利用畢赤酵母底盤產(chǎn)生大麻二酚酸合成酶及其催化活性分析

牛庭莉，田 媛，張利國(guó)，張樹(shù)權(quán)，李志江，康 悅，遲 建，高寶昌,，戴凌燕,

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省科學(xué)院大慶分院植物化學(xué)研究所，黑龍江大慶 163316；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，黑龍江哈爾濱 150086；4.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

大麻是一年生麻科草本植物，被稱為大麻或漢麻，在世界各地種植已有數(shù)千年，主要應(yīng)用在醫(yī)藥、化工和食品領(lǐng)域[1-2]。天然產(chǎn)物大麻素是大麻植物產(chǎn)生的獨(dú)特次級(jí)代謝物，主要存在于大麻的毛狀體油室中，是由聚酮和單萜亞結(jié)構(gòu)組成。目前為止，已分離出100 多種大麻素[3]。其中，酸性大麻素四氫大麻酚酸（THCA）、大麻二酚酸（CBDA）和大麻環(huán)萜酚酸（CBCA）含量最豐富，且三者均以CBGA 為底物經(jīng)酶催化而成。其他類型大麻素大多是由這三種物質(zhì)在熱和光照下通過(guò)非酶轉(zhuǎn)化、降解反應(yīng)和自氧化等方式獲得[4-5]。在這些代謝物中，具有精神活性的Δ9-四氫大麻酚（THC）[6]，由于具有潛在的治療價(jià)值，包括鎮(zhèn)痛、抗驚厥、止吐和開(kāi)胃性而備受關(guān)注[7-8]。大麻二酚（CBD）是一種與THC 具有不同環(huán)狀結(jié)構(gòu)的同分異構(gòu)體，近年來(lái)在治療阿爾茲海默病、帕金森病、癲癇，以及抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)等方面發(fā)揮著重要作用[9-11]。此外，CBD 在食品和化妝品上的應(yīng)用也比較廣泛。CBD 油可緩解焦慮，CBD 糖漿可以安神和緩解疼痛，CBD 蘇打水可以舒緩?fù)窗Y和調(diào)節(jié)亞健康問(wèn)題；還有加入適量CBD 的餅干、巧克力、啤酒、披薩等食品，具有獨(dú)特香氣，讓人身心愉悅[12]；含有CBD 的化妝品具有舒緩皮膚敏感，抗炎及治療粉刺等作用[13]。但目前CBD 原料短缺、價(jià)格高昂、生物提取得率低等問(wèn)題，限制了其產(chǎn)業(yè)發(fā)展和應(yīng)用領(lǐng)域拓展。

酵母表達(dá)系統(tǒng)在上個(gè)世紀(jì)70 年代被發(fā)現(xiàn)，在2006 年經(jīng)美國(guó)FDA 批準(zhǔn)，獲得“最安全微生物”稱號(hào)[14-15]。畢赤酵母（Pichia pastoris）是在甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的一種甲基營(yíng)養(yǎng)菌，可利用AOX1 啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)外源蛋白的高水平表達(dá)[16-17]。酵母異源表達(dá)系統(tǒng)有許多優(yōu)點(diǎn)，發(fā)酵培養(yǎng)基取材穩(wěn)定、成本低廉、繁殖快速；與細(xì)菌相比，具有翻譯后修飾，易于遺傳操作等優(yōu)勢(shì)[18]。外源目的基因線性化后，利用同源重組方式可將外源基因高效整合到酵母細(xì)胞的染色體中，產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系[19-23]。

大麻二酚酸合成酶（CBDAS）可催化底物CBGA生成CBDA，而CBDA 在高溫下易脫羧形成CBD。以大麻花葉為材料生物提取大麻素的粗提液中含有很多組分，其中還有一定含量的CBGA 未被完全轉(zhuǎn)化。若能利用操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)高效的方法獲得CBDAS，便可通過(guò)體外反應(yīng)將粗提液中殘存的CBGA 進(jìn)一步單一轉(zhuǎn)化成CBD。本研究以高含量CBD 品種為材料，采用PCR 克隆技術(shù)獲得CBDAS基因，并構(gòu)建酵母表達(dá)載體，在畢赤酵母中重組表達(dá)，利用高效液相色譜分析CBDAS 合成酶的催化活性。研究結(jié)果可為工業(yè)化定向提高CBD 生物提取率奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大麻材料 由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物所提供；畢赤酵母GS115 和大腸桿菌DH5α感受態(tài)購(gòu)自昂羽生物技術(shù)（上海）有限公司；pPIC9K-His 載體 購(gòu)自淼靈生物技術(shù)（武漢）有限公司；GreenGate克隆載體C000 本實(shí)驗(yàn)室保存；植物DNA 提取試劑盒 天根生化科技（北京）公司；質(zhì)粒提取試劑盒索萊寶科技（北京）有限公司；膠回收試劑盒 Omega（美國(guó)）公司；限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI、SacI 和PstI NEB（美國(guó)）公司；高保真酶Phanta Super-Fidenlity DNA Polymerase 諾唯贊生物科技（南京）有限公司；ThunderbirdTM SYBR? qPCR Mix TOYOBO（日本）公司。

5428 高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)艾本德公司；Veriti96梯度PCR 擴(kuò)增儀 美國(guó)賽默飛公司；HB-96D 恒溫槽 韓國(guó)WiseTherm 公司；HV-50 高壓蒸汽滅菌器 日本Hirayama 公司；V-1300 可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海美析儀器公司；NS-100B 恒溫振蕩搖床 杭州川恒實(shí)驗(yàn)儀器公司；CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀 美國(guó)伯樂(lè)公司；1260 高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大麻基因組提取 稱取適量高CBD 含量的大麻葉片經(jīng)液氮研磨后，按照植物DNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取總基因組。使用NanoDrop2000 檢測(cè)DNA 濃度和質(zhì)量。DNA 保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2CBDAS基因的克隆 使用Primer3 plus（https://www.primer3plus.com/）在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)特異引物。以大麻基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)選用高保真聚合酶進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共32 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠，按照膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行純化。將純化產(chǎn)物與C000 載體連接生成C000-CBDAS 載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)后選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。引物合成和測(cè)序均由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用Snapgene 軟件將測(cè)序后的CBDAS基因序列翻譯成氨基酸，利用在線軟件Expasy（https://www.expasy.org/）中的ProtParam-和ProtScale 分析CBDAS 蛋白的基本理化性質(zhì)和親/疏水性，利用Smart（http://smart.embl-heidelberg.-de/）和NCBI 的CD-search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）在線軟件分析CBDAS 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，利用NetNGlyc-1.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0）在線軟件分析CBDAS蛋白的糖基化位點(diǎn)。

1.2.4 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 設(shè)計(jì)含有NotI 和EcoRI酶切位點(diǎn)的特異性引物ppCBDAs-F 和ppCBDAs-R，保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)用下劃線表示（見(jiàn)表1）。以C000-CBDAS 質(zhì)粒為模板，用帶接頭引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收。使用NotI 和EcoRI 酶分別對(duì)回收產(chǎn)物和pPIC9K載體進(jìn)行雙酶切，純化后連接成pPIC9K-CBDAS 質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過(guò)測(cè)序和酶切鑒定篩選陽(yáng)性克隆。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.5 酵母轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性重組菌的篩選 將重組質(zhì)粒pPIC9K-CBDAS 經(jīng)SacI 限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化，再通過(guò)電轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入畢赤酵母GS115 感受態(tài)中；將細(xì)胞液均勻涂布于MD 固體培養(yǎng)基上，于30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。參考趙明明等[24]方法，用去離子水沖洗平板上的菌落并收集，吸取200 μL 菌液涂布于不同G418 濃度（1、2、4、6 mg/mL）的YPD 平板上，于30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。挑取YPD 平板上的單克隆，采用高溫-乙酸乙酯法提取酵母基因組[25]；以AOX1-F 和CBDAS-R 為引物進(jìn)行PCR 鑒定。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 15 s，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 參考盧可心[26]方法，挑取鑒定為陽(yáng)性的重組菌接種至YPD 液體培養(yǎng)基，于30 ℃、190 r/min過(guò)夜培養(yǎng)；將活化的菌液按1%接種于20 mL BMGY 培養(yǎng)基，于30 ℃、190 r/min培養(yǎng)至OD600為2～6 時(shí)，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算酵母菌數(shù)量，收集菌體后用BMMY 培養(yǎng)基重懸至菌數(shù)約為8.0×109個(gè)/mL，再于30 ℃、190 r/min 培養(yǎng)，每隔24 h 補(bǔ)充1%體積比的甲醇，連續(xù)誘導(dǎo)96 h。每組3 個(gè)重復(fù)，取菌體破碎后進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

1.2.7 Western blot 分析 將pPIC9K-CBDAS 重組蛋白通過(guò)SDS-PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h 后，用TBST 沖洗表面。將PVDF 膜轉(zhuǎn)至含有His 抗體（1:5000）的TBST中，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 搖晃清洗6 次（5 min/次）后移至含有HRP 標(biāo)記的二抗TBST 中（1:4000），室溫孵育2 h，TBST 搖晃清洗6 次（5 min/次）。最后用ECL 超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒和成像分析儀檢測(cè)條帶。

1.2.8 熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)基因表達(dá)情況

培養(yǎng)方法同1.2.6，在誘導(dǎo)48 h 后收集酵母菌，用Trizol 法提取總RNA，核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA 濃度及純度，符合A260/A280=1.8～2.1 后用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)條件：37 ℃，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min；4 ℃，保存。采用SYBR? Green Realtime PCR MasterMix 進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，共39 個(gè)循環(huán)，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)完成后，確認(rèn)擴(kuò)增曲線及融解曲線，導(dǎo)出ct 值，以畢赤酵母菌的Actin基因?yàn)閮?nèi)參，相對(duì)定量用2-?Ct來(lái)分析基因的表達(dá)水平[27]。

1.2.9 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條件篩選 選取可以成功表達(dá)的重組菌株進(jìn)行后續(xù)篩選，誘導(dǎo)時(shí)間為0、12、24、48、72、96 h；誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY 的pH 分別為3.0、4.5、6.0、6.5、7.0、7.5；甲醇添加量為0.5%、0.75%、1%、2%、4%，為保證甲醇濃度不變，每隔24 h 再次添加；具體操作同1.2.6，每組三個(gè)重復(fù)。

1.2.10 CBDAS 酶活性測(cè)定

1.2.10.1 大麻萜酚酸（CBGA）的提取 取高CBGA含量大麻品種的烘干葉片，每0.1 g 中加入50 mL 甲醇，超聲破碎30 min 后，4 ℃離心20 min 收集上清液，再用0.22 μm 濾膜去除雜質(zhì)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.10.2 反應(yīng)液的制備 反應(yīng)體系參照修改的Taura等[28]方法，體系一中加入100 μL CBGA 粗提液，0.5 μL TritionX-100，超濾濃縮后的重組蛋白液25 μg，用0.1 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液（pH5.0）定容至500 μL。在37 ℃反應(yīng)0、2、4、8、12 h 后，加入600 μL甲醇終止反應(yīng)，每組三次重復(fù)；將反應(yīng)液離心3 min，取上清，過(guò)0.22 μm 濾膜，用于HPLC 檢測(cè)；體系二中將CBGA 粗提液換成終濃度為25 μmol/L CBGA標(biāo)準(zhǔn)品，在37 ℃反應(yīng)12 h 后，加入600 μL 甲醇終止反應(yīng)，其余成分和反應(yīng)過(guò)程均和體系一相同。通過(guò)產(chǎn)生CBDA 和CBD 的含量來(lái)反映酶的生物活性。

1.2.10.3 液相色譜條件 色譜柱：Shimadzu sil-16 C18柱（150 mm×4.6 mm×3 μm），柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A 為水溶液中含有0.1%甲酸，B 為乙腈中含有0.1%甲酸；等度洗脫：25% A，75% B，保留時(shí)間30 min；紫外檢測(cè)器：230 nm；流速：0.7 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

DNA 序列和氨基酸序列數(shù)據(jù)用Snapgene 軟件處理。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS23.0 和Prism 5.0 進(jìn)行分析作圖，采用單因素方差分析比較各組間數(shù)據(jù)，t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間差異顯著性分析，P<0.05 差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CBDAS 基因的克隆

以大麻的基因組為模板，使用引物CBDASF 和CBDAS-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳圖如圖1。通過(guò)測(cè)序可知CBDAS基因全長(zhǎng)1635 bp，編碼544 個(gè)氨基酸，Taura 等[28]在克隆纖維型大麻CBDAS基因時(shí)，也得出該基因編碼544 個(gè)氨基酸的結(jié)論。將克隆的CBDAS基因序列信息提交到NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào)OP627908），但與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)已公布大麻CBDAS基因序列（登錄號(hào)NC_044378.1）比較，有6 處堿基不同，引起2 個(gè)氨基酸發(fā)生改變（Cys-Tyr和Lys-Gln），其余4 個(gè)為同義突變（圖2）?？梢?jiàn)，不同大麻品種間CBDAS基因存在差異。

圖1 CBDAS 基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of CBDAS gene

圖2 CBDAS 基因序列比對(duì)Fig.2 Alignments of CBDAS gene sequences

2.2 CBDAS 蛋白的生物信息學(xué)分析

利用在線分析軟件ProtParam 預(yù)測(cè)了大麻CBDAS蛋白的基本理化性質(zhì)。結(jié)果表明，CBDAS 蛋白分子量為62.3 kD，理論等電點(diǎn)pI 為8.84；具有51 個(gè)酸性氨基酸殘基（Asp+Glu），59 個(gè)堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）；分子式為C2843H4351N745O793S20；在酵母中估算的半衰期大于20 h。此外，CBDAS 蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為29.28（小于40 屬于穩(wěn)定蛋白），親水性平均系數(shù)（Grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.219，因此，CBDAS 是穩(wěn)定的親水性蛋白。常麗等[29]利用ProtPScale 軟件預(yù)測(cè)大麻品種Carmen的CBDAS 蛋白時(shí)，得出其不穩(wěn)定系數(shù)為30.57，GRAVY 為-0.202，與本研究的結(jié)論相似。利用NetNGlyc-1.0 在線軟件分析發(fā)現(xiàn)CBDAS 蛋白存在7 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別是位于45、65、168、296、304、328、498 位的天冬酰胺。利用Smart 和NCBI的CD-search 軟件分析CBDAS 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，兩者結(jié)果一致（圖3），氨基酸479-537 范圍的結(jié)構(gòu)域?yàn)锽BE，存在于小檗堿橋和小檗堿橋樣酶中，這些酶參與許多異喹啉生物堿的生物合成；而81-218 結(jié)構(gòu)域家族由多種利用FAD 作為輔助因子的酶組成，大多數(shù)酶類似于氧化還原酶。

圖3 CBDAS 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Analysis of conservative domains of CBDAS protein

2.3 重組酵母表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

以C000-CBDAS 為模板，以ppCBDAS-F/R 為引物，擴(kuò)增獲得的CBDAS基因片段大小約為1635 bp。CBDAS基因回收產(chǎn)物與酵母表達(dá)載體pPIC9K 用EcoRI 和NotI 分別進(jìn)行雙酶切，經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化后進(jìn)行鑒定。用AOX-F 引物對(duì)載體進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)后表明序列正確。再用SacI 限制性內(nèi)切酶對(duì)測(cè)序正確的重組子進(jìn)行線性化，再用PstI 酶切，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，可見(jiàn)5297、2555、1827 和1241 bp等不同片段（圖4）。測(cè)序和酶切驗(yàn)證后表明，重組酵母表達(dá)載體pPIC9K-CBDAS 構(gòu)建成功。

圖4 重組酵母表達(dá)載體pPIC9K-CBDAS 的酶切鑒定Fig.4 Enzymatic digestion identification of recombinant yeast expression vector pPIC9K-CBDAS

2.4 畢赤酵母轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性重組菌篩選

將線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115 感受態(tài)中，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，再利用不同濃度G418 篩選高拷貝菌后，挑取單菌落提取基因組DNA，用pPIC9K載體中AOX1 和CBDAS基因序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得2002 bp 的條帶（圖5），表明pPIC9KCBDAS 質(zhì)粒已經(jīng)整合到畢赤酵母GS115 的染色體中。

圖5 重組酵母菌株P(guān)CR 鑒定Fig.5 PCR identification of the recombinant yeast

2.5 Western blot 和qRT-PCR 驗(yàn)證重組蛋白表達(dá)

以酵母菌的Actin基因?yàn)閮?nèi)參，經(jīng)qRT-PCR 分析后發(fā)現(xiàn)，在以水為陰性對(duì)照（CK）和轉(zhuǎn)入空載體pPIC9K 的酵母菌中，均未檢測(cè)到CBDAS基因的表達(dá)，而在重組菌中有該基因的表達(dá)（圖6A）。Western blot 分析顯示，重組蛋白CBDAS 在畢赤酵母中能正常表達(dá)，在75 kD 處具有特異性條帶，而在導(dǎo)入空載體酵母菌中無(wú)表達(dá)（圖6B），比利用Protparam 軟件預(yù)測(cè)的蛋白分子質(zhì)量（62.3 kD）略大，在前面糖基化位點(diǎn)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)CBDAS 蛋白存在多個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，推測(cè)該酶在酵母表達(dá)中可能發(fā)生糖基化修飾而導(dǎo)致分子量變大。姚昌陽(yáng)等[30]也在利用畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)裂解多糖單加氧酶（LPMO）的研究中發(fā)現(xiàn)，重組的LPMO 蛋白條帶大小范圍為46～50 kD，比預(yù)測(cè)的分子量34 kD 大，認(rèn)為該蛋白發(fā)生了糖基化修飾。

圖6 qRT-PCR 基因表達(dá)分析和重組蛋白的Western blot 驗(yàn)證Fig.6 Gene expression analysis by qRT-PCR and Western blot validation of the recombinant protein

2.6 重組CBDAS 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條件篩選

pPIC9K 為分泌型載體，理論上應(yīng)會(huì)在胞外分泌出大量重組蛋白。但可能由于多肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集，導(dǎo)致加工以及囊泡運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程影響外源蛋白分泌表達(dá)，從而使一定量外源蛋白仍滯留在胞內(nèi)[31]。由于上清中CBDAS 蛋白較少所以收集菌體經(jīng)超聲破碎后的蛋白用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為使重組CBDAS 蛋白高效表達(dá)，對(duì)主要影響其表達(dá)的誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇濃度和誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY 的pH 等因素進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖7。誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇濃度和培養(yǎng)基的pH 對(duì)重組蛋白表達(dá)確有較大影響，重組菌在培養(yǎng)48 h，誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH6.0，1%甲醇添加量時(shí)表達(dá)量最大。

圖7 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的條件篩選Fig.7 Screening conditions for inducing expression of recombinant protein

2.7 CBDAS 酶活性分析

將轉(zhuǎn)入空載體pPIC9K 酵母菌株和導(dǎo)入目的基因的重組酵母菌株pPIC9K-CBDAS 同時(shí)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY（pH6.0），1%甲醇添加量下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，48 h 后收集菌體經(jīng)超聲破碎收集上清液，用超濾管進(jìn)行濃縮制備成待測(cè)酶液，利用BCA 試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，畢赤酵母重組酶活性測(cè)定如圖8。反應(yīng)體系的總體積保持不變，設(shè)置一組只加底物不加酶液的空白對(duì)照（CK），另兩組分別加入pPIC9K 和pPIC9K-CBDAS 重組菌株提取的酶液。當(dāng)使用大麻葉片粗提液中CBGA 為底物發(fā)生反應(yīng)時(shí)，由于粗提液中含有CBDA 和CBD，因此，在0 h 時(shí)三組均會(huì)檢測(cè)到這兩種物質(zhì)。隨著反應(yīng)時(shí)間增加（0～12 h），CK 組和pPIC9K 組的CBDA 和CBD 的含量略微下降，但差異不顯著。對(duì)于pPIC9K-CBDAS 組來(lái)說(shuō)，反應(yīng)2 h 后，CBDA 和CBD 的含量未發(fā)生顯著變化；當(dāng)反應(yīng)4 h 后，CBDA 含量顯著增加（P<0.05）；在8h 后CBD 含量顯著增加（P<0.05），12 h 時(shí)生成的CBDA 和CBD 含量達(dá)到最大值；在重組酶CBDAS作用下，新合成CBDA 60.64 ng/mL，CBD 128.01 ng/mL，分別比pPIC9K 組的高15.67 倍和37.87 倍（圖8A～圖8E）。為進(jìn)一步確定重組CBDAS 的生物活性，減少大麻葉片粗提液中其他物質(zhì)對(duì)反應(yīng)的干擾，以CBGA 標(biāo)準(zhǔn)品為底物，反應(yīng)12 h 后分析重組酶催化底物CBGA 產(chǎn)生CBDA 和CBD 的情況，結(jié)果如圖8F。CK 組和pPIC9K 組中未檢測(cè)到CBDA，但有CBD 檢出，這是因?yàn)镃BGA 標(biāo)準(zhǔn)品中含有少量的CBD 而導(dǎo)致；pPIC9K-CBDAS 組中新合成CBDA 20.12 ng/mL，CBD 207.87 ng/mL，CBD 含量比pPIC9K組高9.34 倍。CBDAS 酶和底物發(fā)生反應(yīng)直接生成CBDA，但當(dāng)反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)于4 h 后，CBDA就會(huì)發(fā)生脫羧反應(yīng)生成CBD，所以在8 和12 h 時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的CBD。由上可知，通過(guò)畢赤酵母重組產(chǎn)生大麻的CBDAS 無(wú)論在大麻葉片粗提液還是標(biāo)準(zhǔn)品中，都可以催化底物CBGA 生成CBDA 和CBD。經(jīng)對(duì)比，以CBGA 標(biāo)準(zhǔn)品為底物的轉(zhuǎn)化效率明顯低于大麻葉片粗提液，這可能由于在CBGA粗提液中含有的復(fù)雜物質(zhì)成分所致，可促進(jìn)CBDAS酶催化活性，并增強(qiáng)CBDA 脫羧作用。

圖8 重組酶催化底物CBGA 產(chǎn)生CBDA 和CBD 的情況Fig.8 Production of CBDA and CBD by catalyzing substrate CBGA by the recombinant enzyme

3 結(jié)論

大麻品種間CBDAS基因存在差異，從而使蛋白的基本理化性質(zhì)發(fā)生改變，本研究中克隆得到CBDAS經(jīng)生信預(yù)測(cè)認(rèn)為是一種穩(wěn)定的親水性蛋白。目前，人們多以大麻花葉為材料來(lái)提取大麻素，存在季節(jié)依賴、周期長(zhǎng)、純度低等問(wèn)題，且在提取CBD 過(guò)程中會(huì)浪費(fèi)粗提液中尚存的CBGA。利用經(jīng)濟(jì)高效的方法獲得CBDAS，便可通過(guò)體外反應(yīng)將粗提液中殘存的CBGA 進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成CBD。本文通過(guò)構(gòu)建酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母獲得重組菌，經(jīng)qTRPCR 和Western blot 驗(yàn)證后認(rèn)為CBDAS基因可在酵母中得到表達(dá)。而重組菌在培養(yǎng)48 h、培養(yǎng)基pH6.0 和1%甲醇添加量等誘導(dǎo)條件下CBDAS 蛋白表達(dá)量最大。通過(guò)畢赤酵母重組產(chǎn)生大麻的CBDAS無(wú)論在大麻葉片粗提液還是標(biāo)準(zhǔn)品中，都可以催化底物CBGA 生成CBDA 和CBD，具有很強(qiáng)的生物活性。研究結(jié)果為今后CBD 在醫(yī)療、食品和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。重組CBDAS合成酶在大麻葉片粗提液中的催化活性高于CBGA標(biāo)準(zhǔn)品，其具體原因還有待于進(jìn)一步研究。