傳統(tǒng)酸粥中乳酸菌的分離篩選及其體外抗氧化能力分析

林瑛蘭，張 悅，李 闊，丁 敏，常學(xué)東，鄒 靜

（河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北秦皇島 066000）

酸粥是我國山西河曲和內(nèi)蒙古等地具有地方特色且口感獨特的傳統(tǒng)美食，它是一種用糜米作為主要原料經(jīng)過微生物自然發(fā)酵而形成的發(fā)酵食品[1]。目前酸粥相關(guān)研究的焦點匯聚于酸粥的營養(yǎng)成分分析及其微生物群落結(jié)構(gòu)，例如郭璞等[2]通過比較分析發(fā)酵的小米酸粥和普通小米粥二者的營養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵小米酸粥中的多酚物質(zhì)和蛋白含量顯著高于未經(jīng)發(fā)酵的小米粥，而淀粉含量則顯著降低，說明經(jīng)過發(fā)酵的小米酸粥與未經(jīng)發(fā)酵的小米粥相比營養(yǎng)價值更高；烏有娜等[3]對酸粥發(fā)酵過程中不同階段的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，并進(jìn)一步探索不同發(fā)酵階段的微生物群落與理化指標(biāo)的變化關(guān)聯(lián)性。盡管酸粥的營養(yǎng)價值高，但是目前沒有形成成熟的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，基本是家庭作坊式的自然發(fā)酵的生產(chǎn)方式[4]。由于自然發(fā)酵的生產(chǎn)環(huán)境相對開放，加之生產(chǎn)工藝、地理環(huán)境和氣候條件等因素差異，容易造成酸粥中微生物類群結(jié)構(gòu)、酸粥品質(zhì)及其營養(yǎng)成分出現(xiàn)參差不齊的情況[5]。因此，為保證酸粥穩(wěn)定高效的生產(chǎn)，應(yīng)打破傳統(tǒng)自然發(fā)酵的局限，采用純種發(fā)酵以確保酸粥品質(zhì)的穩(wěn)定，從而實現(xiàn)酸粥工業(yè)化生產(chǎn)。

乳酸菌是一類可以利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱。乳酸菌是一種益生菌，被公認(rèn)為“Generally Recognized as Safe（GRAS）”等級的食品微生物[6]。研究表明，乳酸菌具有抗氧化[7]、降高血壓[8]、降膽固醇[9]和防治乳糖不耐癥[10]等益生功能，以其優(yōu)異的益生特性被廣泛應(yīng)用于果蔬深加工、乳制品和肉制品等食品的生產(chǎn)中[11]。以乳酸菌作為發(fā)酵劑生產(chǎn)的谷物食品，其加工特性、功能特性和營養(yǎng)成分均會得到良好的改善；風(fēng)味和口感變得更加柔和，也更利于消費者接受。因此，本文以傳統(tǒng)開放式發(fā)酵的酸粥為載體分離篩選乳酸菌，以耐受能力為進(jìn)一步篩選指標(biāo)選出性狀優(yōu)良的乳酸菌，并對其進(jìn)行種屬鑒定，同時對菌株的自凝能力以及體外抗氧化能力進(jìn)行分析，為純種發(fā)酵制備酸粥提供優(yōu)良菌株，也為酸粥優(yōu)良發(fā)酵菌株的篩選提供一定參考依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸粥 市售；胃蛋白酶（3000 U/g）、胰蛋白酶（250 U/g）、牛膽鹽 上海源葉生物科技有限公司；DPPH（2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基，純度≥97%）、鄰苯三酚 分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；30%過氧化氫、硫酸亞鐵、鄰菲羅啉 分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、氫氧化鈉 分析純，天津化學(xué)試劑有限公司。

800 電動離心機 上海梅香儀器有限公司；UV 2600A 紫外可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司；SQ510C 立式壓力蒸汽滅菌器 重慶雅馬拓科技有限公司。

1.2.1 乳酸菌的分離純化 取1 mL 酸粥樣品于9 mL 無菌生理鹽水中振蕩均勻，梯度稀釋后吸取100 μL 涂布在1% CaCO3-MRS 固體培養(yǎng)基上，放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑選在CaCO3-MRS固體培養(yǎng)基上形成溶鈣圈的菌落于MRS 固體培養(yǎng)基上反復(fù)劃線進(jìn)行純化，直到菌株的菌落形態(tài)一致并進(jìn)行革蘭氏染色實驗，所得革蘭氏陽性菌被初步判定為乳酸菌。將純化的乳酸菌接種于MRS 斜面培養(yǎng)基于4 ℃保存，并將菌株與20%甘油接入凍存管中，混合均勻后于-80 ℃保藏[12]。

1.2.2 菌懸液的制備 將菌株從MRS 斜面培養(yǎng)基接入MRS 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)18 h 得到發(fā)酵液后，在4000 r/min 的條件下離心10 min，棄去上清液得到菌體，隨后加入與液體培養(yǎng)基等量的無菌生理鹽水離心洗滌菌體，重復(fù)洗滌3 次后重懸，將懸液濃度調(diào)整為1.0×108CFU/mL 即得菌懸液[13]。

1.2.3 乳酸菌產(chǎn)酸能力的鑒定 將溶鈣圈較大的菌株菌懸液以2%（v/v）的接種量接入MRS 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)24 h 后得到發(fā)酵液，發(fā)酵液用無CO2蒸餾水稀釋10 倍并滴入兩滴酚酞指示劑，用標(biāo)定好的0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液滴定至粉紅色且30 s不褪色作為滴定終點，記錄所消耗的氫氧化鈉溶液體積，作為空白對照的是沒有接種乳酸菌的MRS 液體培養(yǎng)基[14]。按照公式（1）計算乳酸菌的產(chǎn)酸量。

式中：X 表示乳酸菌產(chǎn)酸量，g/100 mL；V1表示樣液消耗氫氧化鈉溶液體積，mL；V2表示空白培養(yǎng)基消耗氫氧化鈉溶液體積，mL；C 表示標(biāo)定好的氫氧化鈉溶液濃度，mol/L；M 表示發(fā)酵液體積，mL；F 表示發(fā)酵液稀釋倍數(shù)；0.09 表示乳酸的換算系數(shù)。

1.2 實驗方法

1.2.4 乳酸菌的復(fù)篩

1.2.4.1 耐酸能力測定 將菌株菌懸液以2%（v/v）的接種量分別接種于pH 為3.0 的MRS 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)3 h，分別在0 h 和3 h 取樣，稀釋涂布于MRS 固體培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行平板計數(shù)[15]。按照公式（2）計算乳酸菌耐酸能力。

式中：N3表示培養(yǎng)3 h 的活菌數(shù)，CFU/mL；N0表示培養(yǎng)0 h 的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.4.2 耐膽鹽能力測定 將菌株菌懸液以3%（v/v）的接種量分別接種于含有0.3%牛膽鹽和未添加牛膽鹽的MRS 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)24 h 后測定OD600nm值[16]。按照公式（3）計算乳酸菌耐膽鹽能力。

式中：A1表示在含有0.3%牛膽鹽的MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 的OD600nm值；A0表示在不添加牛膽鹽的MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 的OD600nm值。

1.2.4.3 人工模擬胃腸液耐受能力測定 人工模擬胃液：0.35 g 胃蛋白酶溶于100 mL 0.2%的無菌生理鹽水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 至3.0 后過濾除菌[17]。人工模擬腸液：1 g/L 的胰蛋白酶和3 g/L 的膽鹽溶解在0.85%生理鹽水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至8.0 后過濾除菌[18]。

將1 mL 菌株菌懸液分別加到9 mL 的人工模擬胃液中，充分混合均勻后在37 ℃下培養(yǎng)3 h，分別在0 h 和3 h 取樣進(jìn)行平板計數(shù)，計算各菌株對人工模擬胃液的耐受能力。在9 mL 人工模擬腸液中加入1 mL 經(jīng)過人工模擬胃液處理3 h 的菌液，37 ℃下培養(yǎng)8 h，分別在4 h 和8 h 取樣稀釋涂布，在37 ℃培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行平板計數(shù)，計算各菌株對人工模擬腸液的耐受能力[19]。按照公式（4）計算乳酸菌對人工模擬胃腸液的耐受能力。

式中：N 表示經(jīng)過人工模擬胃腸液處理后的活菌數(shù)，CFU/mL；N0表示未經(jīng)過人工模擬胃腸液處理的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.5 菌株的自凝集力 調(diào)整菌株菌懸液的OD600nm值約為1.0，將其在室溫條件下靜置，分別測定靜置3、6、9 h 后的上層溶液OD600nm值。按照公式（5）計算自凝集率[20]。

式中：A2表示靜置后的OD600nm值；A0表示靜置前的OD600nm值。

1.2.6 菌株的過氧化氫耐受能力 將三株乳酸菌菌懸液以2%（v/v）的接種量分別接種在含有濃度為0.4、0.7 和1.0 mmol/L H2O2的MRS 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行平板計數(shù)，作為空白對照的是未添加H2O2的MRS 液體培養(yǎng)基[21]。

1.2.7 菌株的抗氧化能力

1.2.7.1 發(fā)酵上清液和完整細(xì)胞懸液的制備 將菌株接入MRS 液體培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)24 h 后，將發(fā)酵液在4000 r/min 條件下離心10 min，所得上清液即為發(fā)酵上清液；用PBS 緩沖溶液（pH7.4）離心洗滌菌體2 次后重懸即為完整細(xì)胞懸液[22]。

1.2.7.2 DPPH 自由基清除能力測定 取2 mL 待測樣品與2 mL 的0.2 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液充分混勻，避光反應(yīng)30 min，于517 nm 處測定吸光度[23]。按公式（6）計算DPPH 自由基清除能力。

式中：Ar表示樣品+DPPH-無水乙醇溶液的吸光度；As表示樣品+無水乙醇的吸光度；At表示蒸餾水+DPPH-無水乙醇的吸光度。

1.2.7.3 羥自由基清除能力測定 在試管中加入1 mL 的待測樣品，再逐次加入1 mL 的2.5 mmol/L鄰菲羅啉、PBS 緩沖液、2.5 mmol/L FeSO4溶液和20 mmol/L H2O2，將其充分混勻后在37 ℃反應(yīng)90 min，于536 nm 處測定吸光度[24]。按公式（7）計算羥自由基清除能力。

式中：Ak表示樣品的吸光度；Aj表示蒸餾水代替樣品和H2O2的吸光度；Ai表示蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.7.4 超氧陰離子清除能力測定 在試管中加入0.1 mL 待測樣品和4.5 mL 的50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH8.0），將其振蕩均勻之后在25 ℃下水浴20 min，接著加入0.4 mL 的25 mmol/L 鄰苯三酚溶液繼續(xù)水浴5 min，然后迅速滴加兩滴8 mmol/L的HCl 溶液以終止反應(yīng)，于320 nm 處測定吸光度[25]。按公式（8）計算超氧陰離子清除能力。

式中：Am表示樣品的吸光度；A 表示蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.8 菌株的生理生化試驗及分子生物學(xué)鑒定

1.2.8.1 菌株的生理生化試驗 以《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法》[26]作為篩選出的三菌株生理生化鑒定試驗的參考依據(jù)。

1.2.8.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定 將菌株L10、W10和Y3 送往華大基因進(jìn)行16S rDNA 和看家基因pheS的擴增與測序，16S rDNA 基因的PCR 擴增引物采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3'），pheS基因的PCR擴增引物采用引物p-F（5'-CCGTGAAGAACTGGAACA-3'）和p-R（5'-CC TAACCCAAAGGCAAAA-3'）[27]，將得到的測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析，使用MEGA5 軟件進(jìn)行菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每項實驗重復(fù)三次，采用SPSS 23.0 軟件中的單因素方差分析和Duncan 多重比較法進(jìn)行數(shù)據(jù)間的分析，顯著性水平設(shè)定為0.05，采用Origin 2021 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 40 株乳酸菌產(chǎn)酸能力分析

乳酸菌的產(chǎn)酸能力是其重要的益生特性之一，因為代謝產(chǎn)生的有機酸可以降低腸道pH 和提高胃腸道消化酶活性，因此高產(chǎn)酸乳酸菌的應(yīng)用價值更高[28]。從傳統(tǒng)酸粥中分離出68 株具有溶鈣圈且革蘭氏染色為陽性的菌株被初步判定為乳酸菌。挑選溶鈣圈較大的40 株乳酸菌進(jìn)行產(chǎn)酸能力的測定，每株菌具體的產(chǎn)酸量見表1。從表1 可以看出，菌株Y14產(chǎn)酸量最大為13.41 g/100 mL，菌株L12 產(chǎn)酸量最小為5.67 g/100 mL。

表1 40 株乳酸菌產(chǎn)酸能力比較Table 1 Comparison the acid production capability of the 40 strains of lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌的復(fù)篩

2.2.1 耐酸乳酸菌的篩選 胃部進(jìn)食之后pH 會在2.5～3.5 的范圍內(nèi)波動，食物通常在胃部停留3 h 左右，故本文將初步篩選的40 株乳酸菌接入pH 為3.0 的MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h，以此篩選出具有高耐酸能力的乳酸菌，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，40 株乳酸菌的耐酸能力均在70%以上，其中有12 株耐酸能力≥95%。乳酸菌在低pH 條件下的耐受能力即耐酸能力是衡量乳酸菌益生特性的標(biāo)準(zhǔn)之一[29]，因此，選擇耐酸能力≥83%的25 株乳酸菌進(jìn)行下一步實驗。

表2 40 株乳酸菌耐酸能力比較Table 2 Comparison the acid tolerance of the 40 strains of lactic acid bacteria

2.2.2 耐膽鹽乳酸菌的篩選 乳酸菌能夠在腸道中存活并定殖是發(fā)揮其益生特性的前提，這就要求乳酸菌對膽鹽具有較強耐受力[30]。腸道中膽鹽的濃度波動范圍一般在0.03%～0.3%，因此將乳酸菌接入膽鹽濃度為0.3%的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，考察其膽鹽耐受能力，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，共有10 株乳酸菌對0.3%濃度的膽鹽耐受能力≥50%，其中最高為62.39%±0.49%，因此，選擇這10 株膽鹽耐受能力較強的乳酸菌進(jìn)行下一步實驗。

表3 25 株乳酸菌耐膽鹽能力比較Table 3 Comparison the bile resistance of the 25 strains of lactic acid bacteria

2.2.3 耐人工模擬胃腸液乳酸菌的篩選 雖然耐酸耐膽鹽實驗通過高酸和較高膽鹽濃度來模擬了人體腸胃環(huán)境，但是真正的人體腸胃環(huán)境中存在的胃蛋白酶和胰蛋白酶會水解微生物的菌體蛋白質(zhì)，甚至是抑制或殺死微生物[31]。因此，對10 株乳酸菌人工模擬胃腸液耐受能力進(jìn)行了分析，結(jié)果見表4。10 株乳酸菌經(jīng)過人工模擬胃液處理3 h 后活菌數(shù)均有下降，菌株L8 活菌數(shù)下降了1.3 lg CFU/mL，菌株W10 和K11 下降了0.5～1.0 lg CFU/mL，其余的菌株活菌數(shù)下降均小于0.5 lg CFU/mL。在人工模擬腸液處理階段，各菌株的耐受能力呈現(xiàn)出不同程度的持續(xù)下降，經(jīng)人工模擬腸液處理4 h 后，菌株L10、W10 和Y3 耐受能力下降范圍在13%～15%，其余菌株的耐受能力下降范圍在20%～31%。經(jīng)過人工模擬腸液處理8 h 之后，菌株Y3 的耐受能力最高為77.57%±0.73%，菌株L10 和W10 的耐受能力分別為76.16%±0.21%和72.86%±0.46%，其他菌株的耐受能力均低于70%。最終篩選出在人工模擬胃腸液環(huán)境中耐受能力好的3 株乳酸菌分別為菌株L10、W10 和Y3。

表4 10 株乳酸菌人工模擬胃腸液環(huán)境下的耐受能力分析Table 4 Analysis the tolerance of the 10 strains of lactic acid bacteria in simulated gastrointestinal fluid

2.3 三株乳酸菌自凝性及抗氧化能力分析

2.3.1 三株乳酸菌自凝集能力分析 一般情況下乳酸菌的自凝集能力越強，其對腸道上皮細(xì)胞的黏附能力越強，從而易形成遏制致病菌定殖和侵害的屏障[32]。本文將這三株乳酸菌分別靜置3、6 和9 h 后對其自凝集能力進(jìn)行測定，結(jié)果見表5。

表5 三株乳酸菌自凝集力比較Table 5 Comparison the self-agglutination ability of the three strains of lactic acid bacteria

由表5 可知，每株菌的自凝集率均表現(xiàn)為隨著靜置時間的延長呈現(xiàn)不同幅度的升高，菌株L10 升高的幅度最大。靜置3 h 后，菌株L10 的自凝集率最高為17.95%±0.22%，菌株W10 和Y3 的自凝集率差異不顯著（P>0.05）。在靜置6 h 和9 h 后，菌株L10 相較于菌株W10 和Y3 表現(xiàn)出更優(yōu)異的自凝集能力，自凝集率分別為40.06%±0.17%和48.86%±0.97%，而菌株Y3 的自凝集率最低分別為22.51%±1.26%和27.63%±0.53%。因此，菌株L10 與另外兩株菌相比，在腸道中可能表現(xiàn)出更強的黏附能力。

2.3.2 三株乳酸菌對過氧化氫耐受能力分析 當(dāng)乳酸菌遭受氧化劑H2O2的脅迫時，可激發(fā)氧化防御系統(tǒng)產(chǎn)生各種酶以此來減輕氧化損傷，因此H2O2耐受能力可以作為乳酸菌抗氧化活性的一個衡量指標(biāo)[33]。本研究將三株乳酸菌分別接種在含有不同濃度H2O2的MRS 液體培養(yǎng)基中，考察這三株乳酸菌對H2O2的耐受能力，其活菌數(shù)結(jié)果見表6。

表6 三株乳酸菌對過氧化氫耐受能力比較Table 6 Comparison the ability to survive the hydrogen peroxide of the three strains of lactic acid bacteria

由表6 可知，三株菌在含有濃度為0.4、0.7、1.0 mmol/L H2O2的MRS 液體培養(yǎng)基中的活菌數(shù)與在未添加H2O2的培養(yǎng)基中的活菌數(shù)沒有顯著差異（P>0.05），可以看出三株菌在含有H2O2的MRS 液體培養(yǎng)基中的生長狀況良好，說明這三株菌對H2O2均具有一定的耐受能力。

2.3.3 三株乳酸菌株抗氧化能力分析 當(dāng)人體新陳代謝產(chǎn)生的自由基超出機體所能承受的范圍時會出現(xiàn)氧化應(yīng)激現(xiàn)象，造成人體衰老和引發(fā)多種與年齡相關(guān)的疾病[34-35]。因此本文對這三株乳酸菌的DPPH自由基、羥自由基以及超氧陰離子自由基清除能力進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1。

圖1 三株乳酸菌DPPH 自由基（a）、羥自由基（b）和超氧陰離子自由基（c）清除能力比較Fig.1 Comparison the scavenging ability of DPPH free radical(a),hydroxyl free radical (b) and superoxide anion (c) of the three strains of lactic acid bacteria.

由圖1 可知，每株菌均表現(xiàn)出發(fā)酵上清液與完整細(xì)胞懸液清除能力的不同，即發(fā)酵上清液清除能力高于完整細(xì)胞懸液的清除能力。菌株發(fā)酵上清液的DPPH 自由基清除率均在90%以上，菌株L10的DPPH 自由基清除率最高為95.27%±0.33%；完整細(xì)胞懸液中菌株W10 的DPPH 自由基清除率最高為27.53%±0.34%。李瀟等[36]對牦牛酸奶中分離得到的乳酸菌進(jìn)行抗氧化能力測定也發(fā)現(xiàn)菌株發(fā)酵上清液的DPPH 自由基清除能力高于完整細(xì)胞懸液。菌株Y3 發(fā)酵上清液和完整細(xì)胞懸液的羥自由基清除能力均最高，分別為51.26%±0.62%和24.83%±0.67%，菌株L10 和W10 完整細(xì)胞懸液的羥自由基清除能力差異不顯著（P>0.05），可以看出同樣是發(fā)酵上清液的羥自由基清除能力高于完整細(xì)胞懸液，這可能是乳酸菌的代謝分泌物中含有更多清除羥自由基的物質(zhì)[37]。菌株Y3 發(fā)酵上清液的超氧陰離子自由基清除能力最高為20.16%±0.51%，且與另外兩株菌差異顯著（P<0.05），王曦等[38]對不同乳酸菌超氧陰離子清除能力的研究中有7 株乳酸菌的清除能力在14%～20%之間，這與本實驗結(jié)果相近。

2.4 菌株的生理生化試驗及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.4.1 菌株的生理生化試驗結(jié)果 為進(jìn)一步鑒別篩選出來的菌株L10、W10 和Y3，參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法》進(jìn)行生理生化試驗，具體試驗結(jié)果見表7。

表7 三株乳酸菌的生理生化實驗結(jié)果Table 7 Physiological and biochemical results of three strains of lactic acid bacteria

由表7 可知，三株菌的過氧化氫酶實驗、吲哚實驗、甲基紅實驗、VP 實驗以及檸檬酸鹽實驗均為陰性，從中可以看出這三株菌均具有乳酸菌應(yīng)有的生理生化特性，因此進(jìn)一步證明這三株微生物為乳酸菌。

2.4.2 菌株的16S rDNA 和pheS基因序列比對分析

為了明確這三株乳酸菌具體的種屬分類，提取三株菌的基因組DNA，利用PCR 擴增技術(shù)得到PCR 產(chǎn)物，純化后進(jìn)行16S rDNA 測序，并在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行三株乳酸菌16S rDNA 序列比對分析，發(fā)現(xiàn)菌株L10、W10 和Y3 與植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）聚于一支，親緣關(guān)系更近，因此可以初步鑒定為植物乳植桿菌（圖2a）。但由于植物乳植桿菌（L.plantarum）與L.pentosus、L.argentoratensis和L.paraplantarum親緣關(guān)系極為接近，僅通過16S rDNA 序列比對分析并不能有效區(qū)分植物乳植桿菌（L.plantarum）及近緣種，因此，又對三株菌的看家基因pheS進(jìn)行了擴增并在NCBI 中進(jìn)行比對分析以進(jìn)一步確定這三株菌具體的分類學(xué)地位，結(jié)果如圖2b。通過比對發(fā)現(xiàn)，菌株L10、W10 和Y3 仍與L.plantarum單獨構(gòu)成一個分支，親緣關(guān)系最近，因此結(jié)合16S rDNA 和pheS序列的比對結(jié)果確認(rèn)菌株L10、W10 和Y3 為植物乳植桿菌（L.plantarum）。研究表明植物乳植桿菌（L.plantarum）具有改善機體免疫力、抑制腸道致病菌和維持腸道菌群平衡等益生功能，因其高度認(rèn)可的安全性和益生特性，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)化生產(chǎn)以提升產(chǎn)品品質(zhì)[39-40]。

圖2 菌株L10、W10 和Y3 的16S rDNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹（a）和pheS 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹（b）Fig.2 16S rDNA-based phylogenetic tree (a) and pheS-based phylogenetic tree (b) of the strains L10,W10 and Y3

3 結(jié)論

本研究從傳統(tǒng)酸粥中分離純化得到68 株乳酸菌，通過耐酸耐膽鹽以及人工模擬胃腸液耐受試驗，最終篩選得到三株性狀優(yōu)良的乳酸菌，并通過16S rDNA 和pheS序列比對鑒定為植物乳桿菌（L.plantarum）。菌株L10、W10 和Y3 的產(chǎn)酸量分別為12.11、12.58 和10.34 g/100 mL；在人工模擬胃腸液環(huán)境中的耐受能力分別為76.16%、72.86%和77.57%，相較于其他菌株表現(xiàn)出優(yōu)良的耐受能力；對1.0 mmol/L 過氧化氫均具有耐受能力；靜置9 h 后自凝集力分別為48.86%、30.14%和27.63%；同時還具備清除DPPH 自由基、羥自由基以及超氧陰離子自由基的能力。研究結(jié)果表明，菌株L10、W10 和Y3 具有產(chǎn)酸能力高、耐受能力強和抗氧化能力強的優(yōu)良特性，因此本實驗從傳統(tǒng)酸粥中篩選得到的三株乳酸菌可作為酸粥純種發(fā)酵的潛在益生菌。本研究未進(jìn)一步探索三株乳酸菌對酸粥營養(yǎng)成分、風(fēng)味的影響以及酸粥品質(zhì)的提升，接下來應(yīng)研究純種發(fā)酵酸粥與自然發(fā)酵酸粥二者營養(yǎng)成分和風(fēng)味的差異，并篩選其他性狀優(yōu)良的種屬微生物與之復(fù)配以全面提升酸粥品質(zhì)，也更利于酸粥的工業(yè)化生產(chǎn)。