UPLC-MS/MS法測(cè)定雞肉中5種硝基呋喃代謝物

李招，李劍，徐巧

杭州譜育科技發(fā)展有限公司（杭州 311300）

硝基呋喃是一類(lèi)合成的廣譜抗菌和抗寄生蟲(chóng)藥物[1-3]，能有效抑制革蘭陰性菌、革蘭陽(yáng)性菌等的代謝和生長(zhǎng)[4-6]，因其顯著的抗菌功效而作為飼料添加劑被廣泛用于畜牧業(yè)[4]。在獸醫(yī)實(shí)踐中，硝基呋喃類(lèi)藥物可用于預(yù)防和治療家畜、魚(yú)類(lèi)、蜂蜜等的細(xì)菌感染，抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌的生長(zhǎng)[7]。但毒理學(xué)研究表明，硝基呋喃母體化合物及其代謝產(chǎn)物具有致癌、致畸和致突變的風(fēng)險(xiǎn)，許多國(guó)家禁止在獸藥中使用硝基呋喃類(lèi)藥物[8-9]。歐盟早在2003年將動(dòng)物源食品中硝基呋喃類(lèi)代謝物的最低要求性能水平定為1 μg/kg[10]，2022年10月27日我國(guó)海關(guān)總署發(fā)布緊急公函把硝呋索爾代謝物（DNSA）納入5種必檢硝基呋喃代謝物中。硝基呋喃類(lèi)藥物在動(dòng)物體內(nèi)可快速分解，難以檢測(cè)，但其代謝物能與蛋白高度穩(wěn)定結(jié)合[11-12]。硝基呋喃類(lèi)代謝物分子量低、電離性能差和極性高，需要通過(guò)衍生反應(yīng)增加分子量，提高檢測(cè)靈敏度[13]。

硝基呋喃類(lèi)代謝物的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法（ELISA）[14-15]，高效液相色譜法（HPLC）[16-17]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[18-19]。酶聯(lián)免疫法存在假陽(yáng)性概率[20]，高效液相色譜法選擇性差，靈敏度低，且無(wú)法提供物質(zhì)結(jié)構(gòu)或組成的有效信息[21-22]。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，選擇性好，抗干擾能力強(qiáng)，是測(cè)定硝基呋喃代謝物最有效的方法[23-25]。

在GB 31656.13—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物多殘留測(cè)定》的基礎(chǔ)上，在酸性條件下超聲輔助衍生，優(yōu)化液液萃取條件，選擇甲醇水體系流動(dòng)相，建立超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定雞肉中1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD）、3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）、氨基脲（SEM）、5-嗎啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（AMOZ）和3,5-二硝基水楊酸肼（DNSA）5種硝基呋喃代謝物殘留量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與儀器

1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD）、3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）、氨基脲（SEM）、5-嗎啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（AMOZ）及同位素內(nèi)標(biāo)AHD-13C3、AOZ-D4、SEM·HCl-13C，15N2、AMOZ-D5（含量均≥99.0%，上海安譜公司）；3,5-二硝基水楊酸肼（DNSA，純度≥99.0%，天津阿爾塔公司）。

甲醇（色譜純，Merck公司）；乙酸乙酯（色譜純，Honeywell公司）；乙酸銨（色譜純，Aladdin公司）；鹽酸、無(wú)水磷酸氫二鉀（均為分析純）；2-硝基苯甲醛（純度≥98.0%，上海安譜公司）、二甲基亞砜（色譜純，Aladdin公司）；試驗(yàn)用水均為超純水。

雞肉購(gòu)自市場(chǎng)，取可食用部分?jǐn)囁?，冷藏待用?/p>

1.1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)據(jù)收集。本研究計(jì)劃訪(fǎng)談23家酒店，但由于各種原因，23家酒店中有9家表示無(wú)法安排面對(duì)面的采訪(fǎng)。其主要理由包括：忙于營(yíng)銷(xiāo)活動(dòng)而沒(méi)有時(shí)間接受訪(fǎng)談；剛剛開(kāi)業(yè)不久仍在制定他們的社交媒體營(yíng)銷(xiāo)計(jì)劃；社交媒體營(yíng)銷(xiāo)計(jì)劃受集團(tuán)總部控制，且負(fù)責(zé)人不在海南；沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的社交媒體營(yíng)銷(xiāo)部門(mén)等等。另有3酒店開(kāi)始愿意接受訪(fǎng)談，但在看完所問(wèn)問(wèn)題后拒絕了采訪(fǎng)。最終實(shí)際采訪(fǎng)的酒店數(shù)量為11家。

超高效液相色譜儀（ULC 510，杭州譜育科技發(fā)展有限公司）；三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源ESI，EXPEC 5210，杭州譜育科技發(fā)展有限公司）；數(shù)控超聲清洗儀（KQ-800DE，昆山市超聲儀器有限公司）；多管渦旋振蕩器（NMSG-12，泰州諾米醫(yī)療科技有限公司）；氮?dú)鉂饪s儀（EFAA-DC24-RT，上海安譜公司）；分析天平（BSA124S，德國(guó)Sartorius公司）；高速冷凍離心機(jī)（TGL-16M，湖南湘儀公司）；Milli-Q超純水機(jī)（Direct-Q 3UV，美國(guó)Millipore公司）；高剪切分散乳化機(jī)（FA25D，上海弗魯克公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 mg硝基呋喃類(lèi)代謝物標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

分別準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥少|(zhì)量濃度100 μg/L和10 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的硝基呋喃類(lèi)代謝物內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

分別準(zhǔn)確量取適量?jī)?nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥少|(zhì)量濃度100 μg/L的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

稱(chēng)取2 g空白基質(zhì)樣品于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇水溶液均質(zhì)離心棄去上清液，分別準(zhǔn)確加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液及內(nèi)標(biāo)工作液，按照前處理步驟處理，使最終質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0和20.0 μg/L，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度5.0 μg/L，按分析方法測(cè)試，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求線(xiàn)性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

取2 g試樣于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇水溶液均質(zhì)離心并棄去上清液。離心管中加入適量?jī)?nèi)標(biāo)工作液，渦旋混勻，加5 mL 0.5 mol/L的鹽酸溶液和0.15 mL 0.05 mol/L的2-硝基苯甲醛溶液，渦旋振蕩，置于超聲儀中超聲處理。

取出離心管冷卻，用1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，加入8 mL乙酸乙酯，振蕩均勻，冷凍離心后快速移取上清液，于40 ℃氮?dú)獯蹈?。?%甲醇溶解殘余物并定容至1.0 mL，將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，冷凍離心后溶液過(guò)微孔濾膜，待上機(jī)定量分析。

1.3 分析方法

色譜柱CNW C18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm），流速0.35 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積10 μL，流動(dòng)相A為2 mmol/L乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B為甲醇。梯度洗脫：0～0.5 min，A保持90%，0.5～4 min，A由90%變?yōu)?%，4～5 min，A保持5%，5～5.5 min，A由5%變?yōu)?0%，并保持2 min。

電噴霧離子源（ESI）正負(fù)離子切換模式，ESI+電離電壓5.0 kV，ESI-電離電壓4.2 kV，去溶劑氣溫度480 ℃，霧化氣流量1.2 mL/min，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），監(jiān)測(cè)離子參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 硝基呋喃代謝物及同位素內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相體系選擇

流動(dòng)相直接影響目標(biāo)化合物的峰形及離子化效率，液質(zhì)常用甲醇水體系和乙腈水體系流動(dòng)相。流動(dòng)相中加入甲酸可提高正離子模式的離子化效率，但會(huì)抑制負(fù)離子的響應(yīng)，加入乙酸銨調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH，改善色譜峰形，增強(qiáng)化合物在C18色譜柱上的保留。采用CNW C18色譜柱考察目標(biāo)化合物在2種流動(dòng)相體系下的分離情況。梯度洗脫條件下，甲醇水體系作為流動(dòng)相時(shí)，5種硝基呋喃代謝物及內(nèi)標(biāo)的分離效果和響應(yīng)更好，添加2 mmol/L乙酸銨改善峰形。使用乙酸銨溶液（2 mmol/L）和甲醇為流動(dòng)相測(cè)得5種硝基呋喃代謝物的色譜圖如圖1所示。

圖1 乙酸銨溶液（2 mmol/L）和甲醇流動(dòng)相測(cè)得硝基呋喃代謝物色譜圖

2.2 前處理方法優(yōu)化

2.2.1 超聲溫度優(yōu)化

空白雞肉試樣中加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，添加濃度1.0 μg/kg，按照1.2.2處理樣品，水浴溫度分別設(shè)為40，50，55，60和70 ℃，衍生時(shí)間設(shè)定為80 min。超聲溫度從40 ℃升高到60 ℃時(shí)，隨衍生反應(yīng)溫度升高，5種硝基呋喃代謝物的回收率增加；衍生溫度超過(guò)60 ℃時(shí)，回收率升高不明顯?？紤]到溫度對(duì)衍生產(chǎn)物的影響，選取60 ℃為超聲輔助衍生的反應(yīng)溫度。5種硝基呋喃代謝物在不同超聲溫度下的回收率如圖2所示。

圖2 超聲溫度對(duì)5種硝基呋喃代謝物回收率的影響

2.2.2 超聲時(shí)間優(yōu)化

空白雞肉試樣中加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0 μg/kg，按照1.2.2處理樣品，超聲時(shí)間分別設(shè)為30，60，80，100，120和140 min，衍生溫度設(shè)定為60 ℃。超聲時(shí)間30～80 min時(shí)，隨著衍生反應(yīng)時(shí)間增加，5種硝基呋喃代謝物的回收率逐漸升高。超聲時(shí)間80～120 min時(shí)，2-NP-AHD、2-NP-AOZ和2-NPSEM的回收率升高緩慢，而2-NP-AMOZ和2-NP-DNSA的回收率降低。超聲時(shí)間超過(guò)120 min后，5種硝基呋喃代謝物的回收率降低。超聲輔助有助于硝基呋喃代謝物從蛋白中解離，有利于衍生反應(yīng)，但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致衍生產(chǎn)物分解，故選取80 min為超聲輔助衍生的反應(yīng)時(shí)間。5種硝基呋喃代謝物在不同超聲時(shí)間下的回收率如圖3所示。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)5種硝基呋喃代謝物回收率的影響

2.2.3 萃取條件優(yōu)化

空白雞肉試樣中加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，添加濃度1.0 μg/kg，按照1.2.2處理樣品，加入乙酸乙酯萃取后，選擇常溫離心、冷凍離心及乙酸乙酯多次提取等方式優(yōu)化萃取條件。常溫離心后，移取上清液時(shí)會(huì)帶入少量油脂；冷凍離心時(shí)，動(dòng)物油脂會(huì)成團(tuán)附著在離心管壁，易得到純凈的上清液。乙酸乙酯多次提取，能提高硝基呋喃代謝物回收率。比較常溫離心、冷凍離心及冷凍離心和多次萃取等方法得到5種硝基呋喃類(lèi)代謝物回收率，如圖4所示，通過(guò)冷凍離心和乙酸乙酯多次萃取能獲得較高的回收率。

圖4 萃取條件對(duì)5種硝基呋喃代謝物回收率的影響

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

液質(zhì)測(cè)定基質(zhì)樣品時(shí)，樣品中的共流出物影響目標(biāo)化合物離子化，從而影響檢測(cè)的選擇性、靈敏度和重復(fù)性，這種現(xiàn)象基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)（ME）可通過(guò)化合物在空白基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率和基質(zhì)溶液中標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率的相對(duì)比值評(píng)價(jià)。在實(shí)際樣品測(cè)試中，ME相對(duì)比值在80%～120%時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯；ME相對(duì)比值小于80%或大于120%時(shí)，表明基質(zhì)抑制或基質(zhì)增強(qiáng)。

結(jié)果表明，雞肉試樣中5種硝基呋喃代謝物的基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算結(jié)果在80%～120%范圍內(nèi)，表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯。

表2 雞肉試樣中5種硝基呋喃代謝物的基質(zhì)效應(yīng)

2.4 線(xiàn)性關(guān)系、檢出限和定量限

空白雞肉試樣中加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在線(xiàn)性范圍（0.5～20.0 μg/L）內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好（r≥0.998 5）。以大于3倍信噪比（rSN，峰-峰）為檢出限，大于10倍信噪比（rSN，峰-峰）為定量限。線(xiàn)性回歸方程、線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見(jiàn)表3。

表3 雞肉試樣中硝基呋喃代謝物的線(xiàn)性關(guān)系和檢出限

結(jié)果表明，5種硝基呋喃代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r≥0.998 5，檢出限在0.02～0.06 μg/kg范圍內(nèi)，定量限在0.05～0.21 μg/kg范圍內(nèi)，優(yōu)于GB 31656.13—2021要求。

2.5 回收率和精密度

空白雞肉試樣中加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5，1.0，2.5和5.0 μg/kg，在4個(gè)加標(biāo)水平下進(jìn)行6次試驗(yàn)，考察方法回收率和精密度。結(jié)果表明，在0.5，1.0，2.5和5.0 μg/kg加標(biāo)水平下的平均回收率在72.0%～100.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）在2.2%～6.2%（n=6），符合GB 31656.13—2021要求。4個(gè)加標(biāo)水平下的回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 雞肉試樣中硝基呋喃代謝物回收率和精密度結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)檢測(cè)方法和前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，建立超聲輔助衍生-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肉中5種硝基呋喃代謝物殘留量的分析方法，并驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍、檢出限、定量限、回收率及精密度等方法學(xué)指標(biāo)。該方法快速簡(jiǎn)便，靈敏度高，重復(fù)性好，方法學(xué)性能指標(biāo)滿(mǎn)足GB 31656.13—2021要求，適用于雞肉中硝基呋喃代謝物的檢測(cè)分析，并為其快速抽檢和硝基呋喃類(lèi)獸藥監(jiān)測(cè)提供參考。