一步提高了大腸桿菌利用葡萄糖合成乙醇酸的效率。Xu等[17]在大腸桿菌中設計并構建乙醇酸響應的生物傳感器，建立乙醇酸的高通量篩選方法并獲得一株乙醇酸高產菌株。這些研究有望實現(xiàn)乙醇酸化學法生產的替代，但是由于生物安全性和純化成本等因素，上述研究合成的乙醇酸在食品和醫(yī)藥領域的大規(guī)模運用會受到限制。

枯草芽孢桿菌作為“公認安全”、“食用安全”的工業(yè)生產微生物，具有生長快、蛋白分泌能力強、不會產生內毒素以及不易受噬菌體感染等優(yōu)點[18-20]，被廣泛運用于食品酶、N-乙酰氨基葡萄糖、透明質酸、巖藻糖基乳糖等工業(yè)應用產品的微生物制造[21-25]。本研究以枯草芽孢桿菌為宿主，通過表達外源異檸檬酸裂解酶基因（aceA），構建完成了以甘油為碳源，經三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)途徑合成乙醇酸的生物代謝途徑，對乙醇酸的綠色安全生產和大規(guī)模全生物法合成具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

質粒、菌株 如表1 所示，菌株均保藏于-80 ℃冰箱。PCR 所用模板為Bacillus subtilis164MCT 基因組和質粒pMK4-T7；PCR 清潔試劑盒、質粒小劑量提取試劑盒 杭州愛思進生物技術有限公司；2×Phanta Flash Max Master Mi、2×Rapid Taq Master Mix 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DNA合成 上海生工生物工程公司；DNA 測序 北京擎科生物科技有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨OXOID；瓊脂粉 上海麥克林生化科技股份有限公司；甘油、硫酸、氯化鈉以及其他培養(yǎng)基成分 國藥集團化學試劑有限公司。

表1 菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids

PCR 儀器 美國BIO-RAD 公司；RID-10A/SPD-20A 高效液相色譜儀 日本島津公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；WFJ-2100可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 菌株構建過程使用的培養(yǎng)基為Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基，其組分為10 g/L 胰蛋白胨、10 g/L NaCl 以及5 g/L 酵母粉，在LB 培養(yǎng)基中加入1.5%～2.0%的瓊脂粉得到固體培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基為M9Y 培養(yǎng)基[26]，其組分為6.8 g/L Na2HPO4,3 g/L KH2PO4,0.5 g/L NaCl,1 g/L NH4Cl,0.015 g/L CaCl2·2H2O,0.49 g/L MgSO4·7H2O、2.8×10-4g/L FeSO4·7H2O、2 g/L 酵母粉。枯草芽孢桿菌抗生素篩選時，在培養(yǎng)基中添加抗生素的終濃度為紅霉素10 μg/mL，氯霉素10 μg/mL。

1.2.2 基因表達盒構建 基因表達盒構建主要是通過融合PCR 方法獲得用于整合到基因組的DNA 片段[27]。首先，以PCR 擴增方式獲取目的基因片段、抗性基因片段、上游同源臂片段和下游同源臂片段，PCR 擴增獲取DNA 片段時，使用高保真酶2×Phanta Flash Master Mix。菌株改造過程所用引物見表2。

擴增條件如下，PCR 配置體系為：2×Phanta Flash Master Mix 25 μL，上游引物（10 μmol/L）2.5 μL，下游引物（10 μmol/L）2.5 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 19.5 μL，共計 50 μL。PCR 反應條件為預變性95 ℃5 min，然后變性95 ℃ 15 s，退火55 ℃ 15 s，延伸時間據(jù)片段的長度來設置溫度為72 ℃，循環(huán)數(shù)30。擴增得到的DNA 片段添加限制性內切酶Dpn I 以消除模板DNA。接著，用AxyPrep PCR 清潔試劑盒進行目的DNA 片段的純化回收。

測定回收DNA 片段濃度后，通過overlap PCR對DNA 片段進行拼接組裝：第一步，PCR 反應配置體系為10 μL 2×Phanta Flash Master Mix，片段添加量200 ng，加入ddH2O 至終體積為20 μL，進行第一輪PCR 反應，循環(huán)數(shù)10。將第一步來獲取DNA 片段拼接模板進行新一輪PCR 反應，循環(huán)數(shù)30。然后通過DNA 凝膠電泳檢測PCR 產物，根據(jù)PCR 條帶的大小來鑒定片段融合情況。

1.2.3 枯草芽孢桿菌重組菌株構建 枯草芽孢桿菌的感受態(tài)的制備和轉化方法如文獻所述[28]。但是感受態(tài)的誘導物為甘露醇。感受態(tài)細胞經轉化后，將其孵育菌液涂在相應抗性平板上進行篩選；長出的轉化子菌落PCR 后，送至公司測序驗證。驗證正確的轉化子進行抗性基因消除，以獲得無抗突變株，以便于后續(xù)的遺傳改造，消除抗性的具體方法如下：把質粒pMK4-cre 轉化到陽性轉化子中，涂布于有氯霉素的抗性平板上，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)過夜；接著，挑取氯霉素平板上長出的菌落，接種在裝有3 mL 液體LB 的試管中。傳代4 次后，將菌液梯度稀釋并涂布到固體LB 平板上。37 ℃過夜培養(yǎng)后，用接種環(huán)挑取在長出的轉化子，同時印章到氯霉素抗性平板和紅霉素抗性平板上。篩選在兩種抗性平板上均不能生長的轉化子，進一步通過菌落PCR 鑒定抗性是否敲除或者送至公司測序驗證，最后將陽性菌株命名保藏。

1.2.4 重組菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 挑取單菌落接種到裝有3 mL 新鮮液體LB 培養(yǎng)基的試管中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)12 h；然后將上述菌液轉接至裝有50 mL M9Y 培養(yǎng)基的搖瓶中，接種量為1%。在37 ℃、200 r/min 的條件下，振蕩培養(yǎng)6 h 后，添加甘油至終濃度為5 g/L。培養(yǎng)過程中，每12 h 取一次樣并進行甘油和乙醇酸濃度測定。

1.2.5 發(fā)酵產物檢測 樣品制備：發(fā)酵液樣品經12000 r/min 高速離心10 min 后，取上清液稀釋（稀釋倍數(shù)根據(jù)預計產量不同進行調整）。用0.22 μm 的水相濾膜過濾至液相襯管內并放入液相小瓶中。

樣品分析條件：標準品和樣品均使用高效液相色譜儀檢測。色譜柱型號為Aminex HPX-87H（安捷倫），檢測器為RID-10A 折光示差檢測器（島津），色譜柱溫箱溫度為65 oC，流動相為5.0 mmol/L 的H2SO4，流速為0.8 mL/min，進樣體積為20 μL，單個樣品的檢測時間為20 min。

乙醇酸標準曲線的繪制。首先，稱量乙醇酸標品，用去離子水稀釋得到0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 十個濃度，根據(jù)上述檢測方法進行液相分析。收集數(shù)據(jù)后，以乙醇酸濃度為縱坐標，對應的液相色譜峰面積為橫坐標，繪制標準曲線。發(fā)酵液樣品經上述同樣的方法測定后，根據(jù)公式將峰面積換算得出對應乙醇酸濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗數(shù)據(jù)重復3 次，結果用平均值±標準偏差表示，并利用OriginPro 2022 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析（P≤0.05）和作圖。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌中乙醇酸合成途徑構建與優(yōu)化

乙醇酸合成相關的代謝通路如圖1 所示，枯草芽孢桿菌理論上可以通過其內源乙醛酸還原酶（YvcT）將乙醛酸還原成乙醇酸，但其缺乏乙醛酸的合成能力。因此，實驗首先將來自地衣芽孢桿菌的異檸檬酸裂解酶基因（aceA）轉入枯草芽孢桿菌164MCT，同時敲除乙醇酸氧化酶基因（glcD、glcF），在枯草芽孢桿菌中構建了乙醇酸合成通路，獲得菌株164MCT-GA，作為出發(fā)菌株。具體的改造菌株構建過程如下：a.利用融合PCR 的方法構建了T7-aceA（B）表達盒（圖2A）：首先，以U-glc-F、U-glc-R 為上下游引物擴增得到片段U-glc（1000 bp），如圖2B 泳道1 所示；以D-glc-F、D-glc-R 為上下游引物擴增得到片段D-glc（1000 bp），如圖2B 泳道4 所示；以erm-T7-F1、erm-T7-R1 為上下游引物擴增得到片段ermC-T7（1500 bp），如圖2B 泳道2 所示；以aceA（B）-F、aceA（B）-R 為上下游引物擴增得到片段aceA（B）（1300 bp），如圖2B 泳道3 所示；b.將PCR擴增所得片段U-glc、D-glc、ermC-T7 和aceA（B）按照方法1.2.2 通過融合PCR 手段構建T7-aceA（B）表達盒（4800 bp），融合片段驗證如圖2C 泳道1 和2所示；c.按照1.2.3 的方法將構建好的T7-aceA（B）表達盒轉化至菌株164MCT，將轉化菌液涂布至紅霉素抗性平板篩選。隨機挑取8 個轉化子，以U-glc-F 和D-glc-R 分別為上下游引物進行菌落PCR 驗證，陽性轉化子會擴增出長度約為4800 bp 的片段，如圖2D 的泳道2、4、6、7 所示，陽性轉化子進行測序驗證，經驗證獲得有紅霉素抗性的突變菌株164MCT-GA。d.按照方法1.2.3，利用cre/lox系統(tǒng)將164MCT-GA 的抗性基因消除，將轉化子印章到無抗、紅霉素抗性和氯霉素抗性平板上，抗性基因敲除的轉化子只能在不含抗生素的LB 平板上生長，如圖2E 所示。將轉化子1 送至測序公司進一步驗證，最終可得到無抗的突變菌株164MCT-GA。

圖1 乙醇酸代謝通路Fig.1 Metabolic pathways related to the synthesis of glycolate

圖2 164MCT-GA 的構建及驗證Fig.2 Construction and verification of 164MCT-GA

基于出發(fā)菌株164MCT-GA，本研究開展了進一步代謝優(yōu)化，具體菌株構建流程及驗證方法與出發(fā)菌株164MCT-GA 的構建類似，并且所有菌株均經過測序驗證，后續(xù)不再贅述。首先，因為三羧酸循環(huán)到乙醛酸循環(huán)需要充足的前體代謝物供應，所以用強啟動子T7 替換檸檬酸合酶基因（citA）的原始啟動子，促進檸檬酸合酶的表達以增加流向三羧酸循環(huán)的乙酰輔酶A（乙酰-CoA）的通量，從而增加檸檬酸的供應，獲得了工程菌株GA3-1，菌株可以用引物對Ucita-F、D-cita-R 驗證（圖3A），突變株的PCR 產物長度為3631 bp，對照組為2110 bp，如圖3B 泳道1 和2 所示；由于乳酸脫氫酶催化丙酮酸產生乳酸，會帶來碳源轉換過程中的碳流失，所以敲除了乳酸脫氫酶基因（ldh），得到工程菌株GA3-2，菌株可以用引物對U-ldh-F、D-ldh-R 驗證（圖3A），突變株的PCR產物長度為3319 bp，對照組為2936 bp，如圖3B 泳道3 和4 所示；在此基礎上，為減少乙酰-CoA 的損耗，使其更多的流向三羧酸途徑，進一步敲除了枯草芽孢桿菌胞內的乙酰-CoA 轉乙酰酶基因（mmgA、yhfs），鑒于該酶有兩個同工酶，先敲除mmgA（驗證見圖3B 泳道 5、6、7），后敲除yhfs，得到了工程菌株GA3-3 菌株，菌株可以用引物對U-yhfs-F、D-yhfs-R 驗證（圖3A），突變株的PCR 產物長度為3411 bp，對照組為3052 bp，如圖3B 泳道8 和9 所示；敲除磷酸乙酰轉移酶基因（pta）完成GA3-4 的構建，菌株可以用引物對U-pta-F、D-pta-R 驗證（圖3A），變突株的PCR 產物長度為3361 bp，對照組為3028 bp，如圖3B 泳道10 和11 所示；過表達乙醛酸還原酶基因（yvcT）以提高枯草芽孢桿菌合成乙醇酸的效率，最終獲得工程菌株GA3-5，菌株可以用引物對U-yhfs-F、D-yhfs-R 驗證（圖3A），變突株的PCR 產物長度為4628 bp，對照組為2200 bp，如圖3B 泳道12 和13 所示。

圖3 改造菌株驗證結果Fig.3 Verification results of modified strains

2.2 改造菌株搖瓶發(fā)酵結果分析

在搖瓶中利用M9Y 培養(yǎng)基發(fā)酵枯草芽孢桿菌改造菌株，驗證乙醇酸的合成能力，發(fā)酵結果如圖4 所示。通過分析發(fā)現(xiàn)，過表達基因citA后，菌株GA3-1 的乙醇酸產量相較于出發(fā)菌株164MCTGA 提高了81.8%，證明增加乙酰輔酶A 進入三羧酸循環(huán)的流量，可以間接增強乙醛酸循環(huán)支路；而敲除基因ldh、mmgA和yhfs并沒有顯著提高改造菌株的乙醇酸產量（P>0.05），這可能是由于在以甘油為碳源發(fā)酵過程中，枯草芽孢桿菌本身乳酸合成途徑不活躍，也沒有大量乙酰-CoA 流失；發(fā)酵過程中會有少量乙酸累積，敲除基因pta后，菌株GA3-4 乙醇酸產量相較于菌株GA3-1 提高了28.4%；而過表達基因yvcT則會顯著提高枯草芽孢桿菌乙醇酸合成量（P<0.05），菌株GA3-5 乙醇酸產量相較于菌株GA3-4 進一步提高了29.8%，最終產量為0.352 g/L，是出發(fā)菌株164MCT-GA 的3 倍左右。綜合上述分析，乙醛酸還原酶和異檸檬酸裂解酶是枯草芽孢桿菌乙醇酸合成的關鍵酶；增加檸檬酸合酶表達量，可以增加前體的供給提高乙醇酸產量。

圖4 不同重組菌株在M9Y 培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵乙醇酸產量對比Fig.4 Comparison of glycolate production by different recombinant strains in shake flask fermentation in M9Y medium

2.3 表達不同來源異檸檬酸裂解酶

異檸檬酸裂解酶在乙醇酸的合成中十分重要，但是枯草芽孢桿菌缺乏表達該酶的基因（aceA），以致于利用三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)合成乙醇酸的途徑不完整，因此，外源異檸檬酸裂解酶的表達或匹配度是需要進一步了解的關鍵因素。Kabisch 等[29]證明地衣芽孢桿菌的異檸檬酸裂解酶基因（aceA）可以在枯草芽孢桿菌中正常表達，所以本研究首先選擇了地衣芽孢桿菌來源的外源基因aceA。鑒于枯草芽孢桿菌對外源基因的包容性很高，大腸桿菌的基因也常被用于枯草芽孢桿菌的異源表達，因此，本研究進一步在枯草芽孢桿菌GA3-5 基因組上整合了來源于大腸桿菌的異檸檬酸裂解酶基因（aceA），構建了菌株GA3-52，基因表達盒如圖5A 所示。重組菌株GA3-52和GA3-5 的發(fā)酵對比結果，如圖5B 所示，兩株菌的生長情況和甘油消耗情況區(qū)別不大，但GA3-52 的乙醇酸的最高積累量達到0.572 g/L，產率約為0.175 g/g甘油，相較于GA3-5，其產量提高了62.5%。這一現(xiàn)象可能是不同來源的異檸檬酸裂解酶在枯草芽孢桿菌中重組表達后的酶學性能的差異造成的，也可能是aceA拷貝數(shù)增加引起的。因此，研究又將GA3-52 中整合的大腸桿菌來源的aceA替換為地衣芽孢桿菌來源的aceA，所獲得的菌株GA3-53 乙醇酸產量沒有顯著變化（P>0.05），如圖5C 所示，說明GA3-52 的乙醇酸產量的提高只是因為aceA基因拷貝數(shù)的增加。

圖5 重組菌株GA3-5、GA3-52 和GA3-53 在M9Y 培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵結果Fig.5 Results of shake flask fermentation of recombinant strains GA3-5,GA3-52 and GA3-53 in M9Y medium

3 討論與結論

本研究首次在枯草芽孢桿菌中通過表達外源異檸檬酸裂解酶基因（aceA），構建了以甘油為碳源，經過三羧酸和乙醛酸循環(huán)途徑合成乙醇酸的生物途徑。研究通過加強三羧酸循環(huán)、過表達關鍵酶基因，增加關鍵基因拷貝數(shù)，獲得一株乙醇酸產量為0.572 g/L，產率為0.175 g/g 甘油的枯草芽孢桿菌，完成了枯草芽孢桿菌中乙醇酸生物合成的初步研究，為后續(xù)該化學品的綠色安全生產技術的進一步完善奠定了基礎。

雖然本研究通過對枯草芽孢桿菌碳代謝途徑的改造和加強，大幅提升了其乙醇酸的合成能力，但是目前相比大腸桿菌的合成效率還有較大差距。例如，Alkim 等[30]以大腸桿菌為宿主，以D-木糖和葡萄糖為混合底物，通過乙醛酸途徑生產乙醇酸，最終糖酸轉化率分別為 0.31 g/（g 葡萄糖），0.29 g/（g 木糖），0.37 g/（g 葡萄糖+木糖）（混合比例為33:66%）;馬寧等[31]在大腸桿菌 MG1655（DE3）中敲除了ldhA（乳酸脫氫酶基因），通過調節(jié)乙醇酸合成途徑的關鍵酶，乙醇酸產率為0.24 g/g 葡萄糖（占理論產率的 28.2%）。然后在過量表達檸檬酸合成酶基因（gltA），并敲除基因glcB和aceB（蘋果酸合成酶基因），最終獲得的工程菌株Mgly335 的乙醇酸產率達到 0.522 g/g 葡萄糖（占理論產率的 61.4%）；Xu 等[17]在大腸桿菌中建立乙醇酸生物傳感器，篩選得到的菌株Mgly6-H1 可在5 L 發(fā)酵罐中產出40.9 g/L 左右的乙醇酸，產率為0.66 g/g 葡萄糖。上述研究表明，本研究只在枯草芽孢桿菌建立并初步優(yōu)化了乙醇酸合成途徑，后續(xù)需要進一步提高菌株代謝合成效率。接下來，可以對乙醛酸還原酶基因和異檸檬酸裂解酶的表達進行優(yōu)化，以提高乙醇酸的生物轉化量及底物轉化率；還需要開展宿主細胞三羧酸循環(huán)的微調，嘗試調節(jié)異檸檬酸脫氫酶的表達[32]，減少異檸檬酸流向α-酮戊二酸，間接促進異檸檬酸流向乙醛酸循環(huán)。此外，還可以利用代謝組學分析，探明乙醇酸合成途徑中的碳源分配，從而針對性地開展代謝改造，增加乙醇酸合成途徑的代謝流/碳通量[33]。同時，高密度培養(yǎng)及發(fā)酵優(yōu)化也是本研究后續(xù)為提高乙醇酸生物合成所需要進行的研究。