固相萃取-液相色譜/質(zhì)譜法測定堅(jiān)果中7種真菌毒素

袁光蔚，莫紫梅，王海波，李銳，韋蘭青

廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測中心（南寧 530025）

堅(jiān)果是一類具有堅(jiān)硬外殼的植物果實(shí)，其風(fēng)味獨(dú)特，并含有大量功能性生物活性成分，具有抗衰老、預(yù)防糖尿病、減肥等多重保健作用，備受消費(fèi)者青睞[1-2]。然而，堅(jiān)果在整個(gè)生長周期以及生產(chǎn)、加工、貯藏、銷售過程中極易受真菌侵染，產(chǎn)生并積累多種毒性代謝產(chǎn)物，這些毒素大多具有致畸、致癌、致突變等毒性，給食品安全及人類健康造成巨大的安全隱患[3]。

鑒于真菌毒素的危害，許多國家和地區(qū)均制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)和檢測方法[4-5]。在真菌毒素的檢測技術(shù)中，基于免疫學(xué)的快速篩查技術(shù)體系已基本建成[6-8]，在精準(zhǔn)定量檢測方面，液相色譜法作為當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室的主流檢測技術(shù)，特別是與質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用，憑借其強(qiáng)大的分離能力和較高的靈敏度、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性，成為當(dāng)前真菌毒素檢測領(lǐng)域最為可靠的檢測技術(shù)[9-17]。研究在相關(guān)文獻(xiàn)中真菌毒素提取、凈化技術(shù)的基礎(chǔ)上，分別以板栗和核桃作為淀粉類堅(jiān)果和油性堅(jiān)果的代表基質(zhì)[18]，綜合對(duì)比了幾款針對(duì)性較強(qiáng)的固相萃取小柱及QuEChERS技術(shù)的前處理效果，并結(jié)合UPLC-MS/MS的優(yōu)勢，建立了堅(jiān)果中較易受污染、國內(nèi)外關(guān)注度較高且毒性較強(qiáng)的7種主要真菌毒素的檢測方法，以期為堅(jiān)果中真菌毒素的質(zhì)量控制提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

樣品分別購自廣西區(qū)內(nèi)農(nóng)貿(mào)市場、超市等。

黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（AFB1、AFG2=0.3 μg/mL，AFB2、AFG2=1.0 μg/mL）（上海安譜璀世標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；赭曲霉毒素A（OTA）（10.05 μg/mL，美國o2si smart solutions公司）；T-2（100 μg/mL，北京曼哈格生物科技有限公司）；玉米赤霉烯酮（ZEN）（1 120 μg/mL，德國Witega公司）。

Anybond SinCHERS-Myco14 凈化小柱（Myco14，天津安邦鍵合科技有限公司）；MFC 100固相凈化柱[MFC100普瑞邦（北京）科技有限公司]；Mycosep?228多功能凈化柱（簡稱Mycosep228，美國ROMER公司）；QuEChERS基質(zhì)分散樣品制備包（4 g硫酸鎂，1 g氯化鈉，1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉，美國Waters公司）；分散型SPE凈化包（150 mg MgSO4，50 mg PSA和50 mg C18；貨號(hào)：60105-204，美國賽默飛公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，德國默克公司）；甲酸（色譜純，美國賽默飛公司）；乙酸銨（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

MS3002SE 電子天平（美國梅特勒-托利多METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Milli-pore公司）；KS260多管式渦旋震蕩器（德國 IKA公司）；S300H型超聲清洗儀（德國Elma公司）；ROTANTA460/460R型離心機(jī)（德國Hettich公司）；ACQUITY I-Class高效液相色譜儀（美國Waters公司）；TQ-XS質(zhì)譜儀[配有電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）及Masslynx 4.2工作站，美國Waters公司]。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

樣品經(jīng)粉碎，過0.425 mm篩后，混勻備用。稱取5 g樣品于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL乙腈-甲酸-水（84∶1∶15，V/V）混合提取液，超聲或者劇烈振蕩20 min，插入Myco14專用凈化小柱（小柱使用演示圖和實(shí)際操作圖見圖1上），下壓小柱至小柱內(nèi)壓出2 mL液體，將小柱內(nèi)凈化液體混勻，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾到進(jìn)樣小瓶中，上機(jī)測定。

圖1 凈化小柱使用演示圖（上為Myco14小柱，下為MFC100、Mycosep228小柱）

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

空白基質(zhì)溶液：取未檢出目標(biāo)物的板栗、核桃空白樣品，按1.3.1小節(jié)進(jìn)行處理，得空白基質(zhì)濾液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：將各原始標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別用乙腈溶解或稀釋，搖勻備用；分別準(zhǔn)確吸取7種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量于容量瓶中，用乙腈定容，搖勻即得。

基質(zhì)匹配混合工作曲線溶液：取空白基質(zhì)溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，配制成濃度比例為1∶2∶4∶10∶20∶40的系列混合工作曲線溶液。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：Waters CORTECSTM? UPLC? C18柱（1.6 μm，100 mm×2.1 mm）；柱溫40 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相A為含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）的甲酸和1 mmol/L乙酸銨的水溶液，流動(dòng)相B 為甲醇。梯度洗脫條件：0～0.5 min，90% A；0.5～6.0 min，90% A～50% A；6.0～7.0 min，50% A；7.0～9.0 min，50% A～5% A；9.0～12.0 min，5% A；12.0～12.1 min，5% A～90% A；12.1～15.0 min，90% A。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：ESI源；掃描方式：正離子；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；干燥氣溫度：500 ℃；霧化氣壓力：7.0 Bar；干燥氣流量：1 000 L/hr；氣簾氣流量：150 L/hr。

PIC參數(shù)：激活閾值：20倍背景；最小激活：5 000個(gè)計(jì)數(shù)點(diǎn)；重置閾值：50%激活值；質(zhì)量范圍：10 Da以上；最小質(zhì)量：40 Da；數(shù)據(jù)類型：棒狀圖；PIC持續(xù)時(shí)間：1秒。碰撞能量（eV）：與化合物所選定量離子碰撞能一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相條件和質(zhì)譜條件的確定

色譜柱、流動(dòng)相、柱溫見文獻(xiàn)[19]。因?yàn)榇舜卧囼?yàn)采集的化合物較少，故洗脫梯度在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了調(diào)整，縮短了洗脫時(shí)間，節(jié)省了分析時(shí)間，各化合物保留時(shí)間見表1。

表1 7種真菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)

取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣，利用Q1 MS Scan掃描模式確定各目標(biāo)物的最佳電離模式以及加合形式；利用Q2 MS/MS Daughter Scan掃描模式將母離子打碎，得到二級(jí)碎片離子，結(jié)合Mass Frontier 7.0軟件推測的化合物可能的質(zhì)譜轉(zhuǎn)換裂解途徑，確認(rèn)其二級(jí)特征碎片離子[19]，選擇響應(yīng)較高的兩個(gè)離子分別為定量離子和定性離子。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除T-2響應(yīng)最強(qiáng)分子離子峰為[M+NH4]+外，其余均為[M+H]+，7種化合物質(zhì)譜參數(shù)見表1，MRM圖譜見圖2。PIC，即Product Ion Confirmation（產(chǎn)物離子確認(rèn)），當(dāng)目標(biāo)離子的響應(yīng)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，即可觸發(fā)一次Daughter Scan模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，在進(jìn)行復(fù)雜基質(zhì)中痕量毒素的檢測時(shí)增加一種確證的手段，降低假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。

圖2 7種真菌毒素提取離子色譜圖

2.2 前處理方法的研究

2.2.1 提取溶劑的考察

目前，真菌毒素一般選擇有機(jī)溶劑和水的混合溶液進(jìn)行提取，甲醇和乙腈作為最常用的兩種有機(jī)溶劑，甲醇雖比乙腈具有更好的溶解性，但也易將樣品中的有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、脂肪、酚等物質(zhì)提取出來，導(dǎo)致提取液中雜質(zhì)較多，不利于后續(xù)凈化、分析，而乙腈對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀作用較強(qiáng)且共提物少，因此乙腈作為首選。物質(zhì)的解離度跟其pKa值和環(huán)境pH有直接關(guān)系[20]，提取溶劑的pH會(huì)顯著影響真菌毒素的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響其回收率。此次研究中OTA為含羧基毒素，以QuEChERS方法對(duì)不同提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取溶劑中加入1%的甲酸時(shí)，OTA在兩種基質(zhì)中的回收率由不加酸時(shí)的1%～5%提升到93%～97%，應(yīng)該是甲酸能使溶劑保持較低pH，進(jìn)而抑制目標(biāo)物的離子化，使其更易溶于有機(jī)相，達(dá)到增高提取效率和保持穩(wěn)定回收率的效果，同時(shí)，參考文獻(xiàn)[11,21]，最終確定提取溶劑為乙腈-甲酸-水（84∶1∶15，V/V）。

2.2.2 凈化方式的確定

此次研究主要通過回收率指標(biāo)分別考察Myco14、MFC100、Mycosep228凈化小柱及QuEChERS的凈化效果。（1）Myco14凈化小柱：見1.3.1小節(jié)；（2）MFC100、Mycosep228：樣品經(jīng)粉碎，過0.425 mm篩后，混勻備用；稱取5 g樣品于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL乙腈-甲酸-水（84∶1∶15，V/V）混合提取液，超聲或者劇烈振蕩20 min，按4 600 r/min離心5 min，取4 mL上清液至配套玻璃管中，然后用小柱推壓至液體全部通過，混勻，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾器過濾即得（小柱使用演示圖見圖1下）；（3）QuEChERS：在文獻(xiàn)[22]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了適當(dāng)改進(jìn)，稱取2 g樣品，加入20 mL乙腈-甲酸-水（84∶1∶15，V/V）混合提取液，振蕩提取20 min，加入QuEChERS基質(zhì)分散樣品制備包，渦旋1 min，離心，取1.5 mL上清液，加入分散型SPE凈化包，渦旋1 min，離心，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾器過濾即得。

試驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)，在以板栗為基質(zhì)進(jìn)行研究時(shí)，經(jīng)MFC100、Mycosep228、QuEChERS處理的濾液，均呈現(xiàn)不同程度的黃色，可直觀看出凈化效率欠佳，可對(duì)后續(xù)測定的色譜、質(zhì)譜系統(tǒng)造成污染，而以核桃為基質(zhì)進(jìn)行研究時(shí)，各濾液均為澄清。如圖3所示。

圖3 4種凈化方式的凈化效果（上為板栗基質(zhì)，下為核桃基質(zhì)）

取板栗、核桃空白樣品，加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按上述前處理步驟進(jìn)行處理，得各前處理方法回收溶液。然后取各方法空白基質(zhì)溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至恰當(dāng)濃度，利用單點(diǎn)法分別考察其前處理方法的回收率，結(jié)果見圖4和圖5。對(duì)回收率數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Myco14凈化小柱在兩種基質(zhì)中的回收率為83%～106%，所有化合物均有較好的回收率。MFC100凈化小柱在兩種基質(zhì)中的回收率為48%～115%，回收率在70%～80%之間的占比為64%，回收率低于60%的化合物是OTA，分別為48%和50%。Mycosep228凈化小柱在兩種基質(zhì)中的回收率為0～121%，除OTA的回收率為0外，其余化合物回收率均大于87%。取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液直接過各款凈化小柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MFC100、Mycosep228對(duì)OTA具有極強(qiáng)的吸附作用，吸附率分別高達(dá)99.3%和97.2%，但可能由于共提取雜質(zhì)和填料之間的相互作用，使得在OTA在MFC100中的回收率仍有50%左右。QuEChERS前處理對(duì)板栗基質(zhì)進(jìn)行考察時(shí)回收率為83%～104%，而在核桃基質(zhì)中的回收率僅為48%～104%，AFBs類化合物回收率普遍較低，為48%～70%，應(yīng)該是因?yàn)樵囼?yàn)中凈化材料對(duì)油脂性基質(zhì)適用程度不高。因此，此次研究最終選擇以Myco14為凈化小柱進(jìn)行下一步的方法學(xué)研究。

圖4 4種凈化方式在板栗基質(zhì)中回收率統(tǒng)計(jì)

圖5 4種凈化方式在核桃基質(zhì)中回收率統(tǒng)計(jì)

2.3 方法學(xué)研究

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是ESI源受離子化機(jī)制的影響，目標(biāo)物與共流出物產(chǎn)生競爭性電離，導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)增強(qiáng)或者降低的現(xiàn)象，通常以目標(biāo)物在空白基質(zhì)液中的峰面積與在純?nèi)軇┲蟹迕娣e的百分比來評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)。高于100%說明有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，低于100%則說明有基質(zhì)抑制效應(yīng)。為降低或消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，通常的手段是采用穩(wěn)定同位素稀釋法或基質(zhì)加標(biāo)曲線法進(jìn)行定量[19]。試驗(yàn)結(jié)果顯示：目標(biāo)物在板栗中的基質(zhì)效應(yīng)為81%～102%，主要為基質(zhì)抑制效應(yīng)；在核桃中基質(zhì)效應(yīng)為85%～97%，基質(zhì)效應(yīng)不明顯。考慮到堅(jiān)果基質(zhì)的多樣性，研究仍采用基質(zhì)加標(biāo)曲線法進(jìn)行定量計(jì)算。

2.3.2 方法的線性及范圍

將基質(zhì)匹配混合工作曲線溶液上機(jī)檢測，以待測化合物定量離子峰面積對(duì)其濃度進(jìn)行線性擬合，獲得各目標(biāo)物的線性方程。7種化合物在各自濃度區(qū)間范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.996，各具體數(shù)據(jù)見表2和表3。

表2 7種化合物在板栗基質(zhì)中的線性范圍、線性方程、定量限及在三個(gè)不同加標(biāo)濃度水平下的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）

表3 7種化合物在核桃基質(zhì)中的線性范圍、線性方程、定量限及在三個(gè)不同加標(biāo)濃度水平下的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）

2.3.3 檢出限、準(zhǔn)確度和精密度

試驗(yàn)采用逐級(jí)稀釋空白加標(biāo)樣品至儀器能檢出的最低含量為各化合物的檢出限，并以檢出限的3倍量為方法定量限。取板栗、核桃空白樣品，進(jìn)行了曲線最低點(diǎn)（低水平：加標(biāo)量為1.5～28 μg/kg）、曲線第二低點(diǎn)（中水平：加標(biāo)量為3.0～56 μg/kg）、曲線第三低點(diǎn)（高水平：加標(biāo)量為6～112 μg/kg）濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測定6份樣品，同時(shí)對(duì)回收率精密度進(jìn)行考察，回收率在80%～107%之間，SRSD為0.7%～4.9%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度，具體結(jié)果見表2和表3。

2.3.4 樣品檢測

采用試驗(yàn)方法對(duì)購自廣西區(qū)內(nèi)農(nóng)貿(mào)市場和超市的板栗、核桃、巴旦木、開心果、腰果、碧根果、花生共35批樣品（每種堅(jiān)果5批）進(jìn)行檢測，其中1批花生檢出了AFB1，含量為1.48 μg/kg，符合GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》[23]的要求，其余均未檢出?？梢婋m然市售堅(jiān)果中存在一定的真菌毒素污染風(fēng)險(xiǎn)，需給予持續(xù)關(guān)注，但是整體狀況還是相對(duì)安全的，可放心購買、食用。

2 結(jié)論

研究以代表性較強(qiáng)的板栗、核桃為基質(zhì)，通過考察了Myco14等三款毒素專用小柱和QuEChERS技術(shù)的提取、凈化效果，建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜測定堅(jiān)果中7種常見真菌毒素的檢測方法，經(jīng)驗(yàn)證，方法檢出限、準(zhǔn)確度、精密度等方法學(xué)指標(biāo)均能達(dá)到確證檢測和痕量分析的要求。該方法前處理所采用的擠壓通過式固相萃取小柱較傳統(tǒng)的保留、洗脫模式固相萃取小柱更為簡便、高效，凈化效果較QuEChERS技術(shù)更為徹底，儀器檢測手段靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可為市場監(jiān)管部門和堅(jiān)果生產(chǎn)經(jīng)營企業(yè)對(duì)堅(jiān)果風(fēng)險(xiǎn)的監(jiān)測和評(píng)估提供有效的技術(shù)手段。