UPLC-MS/MS測定牛奶中三氮脒和氮氨菲啶殘留

湯晨

上海德諾產(chǎn)品檢測有限公司（上海 200436）

三氮脒[diminazene aceturate，DIM；又名貝尼爾（Berenil?）]和氮氨菲啶[isometamidium chiorde，ISM；又名沙漠林（Samorin?）]，是國內(nèi)外治療錐蟲病感染的應(yīng)用最多的藥物之一[1-2]。錐蟲病嚴(yán)重影響動物的身體狀況和生產(chǎn)性能，從而給畜牧業(yè)造成巨大損失[3-4]。三氮脒只可用于治療錐蟲病，氮氨菲啶卻可以治療和預(yù)防錐蟲病[5-6]。然而藥物的不正當(dāng)使用造成藥物殘留，特別是牛奶中的藥物殘留，它與治療劑量有直接關(guān)，更容易出現(xiàn)藥物殘留現(xiàn)象，危害食用者的身體健康[7]。我國在GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定牛奶三氮脒的最大殘留限量值為150 μg/kg，氮氨菲啶的最大殘留限量值為100 μg/kg[8]。但我國對于牛奶中三氮脒和氮氨菲啶的檢測方法并不完善，因此有必要對牛奶中的三氮脒和氮氨菲啶殘留量的檢測進行研究。

已報道研究方向主要用高效液相色譜法（HPLC）檢測三氮脒，并無使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）檢測的研究報道，而同時檢測三氮脒和氮氨菲啶的研究也僅有高效液相色譜法（HPLC）。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的靈敏度高，選擇性好，是一種集高效分離和多組分定性、定量與一體的方法，關(guān)于牛奶中的三氮脒與氮氨菲啶的檢測，尚無高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測三氮脒和氮氨菲啶的國家標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)報道。

周雨卉等[9]采用不同提取液，用高效液相色譜法同時測定牛組織中的三氮脒和氯化氮氨菲啶，GB/T 22974—2008[10]用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法僅檢測牛奶中的氮氨菲啶，此次試驗從三氮脒和氮氨菲啶的理化性質(zhì)出發(fā)，在前人研究[9-10]的基礎(chǔ)上，建立用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測牛奶中三氮脒和氮氧菲啶的方法。通過簡單的樣品前處理，使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行分析，為牛奶中三氮脒和氮氨菲啶殘留的分析提供一種新檢測途徑，也為我國加強獸藥監(jiān)控、提高牛奶質(zhì)量提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇（色譜純）；乙酸、正己烷（分析純）；超純水（H2O，電阻率18.2 MΩ·cm）；鹽酸氮氨菲啶（質(zhì)量濃度100 mg/L，上海安譜實驗科技股份有限公司）；三氮脒（純度99%，上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

6470B液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源及MassHunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）、1290II液相色譜儀（美國Agilent公司）；230V渦旋混勻器（美國Talboys公司）；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA集團）；ST16R高速冷凍離心機（德國Thermo公司）；AB-135S電子天平（梅特勒托利多集團）；2300TH超聲波清洗器（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：取1 mL氮氨菲啶標(biāo)準(zhǔn)溶液至于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；稱取10 mg三氮脒標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用超純水定容，配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18 ℃避光存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取適量體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用15%（V/V）乙腈水溶液稀釋成所需的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用現(xiàn)配。

提取液：乙腈[含0.2%（V/V）的50%（V/V）乙酸水溶液]，乙腈中加入200 μL乙酸-水（1+1，V/V）溶液，混勻。

1.3.2 樣品的制備和提取

準(zhǔn)確稱取5 g（精確到0.01 g）牛奶試樣于50 mL離心管中，加入20 mL提取液乙腈（含0.2%的50%乙酸溶液），蓋上蓋混勻，均質(zhì)2 min，按6 000 r/min離心10 min，將上層溶液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，殘渣用20 mL提取液超聲提取10 min，按6 000 r/min離心5 min，合并2次提取液于雞心瓶中，待凈化。

1.3.3 凈化

將雞心瓶中的提取液于40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加1 mL 15%（V/V）乙腈水溶液復(fù)溶，充分旋渦溶解殘余物，加1 mL正己烷振蕩混合1 min，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，按6 000 r/min離心5 min，棄上層正己烷液。加1 mL正己烷，重復(fù)提取1次。取下層清液，過0.22 μm濾膜后，上機檢測。

1.4 色譜條件

色譜柱C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動性A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；流速0.4 mL/min，柱溫30 ℃；進樣量2 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相及其梯度條件

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源溫度350 ℃；鞘氣流速11 L/min；電噴霧電壓4.0 kV；噴霧氣55.0 psi。三氮脒及氮氨菲啶的母離子、子離子、保留時間等見表2，總離子流圖見圖1。

圖1 三氮脒及氮氨菲啶的總離子流圖

表2 三氮脒及氮氨菲啶的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理的優(yōu)化

2.1.1 提取液的優(yōu)化

以牛奶為基質(zhì)，考察乙腈、乙腈[含0.2%（V/V）的50%（V/V）乙酸水溶液]、乙腈[含0.4%（V/V）的50%（V/V）乙酸水溶液]這3種溶液作為提取液的提取效果。準(zhǔn)確稱取5.00 g牛奶樣品，加入250 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同條件下，經(jīng)3種提取液提取后，檢測查看提取效果，測得的目標(biāo)物回收率見圖2。結(jié)果顯示，由于牛奶中蛋白質(zhì)含量高，乙腈可以有效地沉淀蛋白質(zhì)，牛奶又呈弱堿性，而三氮脒和氮氨菲啶為偏堿性藥物，在堿性環(huán)境下不容易被提取出來，加入乙酸可以降低提取液pH，提高對目標(biāo)物的提取效果。因此，乙腈（含0.2%的50%乙酸溶液）作為提取液時，目標(biāo)物的回收率最好。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)的50%乙酸水溶液對三氮脒和氮氨菲啶回收率的影響

2.2 定量檢測

2.2.1 檢出限、定量限、線性范圍

用牛奶的空白基質(zhì)將三氮脒和氮氨菲啶配制成50～1 000 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別對三氮脒和氮氨菲啶進行分析，以添加藥物的質(zhì)量濃度（X，ng/mL）對應(yīng)以相應(yīng)色譜峰面積（Y），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，三氮脒和氮氨菲啶的線性范圍良好，各項相關(guān)系數(shù)（r）＞0.999，在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 g空白樣品中（即5 μg/kg的添加水平），使用優(yōu)化后的樣品經(jīng)前處理方法后，上機檢測，測得三氮脒和氮氨菲啶的信噪比rSN均≥3，即檢出限為5 μg/kg，以2倍檢出限定為定量限，即定量限為10 μg/kg。結(jié)果見表3。

表3 線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.2.3 方法回收及精密度

準(zhǔn)確稱取多份5 g空白樣品，進行加標(biāo)回收試樣。加入三氮脒、氮氨菲啶混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進行SLOQ，2SLOQ和10SLOQ的加標(biāo)回收試驗，每個添加量重復(fù)6次，經(jīng)前處理及儀器測定，得加標(biāo)回收額定值。表4顯示，加標(biāo)回收率在80.8%～95.3%之間，SRSD結(jié)果范圍為2.0%～4.2%（n=6），符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》的要求，表明試驗方法的準(zhǔn)確性較高，可用于牛奶中樣品中三氮脒和氮氨菲啶的同時測定。

表4 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

3 結(jié)論

試驗建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測牛奶中三氮脒和氮氨菲啶酸方法的回收率、靈敏度和重復(fù)性均符合殘留分析的要求。該方法前處理操作簡便，試劑消耗少，適合于牛奶中三氮脒和氮氨菲啶的殘留檢測。試驗為牛奶中三氮脒和氮氨菲啶殘留的分析提供一種新檢測途徑，也為我國加強獸藥監(jiān)控、提高牛奶質(zhì)量提供支持。