同位素內(nèi)標(biāo)-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定牛奶中加米霉素

陳心怡，李麗蘇，劉佳娜，趙鳳娟,，吳鳳琪,

1.深圳海關(guān)食品檢驗檢疫技術(shù)中心（深圳 518045）；2.深圳市食品安全檢測技術(shù)研發(fā)重點實驗室（深圳 518045）

牛呼吸系統(tǒng)疾?。╞ovine respiratory disease，BRD）是多發(fā)于小牛上的常見疾病，每年對全球牛飼養(yǎng)業(yè)造成數(shù)十億美元損失[1]。BRD發(fā)病機制涉及多種因素，而多殺巴斯德菌、嗜睡嗜血桿菌等致病菌感染是一個重要誘因。加米霉素（Gamithromycin）是一種主要用于治療BRD的藥物[2]，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，分子式為C40H76N2O12。加米霉素屬于第二代大環(huán)內(nèi)酯類獸用抗生素[17]，吸收快、滲透率高、治療效果好[3]。加米霉素通過競爭性結(jié)合細(xì)菌核糖體50S亞基，阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)合成從而達(dá)到抑菌效果[4]。自2008年起，歐盟和美國FDA批準(zhǔn)加米霉素用于預(yù)防和治療非泌乳牛的呼吸系統(tǒng)疾病，并取得較好效果[13]。歐盟（EU No 470/2009）規(guī)定加米霉素在泌乳期禁用。

圖1 加米霉素的分子結(jié)構(gòu)式

加米霉素殘留量測定方法主要有HPLC[5-9]和HPLCMS/MS[10-14]。加米霉素的紫外吸收弱且最大吸收波長（215 nm）與流動相中甲醇（190 nm）和乙腈（205 nm）接近[13]，使得高效液相色譜法測定加米霉素的靈敏度低。而液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對測定加米霉素的結(jié)果重現(xiàn)性好且靈敏度更高，被廣泛應(yīng)用于加米霉素殘留量的測定。樣品的前處理和凈化過程會直接影響液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度和精密度。對于加米霉素的測定，前處理過程大多會采用固相萃取柱（SPE）凈化，但固相萃取柱成本高、耗時長、步驟繁瑣，容易造成損失而影響定量的準(zhǔn)確性，因此試驗采用乙腈直接提取的前處理過程以節(jié)省試驗時長。另外，在國內(nèi)外關(guān)于加米霉素殘留量測定的報道中，大部分是對食用組織比如動物可食性組織[13-15]或水產(chǎn)品[12]的殘留檢測，例如王艷艷等[13]和郭洋洋等[14]的試驗中是分別針對牛組織和豬組織中殘留量的分析，而牛奶中加米霉素殘留量測定鮮見報道，通過同位素標(biāo)記法，使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，建立牛奶中加米霉素殘留量的定量方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶樣品來自于深圳市超市?；靹蛩袠悠罚? ℃保存。

加米霉素標(biāo)準(zhǔn)品（Gamithromycin，C40H76N2O12，CAS 145435-72-9，純度95%）；加米霉素同位素內(nèi)標(biāo)（Gamithromycin-d4，純度95%）；乙腈、甲醇（均為色譜純，CNW）；0.1%甲酸-乙腈水溶液（9︰1，V/V）。

1.2 儀器與設(shè)備

5500 AB液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（SCIEX）；3-18KS高速冷凍離心機（Sigma）；EOAA-HM-01渦旋混合器（Anpel）；AB265-S天平（Mettler Toledo）；TurboVap LV氮吹濃縮儀（Biotage）；Elix+Milli-Q超純水儀（Millipore）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

加米霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液（25 μg/L）：精密稱取適量加米霉素標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度125 mg/L的加米霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于棕色玻璃瓶中，在-18 ℃以下的冰箱避光存放；精密吸取適量加米霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋成25 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-18 ℃保存。

加米霉素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（100 μg/L）：精密稱取適量同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度100 mg/L的加米霉素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于棕色玻璃瓶中，在-18 ℃以下的冰箱避光存放；精密吸取適量加米霉素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋成100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-18 ℃保存。

用上述質(zhì)量濃度25 μg/L的加米霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液和100 μg/L加米霉素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用流動相稀釋成系列質(zhì)量濃度為0.25，0.50，1.00，2.50和5.00 μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為1.0 μg/L。

1.4 樣品前處理方法

稱取5 g（精確至0.001 g）樣品于50 mL具螺旋蓋帶刻度聚丙烯離心管中，加入8 mL乙腈，渦旋混勻1 min后振蕩20 min；以9 500 r/min離心5 min；取5 mL乙腈重復(fù)提取1次，合并提取液，定容至20 mL。取4 mL上清液至15 mL具螺旋蓋聚丙烯離心管中，用氮氣濃縮儀于40 ℃吹至近干，用0.1%甲酸-乙腈水溶液定容至2 mL，過0.22 μm nylon66微孔濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.5 儀器分析條件

1.5.1 液相色譜分析條件

色譜柱Poroshell EC-C18（100 mm×2.1 mm，2.70 mm）；柱溫40 ℃；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈；流速0.25 mL/min；進樣量8.00 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序參數(shù)

1.5.2 液相色譜分析條件

離子化模式為電噴霧電離正離子模式（ESI+）；質(zhì)譜掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子化溫度550 ℃；CUR 20.00 psi；GS1 40.00 psi；GS2 40.00 psi；IS 5 500.0 V；CAD，Medium定量離子對等其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 加米霉素的主要質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

加米霉素分子結(jié)構(gòu)易接受H+而帶正電荷，因此采用正離子模式檢測。以針泵注射方式將加米霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5 mg/L）注入離子源，在ESI+模式下進行一級質(zhì)譜掃描，得到m/z777.6 [M+H]+準(zhǔn)分子離子。以m/z777.6 [M+H]+為母離子進行碰撞誘導(dǎo)解離，對其進行二級質(zhì)譜掃描，在較低碰撞能量時（＜20 eV）無法得到有效的碎片離子，而在碰撞能量較高（＞35 eV）時，加米霉素能夠產(chǎn)生多個明顯豐度較高的碎片離子，其中主要6個碎片離子分別為m/z619.3，158.2，601.3，116.1，462.2和444.2。通過加米霉素鍵位斷裂及碎片分子量比較分析，推斷發(fā)生碎裂的位置為2個醚鍵處（圖2），m/z619.3碎片離子是在a處發(fā)生斷裂而得到，而m/z158.2碎片離子是在b處發(fā)生斷裂而得到，同時m/z158.2碎片離子的烯醇結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定自發(fā)地轉(zhuǎn)化為羰基，在此結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，脫掉一個乙醛得到m/z116.2。當(dāng)a、b處同時斷裂時能得到m/z462.2。m/z619.3和m/z462.2這2個碎片離子中，羥基均會經(jīng)過脫水反應(yīng)形成雙鍵，因此分別得到m/z601.3和m/z444.2這2個碎片離子。

圖2 加米霉素的質(zhì)譜碎裂途徑

試驗進一步考察不同碰撞能量對3個主要碎片離子豐度（m/z619.3，158.2和601.3）的影響，考察的碰撞能量范圍為15～65 eV，結(jié)果如圖3所示。碰撞能量在15 eV以下，僅有碎片離子m/z619.3有較弱信號，其他2個碎片離子無法獲取信號；超過15 eV后，m/z619.3碎片離子信號強度逐步上升，在45 eV左右達(dá)到最大，而后隨碰撞能量的增大而逐步降低；對于m/z158.2和m/z601.3碎片離子，碰撞能量在25 eV以上才開始出現(xiàn)，且在25～55 eV范圍內(nèi)呈逐步上升趨勢，在55 eV時達(dá)到最強，超過55 eV后信號強度又有所下降。結(jié)果表明加米霉素分子結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，因此需要較高碰撞能量才能碎裂。由于m/z619.3碎片離子信號強度較高，穩(wěn)定性較好，試驗選用m/z619.3作為定量離子。

圖3 碰撞能量對3個主要碎片離子相應(yīng)強度的影響

2.2 色譜條件的選擇

試驗方法通過優(yōu)化流動相配比優(yōu)化加米霉素及其同位素內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)和峰形，同時優(yōu)化流動相洗脫程序使該方法能在10 min內(nèi)完成以達(dá)到快速分析樣品的目的。在Agilent Poroshell EC-C18色譜柱的基礎(chǔ)上考察流動相對加米霉素出峰的影響，結(jié)果表明作為有機相，乙腈比甲醇有更好的峰形和更高的靈敏度。另外，水相中添加適量的酸會相應(yīng)增強離子的響應(yīng)并且優(yōu)化峰型，如圖4所示，純水中添加甲酸使得加米霉素及其同位素內(nèi)標(biāo)響應(yīng)均有顯著增強，其中，不同酸度也能導(dǎo)致不同響應(yīng)，試驗考察乙腈中添加不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸水（0.1%，0.2%，0.5%和1.0%）對加米霉素及其同位素內(nèi)標(biāo)離子對的影響，結(jié)果表明0.1%甲酸比其他酸度更能顯著增強加米霉素及其同位素內(nèi)標(biāo)的離子響應(yīng)程度，因此選擇0.1%甲酸水作為水相，乙腈作為有機相。

圖4 不同水相流動相對質(zhì)譜信號強度的影響

2.3 提取條件的優(yōu)化

常用的加米霉素提取溶劑包括甲醇[11]、乙腈[10,14]、甲酸乙腈及0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液[13]，試驗比較乙腈（含0.1%甲酸和不含0.1%甲酸）及0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液的提取效果，3種提取液對加米霉素的提取效率均達(dá)70%以上，其中采用乙腈（不含0.1%甲酸）作為提取液時，加米霉素及同位素內(nèi)標(biāo)的提取回收率可達(dá)91.2%～102.5%，而含0.1%甲酸的乙腈在牛奶中的提取回收率則在82.4%～101.3%，略低于乙腈。除此之外，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液則最低（71.9%～88.6%），這與Yan等[10]的試驗結(jié)果相同。因此，由于乙腈的低干擾性、較高回收率和靈敏度并且能提高前處理效率，試驗選擇乙腈作為提取溶劑。

2.4 過濾方法的優(yōu)化

試驗在氮吹后用含0.1%甲酸水-乙腈（9︰1，V/V）溶劑復(fù)溶，避免測定時的溶劑效應(yīng)影響加米霉素在色譜上的保留和峰形。

考慮到不同濾膜對化合物的過膜損失有顯著差異，試驗比較2種不同微孔濾膜對加米霉素的吸附能力的影響，分別是常用的Nylon 66微孔濾膜及PTFE微孔濾膜，2種均為0.22 μm孔徑的水系濾膜。通過試驗發(fā)現(xiàn)，使用Nylon 66的微孔濾膜平均回收率為96.7%，而使用PTFE微孔濾膜時平均回收率只有58.4%。由此可知，2種微孔濾膜都有一定吸附作用，但Nylon 66的吸附作用明顯小于PTFE的吸附效果。因此，試驗選擇Nylon 66微孔濾膜（0.22 μm）作為濾膜。

2.5 線性范圍、檢出限與定量限

試驗對比流動相配制的溶劑曲線和空白牛奶基質(zhì)液配制的基質(zhì)曲線，以其定量離子的響應(yīng)豐度作為y，以定量離子的質(zhì)量濃度作為x（μg/L），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，在質(zhì)量濃度范圍0.25～5.00 μg/L內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖5），其中溶劑線性回歸方程是y=62 405x-1 951，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，表明加米霉素線性關(guān)系良好。由于牛奶中加米霉素為禁用物質(zhì)，該方法的檢出限（limit of detection，SLOQ）為0.5 μg/kg，能滿足信噪比rSN≥10的要求。

圖5 加米霉素的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

由圖6可知，加米霉素在牛奶中的基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）結(jié)果顯示：幾乎沒有基質(zhì)效應(yīng)（|ME|為0.57%）。因此定量分析試驗中采用溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖6 牛奶中添加0.50 μg/kg加米霉素及其同位素內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有特異性和選擇性，其共洗脫基質(zhì)成分可能會影響電離效率。在試驗方法中，通過同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)來降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。同位素內(nèi)標(biāo)法的應(yīng)用是為校準(zhǔn)在液相色譜質(zhì)譜中經(jīng)過樣品前處理的樣品的差異性，因此選用加米霉素-d4作為同位素內(nèi)標(biāo)。加米霉素-d4與加米霉素具有相同的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)特性，該內(nèi)標(biāo)較好補償了樣品制備過程中分析化合物的損失。

同時為進一步使牛奶中加米霉素化合物的基質(zhì)效應(yīng)的影響降到最低，試驗適當(dāng)增加稀釋倍數(shù)以達(dá)到降低一定基質(zhì)效應(yīng)的目的。對比不同前處理導(dǎo)致的不同稀釋倍數(shù)（0.5，1和2倍）的試驗結(jié)果影響，試驗結(jié)果表明在稀釋0.5倍和1倍的情況下，加米霉素的回收率在65%～70%之間，而稀釋2倍可達(dá)90.2%～106%，因此通過稀釋較高倍數(shù)能有效達(dá)到降低一定基質(zhì)效應(yīng)的作用，使得回收率有所提高。

2.7 方法回收率和精密度

在牛奶中分別加入加米霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液和加米霉素同位素內(nèi)標(biāo)進行加標(biāo)回收率試驗。加米霉素及其同位素內(nèi)標(biāo)的SLOQ濃度水平的空白加標(biāo)樣的質(zhì)量色譜圖見圖6。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白牛奶中分別添加SLOQ，2倍SLOQ和10倍SLOQ這3個濃度的加米霉素藥物進行回收率試驗，每個濃度水平進行6個平行樣品試驗，重復(fù)3次，求批內(nèi)和批間的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，計算結(jié)果見表3。從試驗結(jié)果可以看出牛奶中加米霉素藥物在0.5～5.0 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)的平均回收率為90.5%～107%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，SRSD）分別為1.32%～4.36%。

表3 加米霉素添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.8 實際樣品檢測

試驗對15份市售牛奶樣品進行測試，包括蒙牛、蒙牛特侖蘇、伊利、伊利金典等國產(chǎn)品牌，以及安佳、紐麥福、好沃德、佳德選、沃美滋等國外品牌。測定結(jié)果均為未檢出（≤LOD）。

3 結(jié)論與討論

試驗建立牛奶中加米霉素殘留量的同位素內(nèi)標(biāo)-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜快速測定法。采用乙腈直接提取，經(jīng)氮吹后用流動相復(fù)溶，過尼龍濾膜后用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。樣品前處理步驟快速、操作簡易，結(jié)果的準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性好，采用試劑配制曲線結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)法定量，能最大程度避免基質(zhì)干擾，增加檢測結(jié)果準(zhǔn)確度。批間和批內(nèi)平均回收率達(dá)90%以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，能滿足實驗室對牛奶中加米霉素殘留量快速檢測的要求。