豆血紅蛋白在釀酒酵母中的異源表達(dá)

薛常魯，張鵬飛，白麗君，肖功年，魏培蓮,

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州 310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310023）

豆血紅蛋白（Leghemoglobin，LegH）是豆科植物 感染根瘤菌后共同產(chǎn)生的植物源血紅蛋白[1-2]，由一條單鏈脫輔基蛋白和血紅素輔基構(gòu)成，三維結(jié)構(gòu)與動(dòng)物血紅蛋白高度相似[3]，在植物蛋白肉加工中可以作為風(fēng)味催化劑和著色劑，大大增加植物蛋白肉的擬真性[4-5]。目前，LegH 主要從大豆根瘤中提取獲得，但由于工藝復(fù)雜、植物種植周期長(zhǎng)、含量低等原因，生產(chǎn)成本較高，難以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。因此，利用微生物作為細(xì)胞工廠合成血紅蛋白是未來(lái)的發(fā)展方向[6]，包括豆血紅蛋白[7-9]、人血紅蛋白[10]、豬肌紅蛋白[11]在內(nèi)的多種血紅蛋白已實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)[12]。以畢赤酵母作為表達(dá)宿主的LegH 已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)作為“人造肉”中的著色劑[13-15]。但目前豆血紅蛋白異源表達(dá)的相關(guān)研究主要集中于大腸桿菌和畢赤酵母[8-9]。大腸桿菌的表達(dá)量較低[16]，存在形成包涵體、血紅素供應(yīng)不足等問題，同時(shí)細(xì)菌內(nèi)毒素會(huì)使豆血紅蛋白結(jié)合形成高鐵血紅蛋白致使蛋白純化變得更為復(fù)雜[17]。而畢赤酵母為甲醇營(yíng)養(yǎng)型菌株，在表達(dá)過程中需要使用甲醇作為碳源和誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)超濾純化過程后并不能完全去除[15]，這不僅增加了蛋白純化的難度，而且在食品中的應(yīng)用帶來(lái)了潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。釀酒酵母被認(rèn)為是GRAS（generally recognized as safe）生物，作為表達(dá)體系研究歷史悠久，已有多種血紅蛋白在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)[18-20]，而目前關(guān)于釀酒酵母表達(dá)豆血紅蛋白的研究鮮有報(bào)道。

本研究對(duì)釀酒酵母異源表達(dá)豆血紅蛋白進(jìn)行了初步研究。將編碼豆血紅蛋白的LBC2的基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在N 端添加可以促進(jìn)真核生物基因翻譯效率和提高基因表達(dá)水平的kozak 序列[21-22]，將優(yōu)化序列連接在表達(dá)載體pECS-TRP 上，通過對(duì)TEF1、ADH1、GAP、GAL1,10 不同啟動(dòng)子的替換，確定啟動(dòng)子與LBC2基因的適配性，成功實(shí)現(xiàn)了豆血紅蛋白在釀酒酵母中的表達(dá)，為釀酒酵母異源表達(dá)豆血紅蛋白提供了理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所涉及的菌株 見表1；表達(dá)克隆的基因 見表2；設(shè)計(jì)的引物信息 見表3；涉及的LegH 序列 經(jīng)釀酒酵母密碼子優(yōu)化[23]（http://www.jcat.de/）后交北京擎科生物科技有限公司合成；PCR 引物（見表3）北京擎科生物技術(shù)公司合成；PrimeSTAR Max DNA Polymerase、Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、DNA 限制性快切酶 北京寶日醫(yī)生物技術(shù)公司；Green Taq Mix 南京諾維贊生物科技公司；T4 DNA 連接酶、酵母基因組提取試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒、酵母蛋白提取試劑盒、脫脂奶粉、SDSPAGE 凝膠制備試劑盒、TBST、YNB、半乳糖、氨芐青霉素、咪唑及其他常用試劑 上海生工生物工程公司；DNA marker 北京全式金生物技術(shù)公司；Anti-His Antibody鼠單抗、超敏 ECL 化學(xué)發(fā)光液、快速轉(zhuǎn)膜液、穩(wěn)定性抗體稀釋液、高效封閉液 上海七純生物科技公司；HRP-山羊抗小鼠IgG（H+I）二抗、GAPDH rabbit pAb、HRP-山羊抗兔IgG（H+I）二抗 蘇州博奧龍科技公司；Western 一抗二抗去除液 碧云天生物；HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column 上海翌圣生物科技公司。

表1 本研究涉及的菌株信息Table 1 Strains used in this study

表2 本研究涉及的基因Table 2 Genes used in this study

表3 本研究設(shè)計(jì)的引物Table 3 Primers designed in this study

ALLEGRA X-30R 型高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；HZQ-X300 型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DYY-6C 電泳儀 北京六一儀器廠；Omega Lum W 型化學(xué)發(fā)光多色熒光成像系統(tǒng) 環(huán)亞生物科技公司；AH100D 型高壓均質(zhì)機(jī) 安拓思納米技術(shù)有限公司；SpectraMax iD3型多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 LB 培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10；pH7.0～7.4。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求添加2%（w/v）瓊脂粉。

YPD 液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20；根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求添加2%（w/v）瓊脂粉。

SC-Trp 篩選培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，YNB5，硫酸銨1.7。添加過濾除菌的Leu、His、Ura 至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

1.2.2 LegH 重組表達(dá)載體構(gòu)建 針對(duì)釀酒酵母對(duì)大豆血紅蛋白LBC2基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在N 端添加kozak 序列以增強(qiáng)基因的翻譯效率，在C端添加6×His 標(biāo)簽用于后續(xù)蛋白分離純化。通過在LegH 序列上下游分別添加BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位點(diǎn)，將其插入pESC-TRP 質(zhì)粒中，獲得誘導(dǎo)型pESCTRP-GAL1,10-LegH 重組表達(dá)載體。通過設(shè)計(jì)引物S-LegH-F、pECS-TRP-EcoRI-R 對(duì)質(zhì)粒pESC-TRPGAL1,10-LegH 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增獲得不含啟動(dòng)子序列的質(zhì)?？蚣躳ESC-TRP-LegH。對(duì)S.cerevisiaeCEN.PK2-1C 進(jìn)行基因組提取并擴(kuò)增獲得組成型啟動(dòng)子ADH1，GAP，TEF1 序列，并在其兩端分別添加EcoRⅠ和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)，通過EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切，將pESC-TRP-LegH 與三種組成型啟動(dòng)子ADH1，GAP，TEF1 通過T4 連接酶酶連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐青霉素的LB 固體平板上，對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR 篩選，提取質(zhì)粒并送擎科測(cè)序驗(yàn)證。獲得含有不同啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體pESC-TRP-GAL1,10-LegH、pESCTRP-TEF1-LegH、pESC-TRP-ADH1-LegH、pESCTRP-GAP-LegH，重組示意圖如圖1 所示。

圖1 重組表達(dá)載體構(gòu)建流程圖Fig.1 Schematic diagram of the recombinant expression vector construction process

1.2.3 釀酒酵母轉(zhuǎn)化及重組菌發(fā)酵 根據(jù)《釀酒酵母遺傳學(xué)方法實(shí)驗(yàn)指南》[24]中酵母感受態(tài)細(xì)胞制備和高效轉(zhuǎn)化方法，將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入S.cerevisiaeCEN.PK2-1C 中，涂布于SD-TRP 營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選培養(yǎng)基，獲得轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子通過Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR（Takara）裂解后進(jìn)行菌落PCR 篩選檢驗(yàn)。

將驗(yàn)證后的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于SD-TRP 液體培養(yǎng)基，30 ℃，220 r/min 培養(yǎng)24 h。接種1×107CFU/mL 的菌體細(xì)胞于YPD 培養(yǎng)基中發(fā)酵并額外添加10 μg/mL的豆血紅蛋白輔基血紅素，誘導(dǎo)型表達(dá)菌株發(fā)酵20 h后補(bǔ)充誘導(dǎo)劑半乳糖至終濃度2%，30 ℃，220 r/min總共發(fā)酵48 h。發(fā)酵液于4 ℃，8000 r/min 下離心10 min 收集菌體，并用PBS 緩沖液清洗菌體2 遍去除培養(yǎng)基及血紅素殘留。通過高壓均質(zhì)機(jī)對(duì)釀酒酵母進(jìn)行細(xì)胞破碎，4 ℃，11000 r/min 離心20 min，取上清獲得胞內(nèi)蛋白樣品，添加PMSF 至終濃度1 mmol/L，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Western blot 檢測(cè)LegH 表達(dá)水平 采用生工酵母蛋白提取試劑盒對(duì)發(fā)酵48 h 菌液進(jìn)行總蛋白提取。取8 μL 抽提液進(jìn)行SDS-PAGE 分析，分離膠按照15%進(jìn)行配制將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，快速封閉液封閉1 h，1:10000 稀釋Anti-His Antibody 鼠單抗4 ℃低溫?fù)u床封閉過夜，TBST 漂洗三次后1:5000 稀釋HRP-山羊抗小鼠IgG（H+I）二抗室溫孵育1 h，超敏ECL 化學(xué)發(fā)光處理10 min，送化學(xué)發(fā)光成像檢測(cè)。Western 一抗二抗去除液處理10 min，去除his 抗體及其二抗。選擇酵母GAPDH 蛋白作為內(nèi)參蛋白，采取與his 抗體相同方法孵育內(nèi)參抗體，1:10000 稀釋GAPDH rabbit pAb（Yeast）一 抗，1:5000 稀 釋HRP-山羊抗兔IgG（H+I）二抗。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行ImageJ 數(shù)據(jù)處理。

1.2.5 LegH 蛋白純化濃縮 按照10%（w/v）對(duì)菌體進(jìn)行重懸，130 MPa 高壓均質(zhì)破碎細(xì)胞,11000 r/min 離心30 min 獲取上清液。通過AKTA pure 利用HisSep Ni-NTA 6FF 純化柱對(duì)蛋白進(jìn)行純化。純化樣品通過15% SDS-PAGE 和全波段掃描進(jìn)行蛋白定性分析。

1.2.6 蛋白濃度測(cè)定 純化樣品適當(dāng)稀釋后通過Bradford 蛋白濃度測(cè)定法[25]測(cè)定總蛋白濃度，根據(jù)純化樣品SDS-PAGE 圖進(jìn)行ImageJ 灰度分析，計(jì)算LegH 在總蛋白中所占百分比，從而算出豆血紅蛋白濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同啟動(dòng)子PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

通過對(duì)S.cerevisiaeCEN.PK2-1C 基因組進(jìn)行擴(kuò)增獲得三種不同啟動(dòng)子片段TEF1（424 bp）、ADH1（413 bp）、GAP（683 bp），經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，如圖2 所示，片段大小符合目標(biāo)條帶大小。

圖2 啟動(dòng)子片段PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis plot of the PCR products of the promoter fragments

2.2 重組表達(dá)載體鑒定及重組菌構(gòu)建

通過對(duì)重組轉(zhuǎn)化大腸桿菌陽(yáng)性克隆菌落PCR 驗(yàn)證，提取陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒，EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切驗(yàn)證表達(dá)框TEF1-LegH（882 bp）、ADH1-LegH（871 bp）、GAP-LegH（1141 bp）、GAL1，10-LegH（1146 bp），經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 不同啟動(dòng)子重組質(zhì)粒酶切電泳圖Fig.3 Electrophoresis plot of recombinant plasmid digestion at different promoters

由圖3 可見，重組表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌，片段大小符合目標(biāo)條帶大小。重組質(zhì)粒送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列一致，表明含不同啟動(dòng)子的LegH 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

將鑒定正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化子通過菌落PCR 驗(yàn)證，成功獲得相應(yīng)重組釀酒酵母表達(dá)菌株。

2.3 Western blot 檢測(cè)不同啟動(dòng)子LegH 表達(dá)水平

啟動(dòng)子的選擇在基因轉(zhuǎn)錄起始過程中起到重要的調(diào)控作用，選擇合適的啟動(dòng)子與外源基因適配對(duì)基因的高效表達(dá)十分重要。釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)常用的啟動(dòng)子主要分為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子兩種。組成型啟動(dòng)子在啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄起始時(shí)無(wú)需轉(zhuǎn)錄因子的參與，可以維持一定的基因轉(zhuǎn)錄水平，而誘導(dǎo)型啟動(dòng)子則受調(diào)控基因嚴(yán)格調(diào)控，基因表達(dá)需要添加特定誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)[26]。根據(jù)表達(dá)需求選擇合適的啟動(dòng)子對(duì)于外源基因的表達(dá)至關(guān)重要。本研究中選擇釀酒酵母中較為常見的三種組成型強(qiáng)啟動(dòng)子（TEF1、ADH1、GAP）和誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子GAL1,10分別表達(dá)LegH 并進(jìn)行比較，通過Western blot 驗(yàn)證LegH 蛋白表達(dá)情況，結(jié)果見圖4 和圖5。

由圖4 可見，四種啟動(dòng)子在16 kDa 處都存在明顯特異性條帶，且本底S.cerevisiaeCEN.PK2-1C 在目標(biāo)位置無(wú)任何條帶，蛋白大小與預(yù)期一致，說(shuō)明在釀酒酵母中采用TEF1、ADH1、GAP、GAL1,10 四種啟動(dòng)子均成功表達(dá)目的蛋白LegH。通過Image J 灰度分析不同啟動(dòng)子表達(dá)LegH 水平（見圖5），可以發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1,10 較三種組成型啟動(dòng)子TEF1、ADH1、GAP 在表達(dá)LegH 能力上具有顯著優(yōu)勢(shì)，GAL1,10 啟動(dòng)子較產(chǎn)量最低的ADH1 啟動(dòng)子提升了3.93 倍。在組成型啟動(dòng)子中，TEF1 較優(yōu)，是ADH1 啟動(dòng)子的2.91 倍，是GAP 啟動(dòng)子的1.2 倍。分析其原因，可能是由于過早質(zhì)粒表達(dá)LegH 對(duì)菌體生長(zhǎng)具有一定負(fù)擔(dān)，不利于細(xì)胞的增長(zhǎng)。而誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在葡萄糖存在的條件下，GAL1,10 表達(dá)受到抑制，菌株正常生長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖消耗殆盡時(shí)，GAL1,10 啟動(dòng)子被激活，在半乳糖的誘導(dǎo)下開始正常表達(dá)，此時(shí)細(xì)胞已經(jīng)具備一定密度，蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不再明顯，因此誘導(dǎo)型啟動(dòng)子對(duì)LegH 表達(dá)具有一定優(yōu)勢(shì)。組成性啟動(dòng)子相對(duì)強(qiáng)度TEFp1>GAPp>ADH1p，這與Sun 等[27]的研究結(jié)果一致。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在表達(dá)蛋白所展示出的優(yōu)勢(shì)也與邱玲等[28]在釀酒酵母中表達(dá)乙肝抗原時(shí)相同，但其組成型啟動(dòng)子相對(duì)強(qiáng)度結(jié)果顯示ADH1p>TEF1p。因此，需要根據(jù)表達(dá)蛋白的不同進(jìn)行啟動(dòng)子的優(yōu)化選擇，以調(diào)整轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度進(jìn)而提升目標(biāo)物質(zhì)的產(chǎn)量。

2.4 LegH 表達(dá)結(jié)果

對(duì)重組酵母菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，在不同發(fā)酵時(shí)間測(cè)定菌體密度，以SDS-PAGE 蛋白電泳檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖6 和圖7 所示。由圖6 中可以看出，菌體在12～36 h 菌體大量擴(kuò)增，處于指數(shù)增長(zhǎng)期，48 h 后細(xì)胞增長(zhǎng)速率緩慢，菌體密度趨于穩(wěn)定。圖7 中發(fā)酵液SDS-PAGE 蛋白電泳結(jié)果顯示，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，LegH 的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，在發(fā)酵48 h 時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，LegH 表達(dá)量沒有明顯提升，甚至有所降解，因此確定最佳發(fā)酵時(shí)間為48 h。

圖6 重組酵母生長(zhǎng)曲線Fig.6 Recombinant yeast growth curve

圖7 SDS-PAGE 電泳檢測(cè)不同發(fā)酵時(shí)間 LegH 表達(dá)量Fig.7 LegH expression at different fermentation time determined by SDS-PAGE electrophoresis

因蛋白表達(dá)量較低，SDS-PAGE 電泳顯示雜蛋白條帶較多，直接對(duì)蛋白定量不準(zhǔn)確，因此對(duì)發(fā)酵48 h的蛋白進(jìn)行了濃縮純化以更好地定量。

在進(jìn)行重組質(zhì)粒設(shè)計(jì)時(shí)LegH 碳末端加有His純化標(biāo)簽，因此可以通過鎳柱對(duì)LegH 進(jìn)行親和層析。在咪唑洗脫濃度為250 mmol/L 的條件下獲得了目標(biāo)蛋白，蛋白經(jīng)15% SDS-PAGE 電泳驗(yàn)證，在目標(biāo)區(qū)域出現(xiàn)明顯條帶，如圖8 所示。蛋白經(jīng)全波段光譜掃描顯示，在420 nm 波長(zhǎng)下有特征吸收峰，如圖9 所示，符合血紅素輔基卟啉化合物的特征吸收[29-30]。蛋白分子量與通過氨基酸序列預(yù)測(cè)的一致，表明豆血紅蛋白在釀酒酵母中成功表達(dá)。通過Bradford 法測(cè)定蛋白濃度結(jié)合灰度分析，測(cè)得蛋白濃度達(dá)到698.33 mg/L，折算成發(fā)酵濃度為2.79 mg/L。該表達(dá)水平與現(xiàn)有報(bào)道的畢赤酵母菌株相比[8]，尚有一定差距。但該水平僅是目前的初步研究結(jié)果，尚未進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，后續(xù)通過發(fā)酵優(yōu)化以及相關(guān)代謝途徑的強(qiáng)化（添加信號(hào)肽進(jìn)行分泌型表達(dá)、構(gòu)建血紅素合成途徑等），有望進(jìn)一步提升菌株的表達(dá)水平。

圖8 純化蛋白SDS-PAGE 電泳圖Fig.8 SDS-PAGE electrophoresis plot of purified legH

圖9 LegH 蛋白光譜分析Fig.9 Spectrophotometry analysis of LegH

3 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了豆血紅蛋白釀酒酵母異源表達(dá)菌株，在不同啟動(dòng)子下實(shí)現(xiàn)了LegH 的表達(dá)，其中誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1,10 獲得了較高表達(dá)水平，蛋白經(jīng)鎳柱濃縮純化后，測(cè)得LegH 濃度達(dá)到698.33 mg/L，折算成發(fā)酵濃度為2.79 mg/L。釀酒酵母作為一種GRAS 生物，其在食品工業(yè)中應(yīng)用的安全性是無(wú)法比擬的，經(jīng)過深入研究，釀酒酵母有可能成為豆血紅蛋白異源表達(dá)的又一途徑。