MIP-SPE-HPLC法測定功能性油脂中15種多環(huán)芳烴

鄧龍，周思 ，羅曉燕，黃佳佳

1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院（廣州 510520）；2.廣州市疾病預(yù)防控制中心（廣州 510440）

多環(huán)芳烴（PAHs）是一類具有重大健康危害的持久性有機(jī)污染物[1-3]。油脂是人體攝入PAHs的主要來源之一[4-5]。國內(nèi)外對油脂中的PAHs均有嚴(yán)格限量規(guī)定[6-7]。功能性油脂作為一類具有調(diào)節(jié)機(jī)體、預(yù)防疾病等保健功能的特殊油脂類物質(zhì)，產(chǎn)品受眾多為嬰幼兒、孕婦、老年人等敏感人群，相關(guān)產(chǎn)品中PAHs含量水平檢測暫未見專門報道[6,8]。建立穩(wěn)定可靠的功能性油脂中PAHs篩查方法、掌握市售功能性油脂產(chǎn)品中PAHs污染現(xiàn)狀并提示風(fēng)險，可為人群健康及相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供參考。15種目標(biāo)PAHs理化性質(zhì)參數(shù)見表1。

PAHs檢測儀器方法成熟，以氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和高效液相色譜熒光檢測器法為主，后者靈敏度相對更高[9-14]。功能性油脂中PAHs含量水平低和基質(zhì)干擾嚴(yán)重是檢測面臨的主要挑戰(zhàn)，如何進(jìn)行樣品前處理十分重要。多采用皂化、液液萃取、超聲萃取等提取，凝膠色譜、固相萃取等凈化[14]，操作繁瑣，穩(wěn)定性和重復(fù)性欠佳[15-16]。分子印跡固相萃?。∕IPSPE）基于選定的模板分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行識別，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的高效提取與富集，操作簡單，已應(yīng)用于不同樣品中PAHs的處理[17-20]。受濃縮過程易損失、印跡模板吸附不牢等因素影響，輕質(zhì)多環(huán)芳烴穩(wěn)定性與回收率欠佳，仍待進(jìn)一步研究[9,17,19-20]。

試驗(yàn)結(jié)合分子印跡固相萃取技術(shù)與高效液相色譜熒光檢測器法，逐一優(yōu)化淋洗、洗脫、濃縮等條件，旨在建立一種穩(wěn)定可靠的功能性油脂中PAHs檢測方法，并對市售功能性油脂產(chǎn)品中PAHs污染水平進(jìn)行篩查與風(fēng)險分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

功能性油脂27款（購于當(dāng)?shù)厣痰昊螂娚唐脚_），包括魚油（4款）、魚肝油（3款）、米糠油（2款）、葡萄籽油（2款）、紫蘇油（1款）、月見草油（2款）、胚芽油（4款）、沙棘子油（1款）、紅花籽油（2款）、鱷梨油（1款）、藻油（3款）、海藻油（2款）。15種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量濃度2 000 μg/mL，北京壇墨公司）；乙腈、正己烷、二氯甲烷等試劑（色譜純，德國Merck公司）；多環(huán)芳烴分子印跡固相萃取柱（500 mg/6 mL，上海安譜科技股份有限公司）；PAH C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，美國Waters公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters ACQUITY Arc超高效液相色譜儀配熒光檢測器（美國Waters公司）；VORTEX MS3漩渦混合器（德國IKA公司）；FV64全自動智能氮吹儀（廣州得泰公司）；固相萃取裝置（美國Waters公司）；Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

目標(biāo)物用乙腈配制成質(zhì)量濃度100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃冰箱避光保存。吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度5.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20 ℃冰箱避光保存。使用時，用乙腈逐級稀釋成質(zhì)量濃度0.2，0.5，1.0，5.0，10和50 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品的提取與凈化

液體樣本混勻后直接取樣，膠囊樣本去殼混勻后取樣，準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確至0.01 g）樣本于10 mL具塞離心管中，加入3 mL正己烷，漩渦混勻。MIP-SPE柱用5 mL二氯甲烷、5 mL正己烷活化，將樣品溶液全部轉(zhuǎn)移至小柱，待自然流出，取6 mL正己烷淋洗，用8 mL二氯甲烷洗脫。洗脫液于帶刻度細(xì)底氮吹管25 ℃氮吹至100 μL，加入0.5 mL乙腈復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至非針式過濾瓶，待上機(jī)測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱PAH C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；進(jìn)樣量10 μL：柱溫30 ℃；流動相為乙腈-水溶液，流速1.2 mL/min，梯度洗脫程序：初始乙腈60%，15 min升至100%，保持10 min，1 min乙腈降至60%，保持9 min，總時長35 min。熒光檢測器激發(fā)-發(fā)射波長設(shè)置見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 淋洗溶劑的優(yōu)化

功能性油脂含有的大量甘油三酯及脂肪伴隨物是產(chǎn)生基質(zhì)干擾的主要原因[6]。使用分子印跡材料吸附目標(biāo)物后，用正己烷淋洗掉樣本基質(zhì)是減少干擾的關(guān)鍵[13]。15種目標(biāo)PAHs根據(jù)苯環(huán)數(shù)可以分為輕質(zhì)多環(huán)芳烴（LPAHs）、中質(zhì)多環(huán)芳烴（MPAHs）和重質(zhì)多環(huán)芳烴（HPAHs）。由于以LPAHs為模板形成的印跡空腔太小，無法選擇性富集樣品中的中質(zhì)、HPAHs[21]。商業(yè)化分子印跡材料多以4環(huán)及4環(huán)以上多環(huán)芳烴為模板，合成的分子印跡材料對LPAHs的特異性吸附不強(qiáng)，淋洗時容易從印跡空腔中洗脫，導(dǎo)致回收率偏低[17]。需細(xì)致優(yōu)化淋洗溶劑用量，保證回收率同時最大程度減少樣本基質(zhì)干擾。取0.1 mL質(zhì)量濃度50 μg/L的PAHs混標(biāo)溶液加入活化后的MIP-SPE柱，逐步加入9 mL正己烷淋洗，淋洗液氮吹至0.5 mL后上機(jī)測試，得到PAHs洗脫曲線，見圖1（A）。分別取0.5 g魚油、胚芽油、藻油樣品，用3 mL正己烷稀釋混勻加入活化后的MIP-SPE柱，逐步加入9 mL正己烷淋洗，淋洗液吹干后稱重，扣除氮吹管質(zhì)量為洗脫樣品質(zhì)量，得到樣品洗脫曲線，見圖1（B）。結(jié)合圖1（A和B）可以看出，淋洗溶劑體積6 mL時可去除90%以上的樣本基質(zhì)且LPAHs損失在5%以內(nèi)，MPAHs和HPAHs吸附穩(wěn)定，6 mL正己烷淋洗損失不到1%，故淋洗溶液體積選擇6 mL。

圖1 淋洗溶劑對回收率及凈化效果的影響

2.2 洗脫溶劑的優(yōu)化

PAHs辛醇-水分配系數(shù)較高，難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，常用萃取溶劑有正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙腈等[17-22]。正己烷洗脫力強(qiáng)，同時易將固相萃取小柱上殘存的脂肪伴隨物洗脫下來，使得非目標(biāo)化合物干擾增多。乙腈對樣品基質(zhì)的洗脫具有一定選擇性，但濃縮耗時，易導(dǎo)致LPAHs損失。試驗(yàn)比較二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮3種溶劑的洗脫效果，詳見圖2（A）。二氯甲烷作為洗脫溶劑效果最佳，15種PAHs的回收率均大于70.0%。進(jìn)一步優(yōu)化洗脫溶劑用量，洗脫溶劑用量對回收率的影響見圖2（B）。溶劑用量4 mL時，洗脫不充分，大部分HPAHs回收率偏低。溶劑用量增至8 mL時，15種PAHs的回收率均超過75.0%。進(jìn)一步增加溶劑用量，MPAHs和HPAHs回收率略有增加，LPAHs回收率降低。這是因?yàn)橄疵撊軇w積增加延長氮吹濃縮時間，導(dǎo)致LPAHs損失。因此，選擇8 mL二氯甲烷進(jìn)行洗脫。

2.3 氮吹條件的優(yōu)化

氮吹濃縮是前處理過程的最后環(huán)節(jié)，對苯環(huán)數(shù)少、分子量小的LPAHs影響尤為明顯[23]。由表1可知，LPAHs蒸汽壓大、沸點(diǎn)低，在濃縮過程中易揮發(fā)，導(dǎo)致回收率偏低。文獻(xiàn)報道的單因素試驗(yàn)研究顯示影響回收率的主要因素有氮?dú)鈮毫24]、水浴溫度[25]、濃縮體積[9]等，綜合最佳濃縮條件有待進(jìn)一步探究。試驗(yàn)用二氯甲烷配制質(zhì)量濃度1.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以15種PAHs的平均回收率為指標(biāo)，氮?dú)鈮毫?、水浴溫度、濃縮體積為變量，開展三因素四水平正交試驗(yàn)，因素水平表見表3，試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表4。根據(jù)方差R分析可得，對回收率的影響依次為濃縮體積＞氮?dú)鈮毫Γ舅囟?。通過比較K值得到試驗(yàn)最佳因素組合A2B1C3，按照正交試驗(yàn)所得最優(yōu)條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測得平均回收率為87.4%，略低于試驗(yàn)5的回收率87.8%，確定該正交試驗(yàn)的最優(yōu)選擇為A2B1C2，即25 ℃水浴加熱，8 psi氮?dú)鈮毫Φ担瑵饪s至100 μL。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

2.4 色譜條件的優(yōu)化

15種PAHs包含同分異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)相似物，需優(yōu)化色譜條件實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的色譜分離。使用常規(guī)C18色譜柱進(jìn)行分析，ACP、FLU等化合物保留時間接近，分離效果不佳?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)梯度洗脫條件實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物基線分離，但分析時間過長，不利于檢測工作的開展。試驗(yàn)選擇Waters PAH C18色譜柱對15種PAHs進(jìn)行分析，PAH C18柱根據(jù)PAHs的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對固定相進(jìn)行修飾，進(jìn)而改善峰型，提高目標(biāo)物分離度，在22 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)所有目標(biāo)物基線分離，ACP與FLU分離度大于1.5，目標(biāo)物峰型尖銳，對稱性好，檢測分離度和靈敏度得到大幅提高。15種PAHs色譜圖如圖3所示。此外，熒光檢測中激發(fā)波長和發(fā)射波長的選擇也會影響檢測靈敏度[22]。試驗(yàn)采用2D單通道模式優(yōu)化激發(fā)和發(fā)射波長，得到最佳信號響應(yīng)，優(yōu)化后的激發(fā)-發(fā)射波長見表2。

圖3 色譜圖

2.5 線性范圍與檢出限

在優(yōu)化條件下，測試1.3.1節(jié)配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以目標(biāo)物峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x，μg/L）進(jìn)行線性擬合。結(jié)果表明。15種PAHs在0.2～50 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.997。選擇低添加水平樣品，以3倍信噪比計算檢出限，以10倍信噪比計算定量限，結(jié)合樣品前處理過程，得到方法檢出限0.03～0.20 μg/kg、方法定量限0.1～0.6 μg/kg，詳見表5。

表5 化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、方法檢出限和方法定量限

2.6 回收率與精密度

采用試驗(yàn)方法對魚油樣本進(jìn)行低、中、高三水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個水平重復(fù)測定6次，結(jié)果見表6。結(jié)果表明，在加標(biāo)濃度范圍內(nèi)，15種待測物平均回收率為72.3%～98.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD，n=6）為2.1%～6.1%，方法回收率與精密度良好。

表6 加標(biāo)回收和精密度實(shí)測定結(jié)果（n=6）

2.7 實(shí)際樣品的測定

利用建立的方法對27份市售功能性油脂樣品進(jìn)行檢測，分析結(jié)果見表7。27份樣本均有不同程度的PAHs檢出，檢出種類包含15種PAHs，檢出率為7.4%～100.0%，檢出水平均值為0.61～7.15 μg/kg。從檢出物質(zhì)來看，檢出水平最高的是萘，其次是菲和芘，檢出水平最低的是二苯并[a,h]蒽。參考GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》限量標(biāo)準(zhǔn)，檢出苯并[a]芘大于10 μg/kg的樣本1份。參考?xì)W盟（EC）No 835/2011條例規(guī)定，檢出苯并[a]芘大于2 μg/kg的樣品4份，PAH4（苯并[a]蒽、?、苯并[b]熒蒽和苯并[a]芘4種PAHs）總量超過10 μg/kg的樣本2份，提示功能性油脂存在一定PAHs污染風(fēng)險。

表7 實(shí)際樣本測定結(jié)果

3 結(jié)論

建立功能性油脂中15種PAHs的分子印跡固相萃取-高效液相色譜熒光檢測方法。通過優(yōu)化淋洗、洗脫、濃縮條件，有效提高了LPAHs回收率。15種PAHs回收率在72.3%～98.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.1%。相比于國標(biāo)方法，前處理操作簡單，有機(jī)試劑消耗量少，方法檢出限低。各項(xiàng)指標(biāo)均能滿足日常檢測分析要求，適用于功能性油脂中PAHs的測定。采用試驗(yàn)方法對27份市售樣本進(jìn)行篩查，提示我國功能性油脂產(chǎn)品受到不同程度PAHs污染，15種目標(biāo)PAHs檢出率為100.0%，檢出水平為0.61～7.15 μg/kg，部分產(chǎn)品苯并[a]芘、PAH4值超出參考限值標(biāo)準(zhǔn)，需進(jìn)一步監(jiān)測以全面評估其健康風(fēng)險。