不同豆角品種生長期及發(fā)芽處理對(duì)其皂苷含量的影響

管婷婷，寇 宇，張一婷，劉大軍，宋 永，孫慶申,

（1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江省寒地生態(tài)修復(fù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150080；2.河北環(huán)境工程學(xué)院，河北省農(nóng)業(yè)生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島 066102；3.黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150080）

油豆角是我國東北地區(qū)（黑龍江、吉林為主）特有的一種優(yōu)質(zhì)菜豆品種[1]，富含蛋白質(zhì)、胡蘿卜素，營養(yǎng)價(jià)值高，口感好，具有促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)、健脾補(bǔ)腎等功效。此外，油豆角中還含有皂苷類物質(zhì)，主要為三萜類皂苷[2]。三萜皂苷主要通過乙酸/甲羥戊酸途徑合成，一般可劃分為3 個(gè)階段：合成異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）；由異戊烯基轉(zhuǎn)移酶和萜類環(huán)化酶催化IPP 和DMAPP 形成2,3-氧化鯊烯；2,3-氧化鯊烯依次經(jīng)過環(huán)化、羥基化、糖基化修飾后最終形成三萜類皂苷[3-5]。

油豆角中皂苷主要由三萜皂苷元與糖組成，常見的糖有葡糖糖、半乳糖、鼠李糖等[6]。目前，采用超聲波輔助法[7]、正丁醇萃取[2]等方法來提取油豆角中皂苷，具有效率高、操作簡便、避免溶劑損失等特點(diǎn)。研究表明，品種、生長周期、生長部位等客觀條件會(huì)使油豆角等植物中皂苷含量發(fā)生改變[1]。這些皂苷具有多種重要的生物活性和廣泛的藥理作用，如降血脂、降血糖、抗癌、抗炎、抗過敏、抗氧化、治療白血病、抗病毒、防治心腦血管疾病等[6,8]。在生產(chǎn)生活中常被用于制作清潔劑、發(fā)泡劑和乳化劑等[9]。因此，對(duì)油豆角中皂苷類物質(zhì)的開發(fā)具有重要的價(jià)值。

本文以東北油豆角為原料，分析不同時(shí)期豆莢及種子的皂苷含量，明確豆角皂苷含量與生長期的關(guān)系及存在的部位；對(duì)發(fā)芽聯(lián)合鹽脅迫后豆角種子皂苷含量的變化進(jìn)行測定，探究豆角種子通過發(fā)芽聯(lián)合鹽脅迫處理后皂苷含量變化。利用UHPLC-Q-TOFMS 得到的精確相對(duì)分子質(zhì)量，對(duì)照文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫，對(duì)豆角中的皂苷類成分進(jìn)行鑒別，為開發(fā)油豆角深加工產(chǎn)品種類提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆角（金冠、綠冠、盛冠、紫冠、青冠、滿堂彩、哈15 號(hào)）均摘自黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)園藝基地；人參皂苷Rg1 標(biāo)準(zhǔn)品 上海創(chuàng)賽科技有限公司；氯化鈉、冰醋酸、香草醛、高氯酸 均為分析純，天津科密歐試劑有限公司；AM-P996 型Parafilm 封口膜無錫德凡儀器有限公司。

A560 型雙光束紫外可見分光光度計(jì) 翱藝儀器上海有限公司；DZKW-D-2 型恒溫水浴鍋 天津天泰儀器有限公司；SB-5200DT 型超聲波清洗機(jī)信儀儀器有限公司；FW100 型高速萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特有限公司；Agilent1290-G6470 型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀 上海安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 在2022 年6～8 月于黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)采摘金冠、綠冠、盛冠等7 個(gè)品種東北油豆角，在開花10～40 d 內(nèi)每間隔五天采樣，每個(gè)品種各取樣100 g，平行取樣三份，在采摘過的植株上掛簽，實(shí)現(xiàn)對(duì)同株豆角在不同生長期進(jìn)行采摘跟蹤。

1.2.2 豆角總皂苷的提取、含量測定

1.2.2.1 原料制備 開花后10、15 d 的豆角，因種子較小，難以分開，所以這兩個(gè)時(shí)期測定的是整個(gè)豆角中皂苷的含量；對(duì)開花后20 d 及以后的豆角，取不同生長期新鮮豆角的豆莢和種子剝離，置于60 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，用高速萬能粉碎機(jī)將其分別粉碎，過80 目篩備用。

1.2.2.2 豆角總皂苷的提取 參照劉寧等[7]的方法，采用超聲輔助提取法提取豆角總皂苷。準(zhǔn)確稱取1 g 豆角粉末于燒杯中，加入15 mL70%乙醇溶液，用封口膜密封后放入超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行超聲輔助提取，提取時(shí)間為25、30、35、40、45 min，溫度為45 ℃，功率240 W，頻率40 kHz，得到皂苷粗提液，過濾至澄清備用。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參照張慧穎等[10]的方法，利用人參皂苷Rg1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取不同量的人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液（400 mg/L）于60 ℃水浴干燥。加入0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液，轉(zhuǎn)動(dòng)蒸發(fā)皿，使殘?jiān)芙?，再加?.8 mL 高氯酸，混勻后移入10 mL 比色管中，60 ℃水浴加熱15 min，取出。靜置冷卻40 min，使用冰醋酸定容，搖勻后。以1 cm 比色皿于545 nm 波長處測定其吸光度。以皂苷質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制人參皂苷Rg1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下：Y=2.3223X-0.0075（R2=0.9965）。

1.2.2.4 樣品中皂苷含量測定 準(zhǔn)確吸取1 mL 皂苷粗提液于蒸發(fā)皿中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備過程，在545 nm 波長處測定其吸光度，總皂苷含量計(jì)算公式如下：

式中：C 為由提取液吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得出的總皂苷質(zhì)量（mg）；m 為豆角粉末質(zhì)量（g）；Vm為樣液定容后體積（mL）；V0為測定所用樣液體積（mL）。

1.2.3 添加氯化鈉對(duì)豆角種子發(fā)芽過程中皂苷含量的影響 參照趙露等[11]的方法，對(duì)金冠、滿堂彩種子進(jìn)行發(fā)芽處理。取一定量豆角種子，清洗后用蒸餾水浸泡過夜，將紗布平鋪于培養(yǎng)皿的底部，每皿擺放100 粒精選種，加入適量蒸餾水或不同濃度的氯化鈉（0.4%、0.8%、1.2%），在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至漏出白芽，并選取發(fā)芽1～4 d 的種子，測定皂苷含量，每個(gè)樣本做三個(gè)平行。

1.2.4 UHPLC-Q-TOF-MS 分析金冠豆角粒中皂苷的種類

1.2.4.1 待測液制備 參照侯亞楠等[12]的方法，準(zhǔn)確稱取1 g 豆角粉末置于100 mL 燒杯中，加入15 mL 70%甲醇，45 ℃、功率240 W、40 kHz 超聲提取35 min，提取液用0.22 μm 膜過濾后供檢測分析。

1.2.4.2 色譜與質(zhì)譜條件 測定儀器為三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，該系統(tǒng)配備Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸/水（A）和乙腈（B）。簡化洗脫條件為10%乙腈至100%乙腈5 min線性梯度洗脫。柱溫25 ℃，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。電噴霧質(zhì)譜（electrospray ionization-mass spectrometric，ESI-MS）分析，采用電離電壓3500 V，源溫度350 ℃電噴霧電離；氮?dú)?5 psi，氣體流速10 L/min，負(fù)離子模式下對(duì)m/z 44 到m/z 1004 進(jìn)行全掃描（MS2scan）在選擇離子監(jiān)測（selected lon monitoring，SIM）檢測方式下，檢測提取物的分子離子。在碎片離子掃描方式下，檢測提取物的碎片離子。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.0 軟件對(duì)試驗(yàn)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05 表示差異顯著，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長期及品種豆角皂苷含量測定

由于開花后10～15 d 表現(xiàn)為豆粒不飽滿，豆莢太小，因此在這兩個(gè)生長期沒有進(jìn)行莢皮及種子分別提取，只對(duì)整個(gè)豆角進(jìn)行皂苷含量測定，不同豆角在開花后10、15 d 時(shí)皂苷含量的動(dòng)態(tài)變化見表1。其中，綠冠、盛冠、紫冠、滿堂彩隨生長周期的增加皂苷含量逐漸升高，金冠、青冠、哈15 號(hào)皂苷含量下降。

表1 不同豆角在開花后10、15 d 時(shí)皂苷含量的動(dòng)態(tài)變化Table 1 Changes of saponin contents in different beans at 10,15 d post blooming

圖1 是豆角開花后20～40 d 豆莢和豆角粒中皂苷含量的動(dòng)態(tài)變化，金冠、綠冠豆角種子皂苷含量都在20 d 便達(dá)到最高值，但金冠和綠冠種子莢皮中皂苷含量分別在30 d 和20 d 時(shí)達(dá)到峰值，且豆粒中的皂苷含量顯著高于莢皮（圖1A，圖1B）。盛冠和青冠種子和莢皮皂苷含量在25 d 時(shí)顯著高于其它生長期，但盛冠和青冠種子莢皮中皂苷含量分別在25 d和35 d 時(shí)達(dá)到峰值（圖1C，圖1D）。紫冠、哈15 號(hào)種子皂苷含量在30 d 時(shí)含量顯著高于其它生長期，但紫冠和哈15 號(hào)種子莢皮中皂苷含量分別在25 d和20 d 時(shí)達(dá)到峰值（圖1E，圖1F），滿堂彩種子和豆莢中皂苷含量均在第35 d 達(dá)到最高值（圖1G）。

圖1 7 個(gè)品種豆角不同生長期種子及莢皮皂苷含量Fig.1 Contents of saponin in seeds and pods of seven varieties of Phaseolus vulgaris in different growth periods

本研究結(jié)果中，豆角總皂苷含量在不同部位不同生長期差別較大，種子中皂苷含量高于莢皮含量，皂苷含量都隨豆角生長先增加后降低，以20～35 d 采收質(zhì)量較好。李啟照等[13]研究發(fā)現(xiàn)女貞不同藥用部位不同生長期薯蕷皂苷元含量有所不同。徐偉等[14]研究發(fā)現(xiàn)隨著生長時(shí)間的延長，美國皂莢殼皂苷的含量逐漸增加，在開花后25 d 皂苷含量達(dá)到最高后逐漸減少。均與本實(shí)驗(yàn)所研究趨勢相近，其皂苷所存在位置對(duì)皂苷含量影響較大，隨生長時(shí)間的延長出現(xiàn)先升高后下降的趨勢。因此可以確定豆角皂苷主要存在部位為豆角種子中，且在不同生長期含量差別較大。因?yàn)殡S著豆角生長周期的延長，經(jīng)過甲酸戊醛代謝途徑等一系列反應(yīng)最終形成三萜皂苷類化合物，使皂苷含量升高，達(dá)到峰值后，由于溫度升高，豆角內(nèi)部水分大量流失，皂苷等活性物質(zhì)損失，導(dǎo)致其含量下降。

2.2 發(fā)芽處理對(duì)豆角種子皂苷含量的影響

本文選取在海南種植的滿堂彩豆角及東北特色品種的金冠豆角做發(fā)芽處理，由于前期測定結(jié)果得到滿堂彩及金冠兩個(gè)品種豆角中總皂苷含量較高于其他品種，而滿堂彩豆角屬于海南品種，金冠豆角是東北地區(qū)特色油豆角品種，前期課題組已對(duì)金冠豆角種子中α-淀粉酶抑制劑進(jìn)行研究，為進(jìn)一步探究地域差異對(duì)豆角皂苷含量的影響，因此選擇滿堂彩和金冠豆角進(jìn)行發(fā)芽處理。

由圖2 可知，對(duì)于不同氯化鈉濃度處理和空白組來說，在金冠種子發(fā)芽后1～4 d，其皂苷含量相比于發(fā)芽前（12.04±0.62）mg/g 均顯著下降（P<0.05）。Huang 等[15]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)芽處理3 d 后，黑皮大豆中總皂苷含量較發(fā)芽前略有降低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)四組氯化鈉濃度處理下均在發(fā)芽后1 d 皂苷含量最高，2～3 d 含量降低，第4 d 含量升高，可以得出皂苷含量與萌芽時(shí)間密切相關(guān)?？赡苁怯捎诼然c濃度的改變可以在一定程度上影響植物皂苷的合成途徑，抑制了皂苷合成所需的物質(zhì)代謝和關(guān)鍵酶活性（圖3）[16-17]。

圖2 氯化鈉溶液發(fā)芽處理對(duì)金冠種子皂苷含量的影響Fig.2 Effects of sprouting treatment with sodium chloride solution on the content of saponins in Golden Crown seeds

圖3 三萜皂苷類化合物合成途徑Fig.3 Synthetic pathway of triterpenoid saponins

高春霞等[18]也發(fā)現(xiàn)發(fā)芽4 d 后大豆中皂苷含量從2.8%增加到8.9%，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。如表2所示，本實(shí)驗(yàn)四種濃度處理后，皂苷含量均在發(fā)芽第2 d 下降，3 d 含量升高，4 d 含量下降，且均在3 d 時(shí)皂苷含量最高。通過發(fā)芽處理可以顯著提高滿堂彩種子皂苷含量，且皂苷含量與萌芽時(shí)間和豆角品種密切相關(guān)。Alam 等[19]和Sarkar 等[20-20]采用氯化鈉等前處理方法對(duì)種子進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)其活性物質(zhì)含量增加，而本實(shí)驗(yàn)隨氯化鈉濃度升高，呈先上升后下降的趨勢，可能是隨著氯化鈉濃度改變，通過調(diào)節(jié)皂苷合成酶來適應(yīng)濃度改變，說明適度的鹽脅迫有利于種子生長以及豆角總皂苷的積累[21-22]。

表2 氯化鈉發(fā)芽處理對(duì)滿堂彩種子皂苷含量的影響（mg/g）Table 2 Effect of sodium chloride germination treatment on saponin content of Mantangcai seeds (mg/g)

2.3 UHPLC-Q-TOF-MS 對(duì)金冠種子粗皂苷的化學(xué)成分分析

由于課題組前期對(duì)金冠豆角種子中α-淀粉酶抑制劑進(jìn)行研究，為進(jìn)一步挖掘金冠豆角種子的價(jià)值，因此對(duì)金冠種子粗皂苷進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析。

如圖4 為金冠粗皂苷在UHPLC-Q-TOF-MS 得到的質(zhì)荷比與相對(duì)豐度的相關(guān)性圖。經(jīng)過液質(zhì)聯(lián)用對(duì)金冠種子粗皂苷進(jìn)行鑒定，通過查出閱文獻(xiàn)建立譜庫共分析出柴胡皂苷F、赤豆皂苷II、黃芪皂苷IV等7 種皂苷，如表3 所示。

圖4 金冠種子粗皂苷在UHPLC-Q-TOF-MS 質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of crude saponin from golden crown seeds in UHPLC-Q-TOF-MS

表3 金冠種子粗皂苷成分分析Table 3 Composition analysis of crude saponins in golden crown seeds

其中，柴胡皂苷F 具有抗病毒作用[26]，赤豆皂苷II 具有利水消腫，解毒排膿等功效；黃芪皂苷IV 是中醫(yī)臨床上常用的中藥材，在食品、保健品、化妝品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景[27]。竹節(jié)參皂苷V 甲酯在抗炎，抗心肌缺血，保護(hù)肝損害和延緩衰老等方面具有重要的作用[28]。大豆皂苷元D 具有多種生物學(xué)活性，包括抗腫瘤，抗癌，預(yù)防肥胖和免疫調(diào)節(jié)等[29-30]。遠(yuǎn)志皂苷元具有降低神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用[31]，可為緩解抗腫瘤藥物的毒副作用尋找新的突破口。

3 結(jié)論

豆角種子及莢皮中均含有皂苷類成分，且豆角種子中皂苷含量高于莢皮含量，隨著生長周期的增加豆角中總皂苷含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，且通過發(fā)芽處理可以顯著改變?cè)碥蘸浚≒<0.05），且含量變化與萌芽時(shí)間、豆角品種密切相關(guān)。發(fā)芽時(shí)協(xié)同鹽脅迫處理可以顯著提高豆角種子中皂苷含量。通過液質(zhì)聯(lián)用方法共鑒定出7 種皂苷類物質(zhì)，在食品、保健品、醫(yī)療等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。目前本實(shí)驗(yàn)僅做了提取含量分析及活性成分鑒定，缺少應(yīng)用、結(jié)構(gòu)鑒定及功能評(píng)價(jià)，需要在未來進(jìn)行進(jìn)一步研究。