食品中硒形態(tài)的HPLC-ICP/MS測(cè)定方法

胡銀川，譚欣，鐘洋，唐靜

四川省食品檢驗(yàn)研究院（成都 610097）

硒是人體重要的微量元素，人體中的硒通常以硒蛋白的形式發(fā)揮生物學(xué)功能，它們?cè)诿庖哒{(diào)節(jié)、抗氧化、清除自由基、防癌抗癌、延緩機(jī)體衰老、拮抗重金屬等方面發(fā)揮重要作用[1]。1973年世界衛(wèi)生組織將硒定為人和動(dòng)物必需的微量元素。1988年中國營養(yǎng)家學(xué)會(huì)將硒列入每日必須攝入的15種膳食營養(yǎng)元素[2]。2017版《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》規(guī)定成人對(duì)硒的平均需求量為50 μg/d，推薦攝入量為60 μg/d，可耐受最高攝入量為400 μg/d。我國成人從膳食中硒平均攝入量?jī)H為36.7 μg/d，低于平均需要量50 μg/d[3]。調(diào)查顯示，我國約72%以上地區(qū)、7億人處于貧硒和低硒區(qū)[4]。硒由無機(jī)硒和有機(jī)硒兩大類組成。無機(jī)硒主要以硒酸鹽和亞硒酸鹽存在；有機(jī)硒主要以硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代乙硫氨酸和硒肽等形式存在[5]。無機(jī)硒不易被人體吸收，生物有效性低，具有較大的毒性，不適宜人類食用，因而被嚴(yán)格限制使用，而來源于生物體內(nèi)的有機(jī)硒毒性小，生物利用率高，則成為人類從食物中獲得硒的重要來源[6]。準(zhǔn)確測(cè)定食品中硒存在形態(tài)及其含量，對(duì)富硒食品開發(fā)和人體按需補(bǔ)硒具有重要意義[7]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Nexiontm 350X電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、Altus高效液相色譜儀、Aqueous C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）：美國PerkinElmer公司；MARS-X微波萃取儀（美國CEM公司）；Multifuge低溫高速離心機(jī)、Genpure純水儀（美國Thermo公司）；IDH30超聲波清洗機(jī)（德國IRM公司）。

硒酸根[Se(VI)]標(biāo)準(zhǔn)溶液、亞硒酸根[Se(IV)]標(biāo)準(zhǔn)溶液、硒代胱氨酸（SeCys2）標(biāo)準(zhǔn)溶液、甲基-硒代半胱氨酸（MeSeCys）標(biāo)準(zhǔn)溶液、硒代蛋氨酸（SeMet）標(biāo)準(zhǔn)溶液（中國計(jì)量科學(xué)研究院）；硒代乙硫氨酸（SeEt，加拿大TRC公司）；氨水，鹽酸、硼氫化鉀、氫氧化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鉀、碘化鉀（均為優(yōu)級(jí)純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；鏈霉蛋白酶E（上海源葉生物科技有限公司）；甲醇（色譜純，Sigma公司）。

1.2 樣品前處理

將樣品粉碎均勻，稱取0.5 g（精確至0.1 mg）樣品于微波消解管中，加入25 mL水，加入50 mg鏈霉蛋白酶E，于37 ℃微波萃取30 min。移取萃取溶液于50 mL離心管中，以8 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾，HPLC-ICP/MS分析。

1.3 色譜條件

流動(dòng)相為40 mmoL/L檸檬酸+1.5 mmoL/L己烷磺酸鈉+2%甲醇；等度洗脫；柱溫25 ℃；流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量50 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

射頻功率1 150 W；霧化器流速0.83 L/min；等離子體氣體流速18 L/min；輔助氣流速1.2 L/min；氦氣流速5 mL/min；分析模式為KED模式，質(zhì)荷比（m/z）78。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法選擇

形態(tài)分析前處理方法主要有酶解法、酸解法和緩沖鹽提取法，酸解法與緩沖鹽提取法能夠有效提取出無機(jī)硒，但對(duì)有機(jī)硒的提取效果較差，并且酸解法采用強(qiáng)酸提取，酸的還原性容易導(dǎo)致硒形態(tài)轉(zhuǎn)變。因此，采取微波輔助酶解法進(jìn)行提取。

2.1.1 鏈霉蛋白酶E使用量選擇

考察不同鏈霉蛋白酶E使用量對(duì)硒提取率的影響。在其他條件不變情況下，鏈霉蛋白酶E使用量分別為30，40，50，60和70 mg，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。鏈霉蛋白酶E使用量大于50 mg時(shí)，硒提取率未見明顯提高，故選擇鏈霉蛋白酶E使用量50 mg。

圖1 鏈霉蛋白酶E使用量對(duì)硒提取率影響

2.1.2 微波萃取溫度選擇

考察不同微波萃取溫度對(duì)硒提取率的影響。在其他前處理?xiàng)l件不變情況下，微波萃取溫度分別為25，30，35，37，40和45 ℃時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。微波萃取溫度37 ℃時(shí)，硒提取率最高，故選擇微波萃取溫度37 ℃。

圖2 微波萃取溫度對(duì)硒提取率影響

2.1.3 微波萃取時(shí)間選擇

考察不同微波萃取時(shí)間對(duì)硒提取率的影響。在其他前處理?xiàng)l件不變情況下，微波萃取時(shí)間分別為10，20，30，40和50 min，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。微波萃取時(shí)間大于30 min時(shí)，硒形態(tài)提取率不再顯著增加，故選擇微波萃取時(shí)間30 min。

圖3 微波萃取時(shí)間對(duì)提取率影響

2.2 色譜柱選擇

形態(tài)分析主要采用陰離子色譜柱和C18反相色譜柱。對(duì)Hamilton公司的PRP-X100（250 mm×4.1 mm×10 μm）陰離子色譜柱和Perkin Elmer公司的Aqueous C18（150 mm×4.6 mm×5 μm）反相色譜柱對(duì)硒形態(tài)分離效果進(jìn)行比較，試驗(yàn)結(jié)果見圖4和圖5。與PRP-X100陰離子色譜柱相比，Aqueous C18反相色譜柱分析時(shí)間短，分離度較好，峰形尖銳，靈敏度高，故選擇Aqueous C18反相色譜柱對(duì)硒形態(tài)進(jìn)行分析。

圖4 PRP-X100陰離子色譜柱色譜圖

圖5 Aqueous C18反向色譜柱色譜圖

2.3 流動(dòng)相檸檬酸濃度選擇

在其他分析條件不變情況下，考察濃度分別為10，20，30，40和50 mmoL/L的檸檬酸對(duì)各硒形態(tài)分離度和靈敏度影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖6。隨著檸檬酸濃度增加，各硒形態(tài)分離度變大。檸檬酸濃度40 mmoL/L時(shí)，各硒形態(tài)響應(yīng)值之和最大。故選擇檸檬酸濃度40 mmoL/L。

圖6 檸檬酸濃度對(duì)硒形態(tài)分離度影響

2.4 流動(dòng)相pH選擇

在其他分析條件不變情況下，考察pH分別為2.4，3.0，3.6和4.0時(shí)，對(duì)各硒形態(tài)分離度影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖7。pH與保留時(shí)間成反比，pH越大，各目標(biāo)物保留時(shí)間縮短。pH 2.4時(shí)，分析時(shí)間較長(zhǎng)，硒代乙硫氨酸峰寬較寬，峰型較差；pH 3.6和4.0時(shí)，硒酸根和亞硒酸根未能完全分離，分離度較差。故選擇流動(dòng)相pH 3.0。

圖7 pH對(duì)硒形態(tài)分離度影響

2.5 流動(dòng)相流速選擇

在其他分析條件不變情況下，考察流動(dòng)相流速分別為0.8，1.0，1.2和1.4 mL/min對(duì)各硒形態(tài)分離度影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖8。隨著流動(dòng)相流速的增加，各硒形態(tài)的保留時(shí)間縮短。流速1.2和1.4 mL/min時(shí)硒酸根和亞硒酸根未能完全分離，分離度較差；流速0.8 mL/min時(shí)，硒代乙硫氨酸峰寬較寬，峰型較差；流速1.0 mL/min時(shí)，各硒形態(tài)可實(shí)現(xiàn)完全分離，分離度較好。故選擇流動(dòng)相流速1.0 mL/min。

圖8 流動(dòng)相流速對(duì)硒形態(tài)分離度影響

2.6 柱溫選擇

考察柱溫對(duì)各硒形態(tài)分離度影響。在其他分析條件不變情況下，柱溫分別為20，25，30，35和40 ℃。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，柱溫變化對(duì)硒形態(tài)分離度影響較小。故柱溫選擇常溫25 ℃。

2.7 流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)選擇

在其他分析條件不變情況下，考察甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為1.0%，1.5%，2.0%和2.5%對(duì)硒形態(tài)分離度影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖9。甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.0%和1.5%時(shí)，分析時(shí)間較長(zhǎng)，硒代乙硫氨酸峰寬較寬，峰型較差；甲醇體積分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，硒酸根和亞硒酸根未能完全分離；甲醇體積分?jǐn)?shù)為2.0%時(shí)，各硒形態(tài)可實(shí)現(xiàn)完全分離，且峰型較好。故選擇甲醇體積分?jǐn)?shù)2.0%。

圖9 甲醇濃度對(duì)硒形態(tài)分離度影響

2.8 校正曲線

取硒酸根、亞硒酸根、甲基-硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒代乙硫氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（1.0，2.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/L），按照上述色譜條件進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量，以峰面積y對(duì)質(zhì)量濃度x（μg/L）進(jìn)行線性回歸，硒形態(tài)校正曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。由5種硒形態(tài)在1～50 μg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999。

表1 硒形態(tài)校正曲線

2.9 方法檢出限和定量限

按照逐級(jí)稀釋法求方法檢出限和定量限。通過在空白樣品中添加不同濃度硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)目標(biāo)物檢出限信噪比（rSN）應(yīng)不小于3，目標(biāo)物定量限信噪比（rSN）應(yīng)不小于10，求取各硒形態(tài)的檢出限和定量限，結(jié)果見表2。

表2 硒形態(tài)的定量限和檢出限 單位：mg/kg

2.10 回收率試驗(yàn)

為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，對(duì)樣品進(jìn)行低、中、高3個(gè)不同水平的標(biāo)準(zhǔn)品添加回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平分別進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。稱取混合均勻的樣品按照添加水平為0，0.5，1.0和2.5 mg/kg這4個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，按照樣品前處理方法進(jìn)行處理，外標(biāo)法定量，試驗(yàn)結(jié)果見表3。硒形態(tài)的低濃度加標(biāo)回收率在85.01%～95.20%之間；中濃度加標(biāo)回收率在85.81%～98.86%之間；高濃度加標(biāo)回收率在89.33%～99.01%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）均小于5%，表明試驗(yàn)方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)（n=6）

2.11 精密度試驗(yàn)

根據(jù)方法檢出限和線性范圍，對(duì)1.0和2.5 mg/kg這2個(gè)加標(biāo)濃度樣品進(jìn)行精密度試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)濃度進(jìn)行12次平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表4。加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0和2.5 mg/kg時(shí)，5種硒形態(tài)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在5%內(nèi)，表明試驗(yàn)方法的精密度良好；加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5 mg/kg比1.0 mg/kg的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小，表明在線性范圍內(nèi)，高濃度相對(duì)于低濃度的精密度更好。

表4 方法精密度（n=12）

2.12 常見食品中硒的存在形態(tài)及其含量

通過建立的方法對(duì)市售22種常見食品中硒形態(tài)進(jìn)行測(cè)定。食用菌、水產(chǎn)品、雞蛋和畜禽肉及其內(nèi)臟均含有有機(jī)硒；畜禽內(nèi)臟有機(jī)硒含量高于肉體；牛肝菌中有機(jī)硒含量較高；富硒茶葉、富硒大米和小麥粉含有少量有機(jī)硒；純凈水、牛奶、蔬菜、水果、食用油、白醋、醬油未檢出有機(jī)硒。

3 結(jié)論

建立高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定食品中5種硒形態(tài)分析方法。稱取0.5 g樣品于微波消解管中，加入25 mL水，加入50 mg鏈霉蛋白酶E，于37 ℃微波萃取30 min。移取萃取溶液于50 mL離心管中，以8 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾，HPLC-ICP/MS分析。5種硒形態(tài)在1～50 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（R2＞0.999），方法檢出限小于0.1 mg/kg；在0.5，1.0和2.5 mg/kg這3個(gè)樣品加標(biāo)水平，回收率在85.01%～99.90%之間；方法精密度試驗(yàn)相對(duì)準(zhǔn)偏差在5%之內(nèi)。該試驗(yàn)為食品硒形態(tài)評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供依據(jù)。