固相萃取-離子色譜法測定酵素中7種無機(jī)陰離子

鄧湘波，歐陽吉德，曹滂，賀偉

郴州市食品藥品檢驗檢測中心（郴州 423000）

食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分可供食用的酵素產(chǎn)品[1]。食用植物酵素因含有糖類、酶類及有機(jī)酸類等對人體有益的特定生物活性成分，被越來越多的群眾所接受。但自制酵素由于原材料及環(huán)境等因素影響，質(zhì)量參差不齊。食用植物酵素中的氟化物、氯化物、亞硝酸鹽、溴化物、硝酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等陰離子多寡在酵素液中嚴(yán)重影響酵素的質(zhì)量安全，其含量是判斷酵素質(zhì)量合格與否的重要指標(biāo)，全方位分析酵素中陰離子含量，對指導(dǎo)酵素的安全使用，具有重要意義。

文獻(xiàn)報道常用測定陰離子的方法主要有離子選擇電極法、分光光度法和離子色譜法[2-4]，然而常規(guī)的方法普遍存在前處理過程繁瑣、結(jié)果干擾因素雜、靈敏度不高、結(jié)果重現(xiàn)性差等問題，離子色譜法較好地克服上述缺點(diǎn)。同時，固相萃取法前處理具有快速高效等優(yōu)點(diǎn)。固相萃取與離子色譜相結(jié)合，良好地克服了干擾因素，易于操作重現(xiàn)，已在食品[5-6]、飲用水[7-8]、環(huán)境[9]、煙草[10]、藥品[11]等多個領(lǐng)域得到應(yīng)用。但離子色譜法用于陰離子的測定大多集中在飲用水[11-12]，該方法在食用植物酵素中的無機(jī)陰離子的研究則鮮于報道。

試驗采用固相萃取-離子色譜法聯(lián)用技術(shù)，對食用植物酵素中的7種無機(jī)陰離子進(jìn)行分析測定。以Dionex ICS-AS19為分析柱，以氫氧化鉀為淋洗液，在線梯度淋洗，建立一種可同時測定食用植物酵素中7種無機(jī)陰離子的固相萃取-離子色譜聯(lián)用法。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

1.1.1 樣品來源

10批次植物酵素樣品，分別來源于家庭個人自制及網(wǎng)絡(luò)采購酵素液。樣品1～2為家庭個人自制果蔬皮發(fā)酵所得混合酵素液，樣品3～4為家庭個人自制混合水果發(fā)酵所得混合酵素液，樣品5為家庭個人自制楊梅發(fā)酵所得楊梅酵素液，樣品6～7為家庭自制水果及蔬菜混合發(fā)酵所得酵素液，樣品8為網(wǎng)絡(luò)采購自制芒果發(fā)酵酵素液，樣品9為網(wǎng)絡(luò)采購自制檸檬發(fā)酵酵素液，樣品10為網(wǎng)絡(luò)采購自制楊梅發(fā)酵酵素液。

1.1.2 試驗試劑

7種陰離子混標(biāo)（100 mg/L）、氟離子（1 000 mg/L）、氯離子（1 000 mg/L）、亞硝酸根離子（1 000 mg/L）、溴離子（1 000 mg/L）、硝酸根離子（1 000 mg/L）、磷酸根離子（1 000 mg/L）、硫酸根離子（1 000 mg/L）等8種標(biāo)準(zhǔn)儲備液：北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；氫氧化鉀淋洗液（分析純，thermofisher）。

1.1.3 儀器與設(shè)備

ICS-1100離子色譜儀（美國Dionex公司）；RFC-30淋洗液自動發(fā)生器（美國Dionex公司）；AS-DV自動進(jìn)樣器（美國Dionex公司）；ASRS300陰離子抑制器（美國Dionex公司）；變色龍色譜工作站，SMART 2 PURE智能一體化超純水系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific）；ML204型電子天平（梅特勒-多利多）；VISIPREP DL固相萃取裝置（SUPELCO）；SPE-C18固相萃取小柱（Agela Technologies）；LC-WCX弱陽離子固相萃取柱（上海安譜實(shí)驗科技股份有限公司）；200 μL微量移液器、1 000 μL微量移液器（德國Eppendorf）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理[14-15]

將食用植物酵素原液混勻，取適量酵素樣品轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，于5 000 r/min離心5 min，去除肉眼可見雜質(zhì)。取5 mL離心后上清液，并將其用超純水稀釋至100 mL容量瓶中，待凈化。按照從上到下的順序，將10 mL注射器、C18柱和LC-WCX弱陽離子交換柱安裝在固相萃取儀上，依次用10 mL甲醇和10 mL水活化平衡固相萃取小柱。取待凈化酵素液10 mL至上端注射器中，依次通過C18柱及LC-WCX弱陽離子交換柱凈化，抽干并收集流出液，流出液過0.22 μm濾膜，待上機(jī)測定。

1.2.2 陰離子淋洗液的配制

由EGC Ⅲ KOH RFIC氫氧化鉀淋洗液自動電解發(fā)生器在線生成，淋洗液按表1梯度淋洗程序淋洗。

表1 梯度淋洗程序

1.2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的配制

精密移取5 mL 7種陰離子混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，包括氟離子（100 mg/L）、氯離子（100 mg/L）、亞硝酸根離子（100 mg/L）、溴離子（100 mg/L）、硝酸根離子（100 mg/L）、磷酸根離子（100 mg/L）、硫酸根離子（100 mg/L），用超純水定容至50 mL容量瓶中，配制成最終質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4 ℃冷藏保存。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

精密移取適量7種陰離子混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用超純水定容至25 mL容量瓶中，混勻，配制成7種陰離子質(zhì)量濃度均為0.2，0.5，1.0，2.0，5.0和10.0 mg/L的6個不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。取上述標(biāo)準(zhǔn)工作系列溶液注入離子色譜儀進(jìn)樣系統(tǒng)，記錄峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 色譜條件

以KOH溶液為梯度淋洗液，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，預(yù)處理后樣品溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，自動進(jìn)樣器直接進(jìn)樣，進(jìn)樣量25 μL。經(jīng)ASRS300陰離子抑制器后，通過IonPac AG19保護(hù)柱（4 mm×50 mm）及IonPac AS19分析柱（4 mm×250 mm）進(jìn)行分離，電導(dǎo)檢測器記錄信號，單標(biāo)保留時間定性，峰面積定量。

1.2.6 方法學(xué)驗證方法

以各陰離子的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算各陰離子質(zhì)量濃度。連續(xù)檢測12次空白樣品，計算信噪比（rSN）大于3︰1的濃度為檢出限[14]。取5 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，計算保留時間和峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。將標(biāo)準(zhǔn)溶液加入酵素樣品溶液中，配制成1，2和5 mg/L高、中、低3個質(zhì)量濃度，每個濃度測定6次，測得加標(biāo)試樣中各陰離子濃度，扣除相應(yīng)樣品空白，計算樣品加標(biāo)回收率。

1.2.7 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計

使用變色龍色譜工作軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并對試驗結(jié)果的平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗證

7種陰離子的線性質(zhì)量濃度范圍和線性方程見表2，方法學(xué)驗證結(jié)果見表3。

表2 各陰離子的線性質(zhì)量濃度范圍和線性方程

表3 方法學(xué)驗證結(jié)果

2.2 樣品檢測結(jié)果

運(yùn)用固相萃取與離子色譜法聯(lián)用技術(shù)，對F-，Cl-，NO2-，Br-，NO3-，SO42-和PO43-7種陰離子進(jìn)行定量檢測分析，色譜圖結(jié)果顯示（圖1），各陰離子色譜峰得到有效分離，峰形良好，分離度均大于3.2。經(jīng)方法學(xué)驗證，各離子的檢出限分別為0.015，0.020，0.043，0.056，0.025，0.037和0.053 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 1，在1，2和5 mg/L高中低3個梯度下各無機(jī)陰離子加標(biāo)回收率分別在90.3%～96.8%，94.6%～96.9%和97.8%～105.7%之間，各陰離子精密度（n=6，SRSD）分別在2.1%～5.1%，0.7%～3.0%和1.1%～3.2%之間，整體小于5.1%。說明該固相萃取與離子色譜法聯(lián)用法可適用于食用酵素中陰離子濃度的定量檢測分析。

圖1 7種陰離子色譜圖

應(yīng)用該方法，按“1.2.1”項下方法制備供試品溶液，同時測定10批次自制植物酵素液中F-，Cl-，NO2-，Br-，NO3-，SO42-和PO43-7種無機(jī)陰離子的含量。從檢驗結(jié)果上看（表4），10批次自制植物酵素中的均檢出硫酸根離子，且硫酸根離子濃度很高，其中3批次個人自制酵素硫酸鹽含量均超過GB 5749—2022《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的250 mg/L的限值要求，存在較大的安全隱患。9批次檢出磷酸根離子，8批次檢出氯離子，其中2批次采購于網(wǎng)絡(luò)的自制酵素中氯化物明顯高于其他品種，需持續(xù)關(guān)注監(jiān)測。氟化物、亞硝酸根、硝酸根3種物質(zhì)雖有檢出，但檢測結(jié)果較低，安全風(fēng)險相對較小。10批次自制酵素中均未檢出溴離子。

表4 樣品檢測結(jié)果 單位：mg/L

3 討論與結(jié)論

氟化物濃度過高，會對人體骨骼、組織器官和動植物的生長都有極大危害，導(dǎo)致人體氟骨癥[16-17]。氯離子可與有機(jī)物化合生成致癌物，溴化物可與消毒劑反應(yīng)生成含溴消毒副產(chǎn)物等危害人體健康的物質(zhì)[18]；硝酸鹽、亞硝酸鹽的含量高，會干擾肌體對維生素A的利用，導(dǎo)致維生素A缺乏癥[19-20]。硫酸根離子直接受硫酸鈣溶解度的影響，既影響食用口感也對人體健康產(chǎn)生潛在影響[21]。磷酸根離子也會不同程度的人體和環(huán)境造成危害。

方法利用洗脫液生成功能，防止基線漂移，提高靈敏度，改善分離度并確保一致的峰積分。洗脫液生成消除傳統(tǒng)的IC洗脫液制備方法中對于酸和堿的處理需求，并且允許色譜分析工作人員運(yùn)行全范圍的梯度和等度分離，且效率比手工制備洗脫液更高[22-24]。對含干擾物質(zhì)的復(fù)雜水質(zhì)樣品，須用相應(yīng)的H型或Na性強(qiáng)酸性陽離子預(yù)處理柱進(jìn)行有效去除后再進(jìn)樣。

綜上所述，離子色譜法檢測食用植物酵素中的7種陰離子方法穩(wěn)定可靠，但自制酵素離子成分參差不齊。國家尚無酵素相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)出臺，消費(fèi)者沒有對酵素中的各種陰離子的濃度進(jìn)行限值，中國發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會雖出臺食用植物酵素的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，但也未對各種離子進(jìn)行限值規(guī)定，建議盡早對酵素中陰離子限值做出相關(guān)規(guī)定。以消除酵素陰離子對消費(fèi)者造成的安全隱患，同時也進(jìn)一步促進(jìn)規(guī)范酵素行業(yè)的健康發(fā)展。