液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)奶茶中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的研究及消除

景贊，呂雪梅，劉超

樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（樂(lè)山 614000）

三聚氰胺俗稱密胺、蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物[1]，是一種化工原料，禁止添加到食品中。在世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單初步整理參考中，三聚氰胺就在2B類致癌物清單中[2]。

三聚氰胺的檢測(cè)方法主要有重量法、電位滴定法、高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法和液質(zhì)聯(lián)用法[3-5]等。液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定復(fù)雜基質(zhì)時(shí)具有選擇性好、分析效率高、靈敏度高、定性能力強(qiáng)、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[6-7]，因此廣泛應(yīng)用于食品分析中。但液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)食品中三聚氰胺時(shí)存在顯著的基質(zhì)效應(yīng)，必須采取有效的措施減弱或消除基質(zhì)效應(yīng)才能夠得到準(zhǔn)確的結(jié)果[8]。

基質(zhì)效應(yīng)是指因目標(biāo)分析物不穩(wěn)定或基質(zhì)中干擾組分讓目標(biāo)分析物發(fā)生改變，如聚合、酯化等，或者是干擾組分與目標(biāo)分析物的保留時(shí)間相同，干擾組分弱化了目標(biāo)分析物的離子化[9-11]。試驗(yàn)通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究了奶茶中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響因素，采用內(nèi)標(biāo)法[13-15]消除檢測(cè)過(guò)程中的基質(zhì)效應(yīng)，為進(jìn)一步尋找消除基質(zhì)效應(yīng)，提高LC-MS/MS分析測(cè)定乳制品中三聚氰胺殘留結(jié)果的準(zhǔn)確度與精確度提供了方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

DGU-20 A-API 3200高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（AB SCIEX公司）；HSC-B氮吹儀（廣市錦卓?jī)x器設(shè)備有限公司）；KQ-1 000 VDE數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山舒美超聲儀器有限公司）；JRY 12固相萃取儀（湖南金蓉儀器設(shè)備有限公司）；ES-E 120 B II電子天平（天津市德安特傳感技術(shù)有限公司）；FUP PT 18 H高速冷凍離心機(jī)（青島法特通訊科技有限公司）；SHA-B數(shù)顯恒溫水浴振蕩器（唐山力辰科技有限公司）；WCX前處理小柱[60 mg/3 mL，沃特世科技（上海）有限公司]；Cleanert PCX前處理小柱（60 mg/3 mL，天津艾杰爾科技有限公司）；Bond Elut Plexa PCX前處理小柱（60 mg/3 mL，安捷倫科技有限公司）。

1.2 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純）：成都市諾爾施科技有限責(zé)任公司；三氯乙酸（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（99.0% Lot：G 133044，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品（Melamine-13 C 3 100 μg/mL 壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；水（實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水）；奶茶：香飄飄奶茶：香飄飄食品股份有限公司、阿薩姆奶茶：統(tǒng)一集團(tuán)有限公司、麥德龍紅茶拿鐵奶茶：麥德龍商業(yè)集團(tuán)有限公司、立頓奶茶：聯(lián)合利華（中國(guó)）有限公司、良品鋪?zhàn)痈凼侥滩瑁毫计蜂佔(zhàn)庸煞萦邢薰?、立頓速溶固體抹茶原味奶茶：聯(lián)合利華（中國(guó)）有限公司、天美華乳速溶奶茶：天美華乳食品有限責(zé)任公司、鹿角袋手工現(xiàn)泡奶茶：臺(tái)灣鹿角巷奶茶有限公司。

1.3 樣品處理

奶茶中三聚氰胺的提取、凈化參照GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》[16]“4.4.1.1小節(jié)”、“4.4.2小節(jié)”處理。

1.4 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱取10 mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品至10 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.5 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)及內(nèi)標(biāo)中間液

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確移取25 μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

三聚氰胺內(nèi)標(biāo)中間液：準(zhǔn)確移取250 μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.6 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜檢測(cè)條件

1.6.1 液相條件

色譜柱：CAPCELL PAK CR（1∶4，150 mm×2.0 mm，5 μm）

流動(dòng)相：乙酸銨溶液-乙腈1∶1（V/V），用乙酸調(diào)至pH 3；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min。

1.6.2 質(zhì)譜條件

掃描方式：電噴霧正離子掃描；IS：4 500 V；GS1：30 psi；GS2：30 psi；溫度：450 ℃。

1.7 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方法

運(yùn)用定量測(cè)定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛确治鑫锏碾x子響應(yīng)程度，通過(guò)式（1）計(jì)算二者比值來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。

式中：A和B為基質(zhì)溶液和純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e。當(dāng)A/B＜80%時(shí)，對(duì)分析物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制作用；當(dāng)A/B＞120%，對(duì)分析物的響應(yīng)產(chǎn)生增強(qiáng)作用；80%＜A/B＜120%，不存在基質(zhì)效應(yīng)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 取樣量對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

分別稱取0.50 g和1.00 g（精確至0.01 g）不同種類的奶茶，按照“1.3小節(jié)”進(jìn)行溶劑的提取和凈化，處理后通過(guò)LC-MS/MS分析測(cè)定并記錄三聚氰胺峰面積A、B（A表示基質(zhì)提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e），將A、B代入SPSS 20.0軟件，考察不同取樣量對(duì)基質(zhì)效應(yīng)是否有顯著性影響，結(jié)果見(jiàn)表2和圖1。

圖1 取樣量對(duì)8種奶茶中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

表2為取樣量對(duì)三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。由表1可知，雪奶茶中P值均＜0.05，表明取樣量對(duì)三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)存在顯著性差異，有明顯的基質(zhì)效應(yīng)，因此取樣量是影響奶茶三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的主要因素之一，原因可能為奶茶的制作工藝不同或奶茶的廠家原料不同。由圖1可知，取樣量為0.50和1.00 g時(shí)，奶茶的三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)為27.84%～39.19%和16.06%～27.62%之間。

表1 三聚氰胺及其內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)

表2 取樣量對(duì)三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

2.2 溶劑種類對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

分別稱取4份不同種類的奶茶，各1.00 g（精確至0.01 g），每個(gè)種類奶茶的4份樣品中分別加入10 mL水、6 mL乙腈-4 mL水、10 mL三氯乙酸（1%）以及8 mL三氯乙酸（1%）-2 mL乙腈，按照“1.3小節(jié)”進(jìn)行溶劑的提取和凈化，處理后通過(guò)LC-MS/MS分析測(cè)定并記錄三聚氰胺峰面積A、B（A表示基質(zhì)提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e），將A、B代入SPSS 20.0軟件，考察溶劑種類對(duì)基質(zhì)效應(yīng)是否有顯著性影響，結(jié)果見(jiàn)表3和圖2。

圖2 溶劑種類對(duì)奶茶中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

表3 溶劑種類對(duì)三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

由表3可知，奶茶中P值均＜0.05，表明溶劑種類對(duì)三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)存在顯著性差異，有明顯的基質(zhì)效應(yīng)，因此溶劑種類是影響奶茶三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的主要因素之一，原因可能為奶茶的制作工藝不同，奶茶的廠家原料不同等。由圖2得，溶劑種類分別為水、乙腈-水3∶2（V/V）、三氯乙酸、三氯乙酸-乙腈4∶1（V/V）時(shí)，奶茶三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)分別在29.59%～40.82%，22.68%～34.56%，14.25%～26.13%和15.55%～27.21%之間。其中，當(dāng)溶劑為三氯乙酸和三氯乙酸-乙腈4∶1（V/V）之間時(shí)，對(duì)三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)無(wú)顯著性差異，故這二者之間不存在基質(zhì)效應(yīng)。

2.3 溶劑用量對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

分別稱取3份不同種類的奶茶，各1.00 g（精確至0.01 g），每個(gè)品種奶茶3份樣品分別加入4 mL三氯乙酸-1 mL乙腈、8 mL三氯乙酸-2 mL乙腈以及12 mL三氯乙酸-3 mL乙腈，按照“1.3小節(jié)”進(jìn)行溶劑的提取和凈化，處理后通過(guò)LC-MS/MS分析測(cè)定并記錄三聚氰胺峰面積A、B（A表示基質(zhì)提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e），將A、B代入SPSS 20.0軟件，考察溶劑用量對(duì)基質(zhì)效應(yīng)是否有顯著性影響，結(jié)果見(jiàn)表4和圖3。

圖3 溶劑用量對(duì)奶茶中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

表4 溶劑用量對(duì)三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

由表4可知，奶茶P值均＜0.05，表明溶劑用量對(duì)三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)存在顯著性差異，因此溶劑的用量是影響奶茶三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的主要因素之一，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能為生產(chǎn)奶茶的廠家配方不同。由圖3可得，溶劑的用量分別為5，10和15 mL時(shí)，奶茶的三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)分別為26.82%～39.27%，16.31%～28.11%和12.45%～24.25%之間。

2.4 不同濃度三聚氰胺對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

分別稱取3份不同種類的奶茶，各1.00 g（精確至0.01 g），按照“1.3小節(jié)”進(jìn)行溶劑的提取和凈化，處理后在3份樣品中分別加入10，50和100 μL三聚氰胺中間溶液，通過(guò)LC-MS/MS分析測(cè)定并記錄三聚氰胺峰面積A和B（A表示基質(zhì)提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e），將A、B代入SPSS 20.0軟件，考察不同濃度對(duì)基質(zhì)效應(yīng)是否有顯著性影響，結(jié)果見(jiàn)表5和圖4。

圖4 不同濃度三聚氰胺對(duì)奶茶中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

表5 不同濃度三聚氰胺對(duì)三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

由表5可知，奶茶P值均＞0.05，表明不同濃度三聚氰胺對(duì)三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)沒(méi)有產(chǎn)生顯著性差異，無(wú)明顯的基質(zhì)效應(yīng)，因此不同濃度三聚氰胺不是影響奶茶三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的主要因素之一。

2.5 凈化方式對(duì)三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

分別稱取4份不同種類的奶茶，各1.00 g（精確至0.01 g），按照“1.3小節(jié)”進(jìn)行溶劑的提取和凈化，不同種類的奶茶的4份樣品分別按照凈化液不過(guò)柱、過(guò)WCX固相萃取柱、過(guò)Cleanert PCX固相萃取柱，過(guò)Bond Elut PCX固相萃取柱的方式處理，以上溶液分別通過(guò)LC-MS/MS分析測(cè)定并記錄三聚氰胺峰面積A和B（A表示基質(zhì)提取溶液分析物的峰面積，B表示同濃度純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e）。將A和B代入SPSS 20.0軟件，考察不同凈化方式對(duì)基質(zhì)效應(yīng)是否有顯著性影響，結(jié)果見(jiàn)表6和圖5。

圖5 凈化方式對(duì)奶茶中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

圖6 三聚氰胺及其內(nèi)標(biāo)一級(jí)質(zhì)譜圖

圖7 三聚氰胺內(nèi)標(biāo)二級(jí)質(zhì)譜圖

圖8 三聚氰胺二級(jí)質(zhì)譜圖

表6 凈化方式對(duì)三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

由表6可知，過(guò)SPE小柱和不過(guò)SPE小柱之間有顯著性差異，存在基質(zhì)效應(yīng)；而過(guò)不同SPE小柱之間無(wú)顯著性差異，不存在基質(zhì)效應(yīng)，因此凈化方式為影響奶茶三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響因素之一。由圖5可知，不過(guò)柱、WCX、Cleanert PCX、Bond Elut Plexa PCX時(shí)，奶茶的三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)分別在11.45%～23.33%，15.55%～27.43%，14.04%～25.92%和14.90%～26.57%之間。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)的消除

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：移取6份體積不同的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液至25 mL容量瓶中，加入相同體積的三聚氰胺內(nèi)標(biāo)工作液，用50%的甲醇水溶液定容至刻度線處，所得樣品溶液質(zhì)量濃度為10，20，40，80，160和200 ng/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，每毫升三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液中含有三聚氰胺內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為20 ng/mL，濃度由低到高進(jìn)樣檢測(cè)。以三聚氰胺濃度和三聚氰胺峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，見(jiàn)表7。

表7 三聚氰胺線性方程

取空白樣品9份至9個(gè)50 mL的離心管中，加入20 μL的內(nèi)標(biāo)中間液，分別加入25.0，50.0和100.0 μL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液，做三水平三平行回收試驗(yàn)，按照“1.3小節(jié)”提取和凈化處理，記錄各樣品三聚氰胺峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積，計(jì)算加標(biāo)回收率。

由表8可知，隨著加標(biāo)濃度的變化，奶茶中三聚氰胺加標(biāo)回收率在101%～108%之間，表明方法準(zhǔn)確，內(nèi)標(biāo)法對(duì)三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的消除具有非常顯著的效果，很大程度上消除了基質(zhì)效應(yīng)，達(dá)到了理想的試驗(yàn)效果。

表8 奶茶中三聚氰胺加標(biāo)回收率（n=3）

3 結(jié)論

液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)奶茶中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于選自不同種類的奶茶，改變?nèi)恿?、溶劑的種類、溶劑的用量、不同濃度三聚氰胺和凈化方式，其檢測(cè)過(guò)程中產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)相差較為明顯，試驗(yàn)結(jié)果表明：取樣量、溶劑種類[除三氯乙酸與三氯乙酸-乙腈4∶1（V/V）之間外]、溶劑用量、凈化方式對(duì)三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)均存在顯著性差異，而不同三聚氰胺濃度對(duì)三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)均無(wú)顯著性差異，不存在基質(zhì)效應(yīng)。