LC-AJS ESI-MS/MS同時測定果露酒中7種甜味劑、2種防腐劑和檸檬酸

孫莉，周玉，余義，劉智康，毛從興，唐艷榮

1.黃鶴樓酒業(yè)有限公司（武漢 430050）；2.湖北信嘉檢測科技有限公司（咸寧 437000）；3.黃鶴樓酒業(yè)（咸寧）有限公司（咸寧 437000）

果露酒是以醇化果加酒精、果汁、水調(diào)制而成的露酒。果露酒屬于露酒。相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對露酒的定義，露酒是以蒸餾酒、清香型汾酒或食用酒精為酒基，以藥食兩用的動植物精華，按先進(jìn)工藝加工而成，改變其原酒基風(fēng)格的飲料酒。果露酒是以葡萄、獼猴桃或其他漿果等為原料，經(jīng)分選、破碎、去梗、發(fā)酵、儲酒、調(diào)配釀制成別有風(fēng)味的葡萄酒、獼猴桃酒等美味酒。

隨著科技的不斷發(fā)展，許多企業(yè)為追求利潤的最大化，以及用最短的時間生產(chǎn)出更多的果露酒，往往會選擇通過往酒基中添加各種食品添加劑，以此達(dá)到高產(chǎn)的效果。而過多的添加劑被人體吸收后，人體器官如果不能及時代謝掉，如人工合成的阿斯巴甜、紐甜等，并且過多的使用食品添加劑導(dǎo)致身體器官代謝負(fù)擔(dān)過重，長此以往將會導(dǎo)致身體各項機(jī)能的下降，嚴(yán)重危害人體健康。

針對食品添加劑的檢測方法有許多，如液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、離子交換法等，試驗通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對果露酒中7種甜味劑、2種防腐劑和檸檬酸進(jìn)行定性和定量分析。針對目標(biāo)物濃度殘留的問題進(jìn)行分析，盡可能完善檢測方法，使方法對果露酒檢測的使用性達(dá)到最佳。利用檢測手段以期能更加及時有效地對果露酒產(chǎn)品中添加劑含量進(jìn)行控制，保護(hù)消費者的身體健康作出努力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純，J.TBaker）；一級水（德國默克密理博有限公司）；乙酸銨、冰乙酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；異丙醇（色譜純，J.TBaker有限公司）；水相濾膜（0.22 μm，天津津騰實驗設(shè)備有限公司）；安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜、阿力甜、苯甲酸、山梨酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8%，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）：準(zhǔn)確稱取106 g亞鐵氰化鉀，加入適量一級水進(jìn)行超聲溶解，待溶解后用水定容至1 000 mL。

乙酸鋅溶液（183 g/L）：準(zhǔn)確稱取220 g乙酸鋅，加入適量一級水進(jìn)行超聲溶解后，加入30 mL冰乙酸，充分混勻后用水定容至1 000 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀、Agilent SBC18RRHD（2.1×50 mm，1.8 μm）色譜柱（美國Agilent公司）；電子天平（萬分之一，梅特勒托利多科技中國有限公司）；超聲波清洗池（KQ-250E型，昆山市超聲儀器有限公司）；抽濾裝置（1 000 mL，天津津騰實驗設(shè)備有限公司）；0.22 μm水相濾膜（天津津騰實驗設(shè)備有限公司）。

1.3 方法原理

對市購果酒和露酒進(jìn)行感官分析，對于澄清透明的樣品，采用加水稀釋，超聲混勻方式進(jìn)行前處理；對于渾濁度較高的樣品，采用加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液進(jìn)行沉淀，取上清液過0.22 μm濾膜上機(jī)檢測。前處理后的樣品進(jìn)入液相色譜進(jìn)行分離，經(jīng)質(zhì)譜檢測器進(jìn)行定性、定量分析，試驗方法均采用外標(biāo)法對樣品進(jìn)行含量測定。

1.4 試驗方法

1.4.1 流動相的配制

流動相A（0.1%乙酸-5 mmol/L乙酸銨溶液）：取1 mL乙酸（分析純）和0.39 g乙酸銨（分析純）加入1 000 mL一級水，經(jīng)過0.22 μm水相濾膜抽濾，超聲混勻除去CO2，超聲時間不宜過長，避免流動相基質(zhì)變化，影響色譜峰分離效果。

流動相B（甲醇）：色譜純，為避免抽濾過程中溶入其他雜質(zhì)，只需超聲除去CO2即可。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液

安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜、阿力甜標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 mg/L）：準(zhǔn)確稱取0.01 g標(biāo)準(zhǔn)品于6個100 mL容量瓶中，用一級水溶解并定容至刻度，充分混勻，放置于2～4 ℃冰箱冷藏儲存。

苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（500 mg/L）：準(zhǔn)確稱取0.05 g標(biāo)準(zhǔn)品于2個100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，充分混勻，放置于2～4 ℃冰箱冷藏儲存。

檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 000 mg/L）：準(zhǔn)確稱取0.1 g標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用一級水溶解并定容至刻度，充分混勻，放置于2～4 ℃冰箱冷藏儲存。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別吸取一定體積的上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中用一級水定容，混勻后得安賽蜜10.00 mg/L、糖精鈉10.00 mg/L、甜蜜素10.00 mg/L、三氯蔗糖20.00 mg/L、阿斯巴甜10.0 mg/L、紐甜10.0 mg/L、苯甲酸25.0 mg/L、山梨酸25 mg/L和檸檬酸50 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于2～4 ℃冰箱冷藏儲存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取適量體積的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用一級水配制成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4.4 儀器條件

1.4.4.1 色譜條件

Agilent SB-C18RRHD（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）色譜柱，流動相A為0.1%乙酸-5 mmol/L乙酸銨，流動相B為甲醇（梯度洗脫，見表1），流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

表1 梯度洗脫程序表

1.4.4.2 質(zhì)譜條件

帶有鞘氣的電噴霧離子源，正/負(fù)離子模式，帶鉑鎳涂層的導(dǎo)電毛細(xì)管，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，電子倍增電壓正模式200 V，負(fù)模式200 V，離子源溫度325 ℃，霧化氣流速8 L/min，氣簾氣壓30 psi，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速12 L/min，噴嘴電壓正模式300 V，負(fù)模式500 V，電噴霧電壓正模式3 500 V，負(fù)模式3 000 V，按此條件對10種食品添加劑的離子對進(jìn)行摸索分析，確定目標(biāo)化合物的離子對條件，見表2。

表2 10種食品添加劑的MRM參數(shù)

1.4.5 樣品的制備

稱取2 g酒樣于50 mL離心管中，對于澄清透明的樣品，加水稀釋至25 mL，超聲混勻后，取上清液過0.22 μm濾膜上機(jī)檢測；對于渾濁度較高的樣品，稱取2 g酒樣于50 mL離心管中，加水稀釋至25 mL，加入2 mL亞鐵氰化鉀（92 g/L）和2 mL乙酸鋅（183 g/L）溶液進(jìn)行沉淀，置于5 000 r/min離心機(jī)中離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜上機(jī)檢測。

1.4.6 空白試驗

按照樣品制備步驟不加樣品，進(jìn)行處理后上機(jī)檢測。

1.5 結(jié)果計算

樣品中10種食品添加劑的含量按（1）計算。

式中：X為樣品中10種食品添加劑含量，g/kg；c為測定溶液中10種食品添加劑含量，μg/L；c0為測定空白溶液中10種食品添加劑含量，μg/L；V為樣液的最終定容體積，mL；m為取樣量，g；f為樣品的稀釋倍數(shù)；1 000×1 000為μg/L轉(zhuǎn)換為g/kg的換算因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化

通過對10種食品添加劑物理和化學(xué)信息的分析，分別以0.1%乙酸-甲醇、5 mmol/L乙酸銨-甲醇、0.1%乙酸+5 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相進(jìn)行樣品分離。由于不同流動相的pH不同，對色譜柱中的填料物質(zhì)會起到一定作用，有的流動相有利于目標(biāo)物質(zhì)的分離，有的流動相則會抑制目標(biāo)物出峰，導(dǎo)致峰形異常，如峰拖尾、峰前伸、雙頭峰及鬼峰等現(xiàn)象，甚至于不出峰，均不利于對樣品進(jìn)行定性及定量分析。通過利用上述流動相對10種添加劑進(jìn)行色譜峰分離，準(zhǔn)備好單標(biāo)物質(zhì)，將準(zhǔn)備好的單標(biāo)物質(zhì)進(jìn)入色譜柱查看出峰效果，需保證保留時間、峰形、響應(yīng)均良好且分離效果好，靈敏度和響應(yīng)合適。結(jié)果表明，用0.1%乙酸+5 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相時，物質(zhì)分離度、峰形、響應(yīng)值及保留時間的穩(wěn)定性均優(yōu)于其他流動相，故選用0.1%乙酸+5 mmol/L乙酸銨-甲醇為流動相進(jìn)行洗脫。見圖1。

圖1 10種食品添加劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖

10種添加劑的出峰時間依次為：0.996 min，安賽蜜；1.500 min，阿力甜；2.045 min，糖精鈉蜜；3.000 min，甜蜜素；4.522 min，三氯蔗糖；4.846 min，阿斯巴甜；5.000 min，苯甲酸；5.100 min，山梨酸；6.460 min，紐甜；11.500 min，檸檬酸。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將單標(biāo)純品目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液不經(jīng)過色譜柱注入質(zhì)譜，分別進(jìn)行正、負(fù)離子模式，在Scan狀態(tài)下進(jìn)行全掃描檢測，得到TIC總離子流圖，根據(jù)總離子流圖標(biāo)記出特征離子峰，進(jìn)行SIM模式掃描，將標(biāo)記出的準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行單獨掃描，得到EIC提取離子流圖。用碰撞氣惰性氣體高純氮氣攻擊該前體離子，獲得其二級質(zhì)譜圖及相應(yīng)的子離子。由于試驗方法是同時分析10種目標(biāo)物質(zhì)，且各物質(zhì)間質(zhì)荷比差異較大，所以在進(jìn)行電離模式選擇時發(fā)現(xiàn)有的目標(biāo)物在正離子模式下靈敏度及響應(yīng)比負(fù)離子模式更高，而有的目標(biāo)物則恰恰相反，所以試驗方法中既有正離子模式也有負(fù)離子模式的存在，但2種模式同時存在則對電離毛細(xì)管的要求較高，需使用帶有鉑鎳涂層的導(dǎo)電毛細(xì)管，才能在短時間內(nèi)完成正負(fù)模式的快速切換。利用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）對選定的定性離子和定量離子對裂解電壓、毛細(xì)管電壓、碰撞能、保留時間、碰撞池加速電壓等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使各監(jiān)測離子豐度和信號達(dá)到最佳。

通過設(shè)置Precursor Ion模式對母離子進(jìn)行確認(rèn)，通過設(shè)置Product Ion模式下，利用碰撞池電壓對母離子進(jìn)行轟擊，得到相應(yīng)的子離子碎片，選擇其中離子豐度高的離子作為子離子，且每種化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應(yīng)包括1個母離子和2個子離子，試驗方法通過設(shè)置均能確定10種添加劑的母離子和2個子離子。

經(jīng)過質(zhì)譜條件設(shè)置，確定試驗方法采用正、負(fù)離子模式采集，該模式下的質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和方法檢出限、定量限

將配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液按優(yōu)化好的儀器條件上機(jī)進(jìn)行測定，以目標(biāo)組分色譜峰面積對相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸分析，得到各自的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。參考GB/T 27417—2017《合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》中檢出限和定量限的評定方法，采用信噪比法評估檢出限和定量限，檢出限可接受的信噪比≥3∶1，定量限可接受的信噪比≥10∶1。為保證方法的實用性，選擇將10種添加劑分別加入果露酒酒基中（蒸餾酒、清香型白酒或食用酒精），模擬10種添加劑在酒基中的狀態(tài)，選擇食用酒精為基質(zhì)，在食用酒精樣品中添加10種添加劑的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，進(jìn)行方法檢出限和定量限的探底試驗。在保證信噪比滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)使用要求的前提下，也要保證峰形的完整，且峰形無異常，通過對方法的優(yōu)化確?；|(zhì)對方法檢測結(jié)果影響最小。分別對各目標(biāo)化合物線性范圍的最低濃度點進(jìn)行信噪比分析，結(jié)果見表3。

表3 10種食品添加劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.3 回收率和精密度

市面上果酒和露酒品種繁多，比較有代表性的是雞尾酒、葡萄酒、各種花釀的酒，故選取雞尾酒、葡萄酒和玫瑰花酒3種果露酒進(jìn)行加標(biāo)回收試驗。在稱取好的樣品中準(zhǔn)確加入一定量的10種食品添加劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低、中、高3個不同添加水平，按上述試驗方法前處理，平行測定6次，扣除樣品本底含量后計算結(jié)果見表4。

表4 果露酒中10種食品添加劑的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

經(jīng)檢測，所選取的樣品中雞尾酒、葡萄酒和玫瑰花酒中山梨酸、苯甲酸和檸檬酸各自有檢出，本底值在1.10×10-3～3.20×10-3g/kg之間，其他7種甜味劑均未檢出?？鄢龢悠繁镜字岛笥嬎憬Y(jié)果表明，各目標(biāo)化合物平均加標(biāo)回收率在88.4%～110%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～7.6%，方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合食品中添加劑殘留量分析的要求。

3 結(jié)論

建立液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)檢測方法，使用AJS ESI離子源同時測定果露酒中7種甜味劑、2種防腐劑和檸檬酸含量的方法，并對該方法進(jìn)行了優(yōu)化處理。從多方面保證方法對于果露酒檢測的準(zhǔn)確性和適用性，最大限度降低基質(zhì)效應(yīng)對于檢測結(jié)果的影響。為驗證方法的實用性，參考相關(guān)方法驗證學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，從多角度、多維度對試驗方法進(jìn)行方法學(xué)驗證，保證方法的完整性和全面性。試驗方法前處理簡單易操作，有效去除蛋白和色素問題，檢測靈敏度高，適合對果露酒中10種添加劑進(jìn)行大批量定性篩查和定量分析，為食品安全監(jiān)測提供技術(shù)支持。