奶茶中茶多酚含量測定方法的優(yōu)化

徐玲萍，張芳芳，金佳倩

臺州市食品檢驗檢測中心（臺州 318000）

茶多酚是茶葉中有保健功能的主要成份之一[1]。研究表明[2-4]茶多酚有抗衰老、緩解過敏、助消化、防輻射、護齒、養(yǎng)顏等功效，并在癌癥、高血壓、動脈硬化、高血糖、中風(fēng)、血栓、哮喘、便秘、腹瀉等疾病的治療上也有積極的作用。因此，食品中茶多酚的含量和形態(tài)被越來越多的消費者關(guān)注[5]。奶茶是將茶和奶混合的飲料，兼具牛奶和茶的雙重營養(yǎng)。近年來，我國奶茶行業(yè)高速發(fā)展，熱度持續(xù)上漲，大大小小的奶茶品牌隨處可見，但是在質(zhì)量上卻參差不齊[6]，其中茶多酚含量作為衡量奶茶品質(zhì)重要指標(biāo)。GB/T 21733—2008《茶飲料》[7]規(guī)定奶茶中茶多酚含量≥200 mg/kg。

GB/T 21733—2008中采用酒石酸亞鐵比色法測定奶茶中茶多酚含量，但是在實際操作中存在諸多困難[8]。針對奶茶飲料、果汁茶飲料等較渾濁的樣液，國標(biāo)方法選取95%乙醇溶液作為沉淀劑，然而在實際檢測過程中發(fā)現(xiàn)在加入95%乙醇溶液后，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)沉淀效果并不理想，濾紙過濾緩慢，濾液渾濁，背景吸光度高，無法進行準(zhǔn)確測定。杜淑霞等[9]指出丙酮有破乳和沉淀蛋白的作用，在加入一定量的鹽酸后可促進其作用，縮短澄清時間，加快過濾速度。梁瑞婷等[10]選用4%乙酸溶液作為沉淀劑，測定20種不同的奶茶飲料，大多奶茶飲料過濾速度快，濾液澄清。但是過量的酸會降低緩沖鹽的緩沖效果，影響測定液的pH，導(dǎo)致測定結(jié)果偏低，且偏低的程度隨著乙酸用量的增大而增大。試驗在借鑒前人方法的基礎(chǔ)上，以酒石酸亞鐵比色法為基本方法[11]，通過改變不同種類、不同劑量的沉淀劑優(yōu)化前處理效果，提高奶茶中茶多酚含量的準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料和試劑

水浴鍋（SW23，優(yōu)萊博技術(shù)有限公司）；離心機（ST16，賽默飛世爾科技有限公司）；分光光度計（UV-2600，島津）。

茶多酚（≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；無水硫酸鈉、丙酮、乙腈、鹽酸、無水乙醇（均為分析純）。

酒石酸亞鐵溶液：稱取0.1 g硫酸亞鐵（分析純）和0.5 g酒石酸鉀鈉（分析純），用水溶解定容至100 mL。

磷酸緩沖溶液：稱取20.3 g無水磷酸氫二鈉（分析純）用純水溶解，稱取1.36 g無水磷酸二氫鉀（分析純）用純水溶解，合并2種溶液并定容至1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 試樣的制備

稱取10 g充分混勻的樣液，加入8 mL乙腈，加入0.5 mL 1%鹽酸，搖勻，靜置10 min，用水定容至25 mL，按6 000 r/min離心5 min。過濾，濾液備用。

1.2.2 茶多酚含量的測定

精確量取2 mL濾液于25 mL容量瓶中，加入4 mL水和5 mL酒石酸亞鐵溶液，充分搖勻，用磷酸鹽緩沖溶液定容至刻度，用1 cm比色皿，在波長540 nm處，以試劑空白為參比，測定其吸光度A1。取等量的濾液于25 mL容量瓶中，加入4 mL水，用磷酸鹽緩沖溶液定容至刻度，用1 cm比色皿，在波長540 nm處，以試劑空白為參比，測定其吸光度A2。茶多酚含量按式（1）計算。

式中：X為樣品中茶多酚的含量，mg/kg；A1為試樣顯色后的吸光度；A2為試樣底色的吸光度；V2為測定時吸取試樣體積，mL；V1為試樣處理時的定容體積，mL；M為取樣量，g；1.957，用1 cm比色杯，吸光度等于0.5時，每毫升茶湯中含茶多酚相當(dāng)于1.957 mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同沉淀劑對蛋白質(zhì)沉淀效果的影響

稱取6份10 g充分混勻的試樣，分別加入8 mL 95%乙醇溶液、3 g無水硫酸鈉、2 mL 10%鹽酸、8 mL乙腈和8 mL丙酮，充分搖勻，靜置10 min，加水定容至25 mL，按6 000 r/min離心5 min，過濾，觀察過濾情況，濾液于540 nm處測定吸光度（見表1）。

表1 不同沉淀劑處理樣品的試驗現(xiàn)象及背景吸光度

由表1可知：原液、加入95%乙醇溶液、無水硫酸鈉的樣品濾液渾濁，背景吸光度高。無水硫酸鈉破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出[12]，這種鹽析是可逆的，用水定容時，部分蛋白質(zhì)重新溶解導(dǎo)致背景吸光度高。鹽析作用不僅針對蛋白質(zhì)，茶多酚與亞鐵離子形成的絡(luò)合物同樣被析出，無法進行測定。乙醇有一定的破乳作用，但是作用甚微，濾液吸光度和原液比無明顯差異。丙酮沉淀蛋白的能力較乙腈弱，背景吸光度0.456，干擾不能完全消除[13]。在對市面上10種不同品牌的奶茶測定中，有8種奶茶加入乙腈后有明顯的沉淀效果，另外2種在乙腈沉淀蛋白的基礎(chǔ)上加入少量的鹽酸后才產(chǎn)生沉淀，比較各類沉淀劑的優(yōu)劣，選擇鹽酸酸化乙腈溶液作為沉淀劑。

2.2 不同乙腈使用量對蛋白沉淀效果的影響

稱取7份10 g充分混勻的試樣，分別加入不同量的乙腈，充分搖勻，靜置10 min，加水定容至25 mL，觀察沉淀情形（見表2）。

表2 不同乙腈用量處理樣品的試驗現(xiàn)象

由表2可見，乙腈加入量比較小時，蛋白質(zhì)不能完全沉淀，溶液達不到澄清效果。隨著加入量的增加蛋白質(zhì)凝結(jié)效果越來越明顯，下層液體越來越澄清。但是乙腈加到10 mL時，樣品出現(xiàn)液液分層的現(xiàn)象。故確定乙腈加入量為8 mL。

2.3 不同鹽酸使用量對蛋白質(zhì)沉淀效果的影響

選取加入乙腈沉淀后仍渾濁的樣品。量取9份10 g樣品，均加入8 mL乙腈，分別加入不同量1%鹽酸，靜置10 min，定容至25 mL，搖勻，按6 000 r/min離心5 min，過濾，取濾液于540 nm處測定背景吸光度，并按照1.2.2的方法測定茶多酚含量（見表3）。

表3 不同濃度鹽酸處理樣品的背景吸光度及對茶多酚數(shù)據(jù)的影響

表4 回收率試驗結(jié)果

蛋白質(zhì)加入乙腈后發(fā)生變性，蛋白質(zhì)發(fā)生變性后并不一定會產(chǎn)生沉淀，因為其帶有凈電荷，相同電荷的分子之間互相排斥，溶液仍然處于渾濁狀態(tài)。絕大部分蛋白質(zhì)的等點電為弱酸性，通過加入一定量酸使溶液達到等電點[14-15]。由表3可知，加酸量在0.2 mL時發(fā)生肉眼可見明顯凝聚，加酸量在0.2～1.0 mL范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)凝結(jié)的現(xiàn)象持續(xù)存在，測定其背景吸光度干擾最小，茶多酚測定值穩(wěn)定。隨著加酸量繼續(xù)增加，溶液凝結(jié)現(xiàn)象消失。確定1%鹽酸使用量為0.5 mL。

2.4 方法穩(wěn)定性試驗

按照試驗方法對樣品進行去蛋白處理，該樣品每隔5 min按照1.2.2進行茶多酚含量測定，發(fā)現(xiàn)5～60 min，茶多酚測定值沒有明顯的變化，所以比色時間確定在60 min內(nèi)。絡(luò)合物穩(wěn)定性見圖1。

圖1 絡(luò)合物穩(wěn)定性

2.5 方法回收率試驗

取茶多酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用純水溶解，配制茶多酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度16 000 mg/L。于100 mL容量瓶中分別加入2，4和6 mL 16 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用奶茶混合并定容，按照試驗方法測定其含量，并計算回收率。在3種樣品中加入低、中、高3種不同濃度的茶多酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測定回收率在90%～111%之間。而按照GB/T 21733—2008操作，回收率僅在70%。

2.6 方法精密度試驗

選取不同門店不同口味的6種奶茶飲料進行6次重復(fù)性試驗。由于試驗方法操作簡便，人員引入的誤差少，環(huán)境設(shè)施影響小，目標(biāo)物穩(wěn)定性好，不同的人員，不同實驗室操作均能有很好重現(xiàn)性結(jié)果。由表5可知，對6種不同奶茶的試驗表明該方法有很好的沉淀蛋白效果，精密度測試結(jié)果在2.7%～4.4%之間。

表5 精密度試驗結(jié)果

3 結(jié)論

取10 g樣品，加入8 mL乙腈和0.5 mL 1%的鹽酸，能有效去除蛋白質(zhì)的干擾，獲得澄清的樣品溶液。樣品溶液加入酒石酸亞鐵后，形成藍紫色絡(luò)合物，溶液顯色明顯。試驗方法回收率在90%～111%之間，平行樣相對標(biāo)準(zhǔn)偏為2.7%～4.4%，與GB/T 21733—2008相比，沉淀現(xiàn)象明顯，過濾速度快，濾液澄清，背景吸光度低，有更好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。優(yōu)化的方法操作簡便，能有效進行奶茶等茶飲料中茶多酚含量的測定。