綠茶提取物對(duì)炸羊肉丸中雜環(huán)胺形成的抑制作用

楊爍，李佳珊，尚宏麗

錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院（錦州 121001）

綠茶是茶的主要類型之一。綠茶含有豐富的生物活性化合物，特別是具有抗氧化性的酚類化合物，具有很好的抗衰老和抗癌作用，對(duì)預(yù)防糖尿病、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病很有效[1]，綠茶中存在30余種具有酚基物質(zhì)的酚類，其中最重要的成分是兒茶素類物質(zhì)，占綠茶酚類物質(zhì)總量的60%～80%。有研究還鑒定出其他幾種濃度較低的酚類化合物，如酚酸[2-3]。在日常生活中人們非常喜愛喝茶促進(jìn)健康，因?yàn)椴栌锌寡趸?、抗癌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和降糖等功效[4-5]，科學(xué)研究表明綠茶對(duì)人體健康具有益處，并可以降低患嚴(yán)重疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如有助于控制體重，防止紫外線輻射，預(yù)防癌癥，有利于口腔、骨骼健康和其他生理作用[6]。綠茶的有益效果與多酚化合物有關(guān)，這引起食品工業(yè)研究人員的極大興趣[7]。

羊肉營養(yǎng)豐富，受到人們的喜愛，尤其是受少數(shù)民族歡迎，羊肉的主要加工方式為烘烤、蒸煮、油炸等，但高溫會(huì)導(dǎo)致大量具有致癌致突變的有害物質(zhì)產(chǎn)生，在肉制品熱處理過程中，會(huì)產(chǎn)生HAs類化合物這類有害物質(zhì)，在不同的魚、肉、禽類制品中已發(fā)現(xiàn)HAs近30種[8]，這類化合物被認(rèn)為能夠增加人體患多種癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重危害消費(fèi)者的健康。一些調(diào)查顯示使用不同的烹飪方法和食品添加劑，包括天然抗氧化劑，如酚類化合物，可減少熟肉中HAs的形成。有報(bào)道稱，牛至、百里香和橄欖、蘋果、葡萄籽和石榴籽提取物、香料，如黑胡椒、肉桂和丁香、檸檬草、姜、姜黃和紅辣椒等[9]，以及脂溶性和水溶性維生素是肉類中HAs的抑制劑[10]。茶多酚是指從茶葉中提取的天然多酚的總稱，具有除臭、除味和抗氧化的特性，被廣泛用作肉類和加工肉制品的抗氧化防腐劑。研究證明，在肉類加工前添加綠茶提取物（GTE）是抑制雜環(huán)胺類物質(zhì)的有效辦法，但國內(nèi)外對(duì)于酚類化合物的研究較多集中在對(duì)雜環(huán)胺的形成機(jī)制與影響因素上，因此，有必要深入研究酚類化合物對(duì)羊肉中雜環(huán)胺的影響。試驗(yàn)測定不同GTE添加量的炸羊肉丸中HAs和其前體物含量，探討其對(duì)HAs形成的影響。有關(guān)GTE對(duì)日常羊肉丸油炸過程中食品品質(zhì)和雜環(huán)胺生成量的影響鮮有報(bào)道。試驗(yàn)可為日常油炸羊肉丸的加工及食用安全性提供理論依據(jù)，以減輕雜環(huán)胺對(duì)人體的危害。

1 材料與方法

1.1 材料

羊肉（購自遼寧省錦州市大潤發(fā)超市）。

1.2 試劑與儀器

6種HAs標(biāo)準(zhǔn)品：2-氨基-3甲基咪唑[4,5-f]喹啉（IQ）、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-b]吡啶（PhIP），9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（Norharman）、2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉（MeIQx）、2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉（4,8-DiMeIQx）、1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（Harman），均購自加拿大Toronto Ressearch Chemicals公司。

三氯乙酸（山東旭光化工有限公司）；無水乙醚（上海力明工貿(mào)有限公司）；丁二酸（安徽三信化工有限公司）；1-萘酚（常州市常宇化工有限公司）；磺基水楊酸（廣東匯聯(lián)達(dá)化工有限公司）；正已烷（青島正業(yè)試劑儀器有限公司）；甲醇（山東德齊龍化工集團(tuán)有限公司）；無水乙醇、二氯甲烷（上海鴻鶴實(shí)業(yè)有限公司）；乙腈（天津一方科技有限公司）；已酸胺（樂泰化工有限公司）；肌酸（北京索萊寶科技有限公司）；葡萄糖（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；葡萄糖GAGO20-1KT試劑盒（Sigma-Aldrich）公司。

ME04E電子天平（上海赫爾普國際貿(mào)易有限公司）；DS-200色差儀（天津市順諾儀器科技有限公司）；FE20K精密pH計(jì)（瑞士METLER TOLEDO公司）；XD-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；835-50氨基酸自動(dòng)分析儀（日本日立公司）；6470 UHPLC-MS/MS（美國Agilent公司）；CWH750紅外激光測溫儀（濟(jì)寧市華煤工礦機(jī)械設(shè)備有限公司）；DVB-PDMS固相萃取裝置（SUPELCO公司）；FSH-2A均質(zhì)機(jī)（江蘇東鵬儀器制造有限公司）；GL21M高速冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；FSH-2A高速勻漿機(jī)（江蘇東鵬儀器制造有限公司）；Poly-Sery PSD固相萃取小柱（上海玉博生物科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 炸羊肉丸的制作

羊肉經(jīng)過清洗和修剪，去除可見的脂肪和肌腱組織。根據(jù)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，將0.05%，0.10%，0.30%和0.50%（m/m）的GTE加入肉糜中，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以不添加GTE作為對(duì)照。將平衡后的肉糜稱取30 g，搓成肉丸，在150 ℃下油炸。在油炸過程中沒有添加胡椒、鹽或其他調(diào)味品。油炸后，羊肉丸被冷卻到室溫，用于測量烹調(diào)損失、色差和pH，而用于測量HAs的油炸羊肉丸被冷凍干燥處理、真空包裝，并與用于測量前體含量的其余樣品一起儲(chǔ)存在-20 ℃。

1.3.2 炸羊肉丸蒸煮損失、pH和顏色測定

羊肉丸的失水量是根據(jù)未煮熟和煮熟的樣品中的質(zhì)量差值測量。pH測量使用精密pH計(jì)，在室溫下用pH 4.0和7.0的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校準(zhǔn)。將肉樣隨機(jī)取3個(gè)點(diǎn)，使用校正后的色差計(jì)測量L*、a*和b* ，取平均值。

1.3.3 炸羊肉丸肌酸含量的測定

肌酸的測定參照Polak等[11]的方法并稍作修改。將0.2 g左右粉碎的羊肉丸樣品放入燒杯中，加入100 mL的30 g/L三氯乙酸，將上清液均質(zhì)（8 000 r/min）5 min，通過濾紙過濾以除去蛋白質(zhì)沉淀。取20 mL濾液置于50 mL離心管中，加入10 mL乙醚，進(jìn)行脫脂處理，振蕩均勻后靜置10 min，取4 mL脫脂層即底層，加入2 mL丁二酮和2 mL 1-萘酚。將混合物在40 ℃下超聲提取5 min，在520 nm波長處用酶標(biāo)儀測定各個(gè)樣品的吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品的肌酸含量，單位為mg/g。

1.3.4 炸羊肉丸葡萄糖的測定

稱取2.0 g樣品于離心管中，加入20 mL超純水，按12 000 r/min勻漿30 min，按10 000 r/min離心10 min，取上清液。使用GAGO20-1KT試劑盒進(jìn)行測定葡萄糖含量。

1.3.5 炸羊肉丸游離氨基酸的測定

游離氨基酸的含量測定方法參照Hou等[12]方法。樣品經(jīng)前處理后，取4 mL上清液并加入2 mL正己烷，振蕩后取2 mL水相，過0.22 μm濾膜后待檢測使用。

1.3.6 HAs的提取及測定

HAs的提取參照魏晉梅等[13]方法并稍作修改。將2 g羊肉丸樣品加入到50 mL離心管中，加10 mL 4 g/L NaOH-甲醇溶液，均質(zhì)1 min后以10 000 r/min離心10 min，保留上清液，重復(fù)合并每次的上清液。固相萃取小柱（Poly-Sery PSD，3 mL，500 mg）依次用2 mL甲醇和3 mL 4 g/L NaOH溶液活化。將2.5 mL提取液加入固相萃取小柱中棄去。用3 mL 4 g/L NaOH-甲醇溶液淋洗，用2 mL正已烷淋洗，用1.5 mL乙醇-二氯甲烷溶液（9︰1，V/V）洗脫。洗脫液于35 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入1 mL甲醇渦旋復(fù)溶，用0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾，待UPLC-MS/MS測定。

色譜條件：UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈、流動(dòng)相B為乙酸-乙酸銨水溶液；流速0.3 mL/min；單次進(jìn)樣體積5.0 μL；柱溫40 ℃。流動(dòng)相梯度見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI+）；正離子模式；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM模式）；干燥氣溫度325 ℃；干燥氣流速10 L/min；噴霧器壓力35 Psi；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速11 L/min；毛細(xì)管電壓3 kV；噴嘴電壓400 V。

HAs抑制率按式（1）計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的方式表示。使用軟件SPSS 2.0和Origin 2021對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，并且作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GTE對(duì)炸羊肉丸蒸煮損失、pH、色差的影響

GTE對(duì)羊肉丸蒸煮損失的影響如表2所示。油炸過程中羊肉丸損失率（水和脂肪）在44.52%～55.61%，GTE的添加顯著降低羊肉丸的失重率（P＜0.05），在一定程度上增加羊肉丸的保水能力，且在0.5%添加量時(shí)保水效果最好，在0.1%和0.3%處理組差異不顯著（P＞0.05），這說明綠茶提取物降低了羊肉丸的失重率，可能是由于抗氧化劑起到保護(hù)蛋白不變性的作用[14]。

由表2可知，與對(duì)照組相比，GTE處理組的pH都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的降低（P＜0.05），隨著GTE濃度的增加，炸羊肉丸的pH不斷降低，且在0.5% GTE處理組的pH達(dá)到最低pH 5.79，可能是天然抗氧化劑GTE中存在酚酸復(fù)合物，降低了羊肉丸中的pH[15]。

顏色在肉的品質(zhì)中起著重要作用。由表2可知，相比于對(duì)照組，炸羊肉丸的L*、a*和b*值均呈現(xiàn)顯著降低的趨勢（P＜0.05），綠茶提取物濃度增加時(shí)，L*值下降，綠茶提取物自身顏色會(huì)影響肉的亮度，使得肉的顏色變暗。綠茶提取物處理組的a*和b*值顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），添加0.3%茶多酚樣品的a*值最低，這說明GTE具有一定抗氧化活性，可能影響炸羊肉丸的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化，進(jìn)而影響羊肉丸的顏色。

2.2 GTE對(duì)炸羊肉丸肌酸和葡萄糖的影響

由圖1可知，生羊肉丸中肌酸含量為10.85±0.27 mg/g，可能是由于油炸過程中肌酸轉(zhuǎn)化為肌酐，經(jīng)過油炸處理后的羊肉丸中肌酸含量顯著下降（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，GTE添加量0～0.1%時(shí)，炸羊肉丸的肌酸含量先呈下降趨勢。添加大于0.1%后，肌酸含量先上升并趨于穩(wěn)定。

圖1 GTE對(duì)炸羊肉丸中肌酸和葡萄糖的影響

葡萄糖是生羊肉中含量最高的碳水化合物，有研究報(bào)道指出加熱處理后肉制品的葡萄糖含量比生肉顯著降低[16-17]，加熱前后葡萄糖含量的降低可能是由于葡萄糖與氨基酸的美拉德反應(yīng)及加熱過程中葡萄糖的降解所致[18]。試驗(yàn)生羊肉葡萄糖含量為2.99±0.16 mg/g，經(jīng)油炸后的處理組都顯著降低（P＜0.05），GTE的添加一定程度上減緩葡萄糖的減少，GTE處理組葡萄糖含量高于對(duì)照組，但各GTE處理組之間差異不顯著。

2.3 GTE對(duì)炸羊肉丸游離氨基酸的影響

如表3所示，所有經(jīng)熱處理后的羊肉丸中的游離氨基酸含量均顯著比生羊肉丸低（P＜0.05），研究表明，生肉經(jīng)過加熱處理后，其油炸過的羊肉丸中游離氨基酸含量均體現(xiàn)出顯著降低[19]?？赡苁桥c游離氨基酸的降解或者與葡萄糖反應(yīng)有關(guān)。GTE的添加能在一定程度上延緩炸羊肉丸中游離氨基酸的損失，尤其是抑制Thr、Gly、Val、Met、Leu、Tyr 6種游離氨基酸的消耗作用更為顯著，其中Gly被證明是MeIQx的前體氨基酸[20]，Gly含量的增加說明添加GTE可能阻礙Gly前體物向雜環(huán)胺的轉(zhuǎn)化。因此對(duì)MeIQx有一定抑制作用。除Ile對(duì)照組高于綠茶提取物處理組，其他綠茶提取物處理組均一定程度增加游離氨基酸的含量，由此可見，GTE對(duì)油炸過程中氨基酸的消耗起到一定減緩作用。此外，研究證實(shí)，酚類可與不同氨基酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[21]。綜上所述，推測GTE與氨基酸的競爭性化學(xué)反應(yīng)會(huì)阻止氨基酸參與雜環(huán)胺的形成過程，從而產(chǎn)生明顯抑制作用。

表3 GTE對(duì)炸羊肉丸中游離氨基酸的影響 單位：mg/100 g

2.4 綠茶提取物對(duì)炸羊肉丸中雜環(huán)胺的影響

圖2為6種雜環(huán)胺混合標(biāo)準(zhǔn)品UPLC-ESI-MS離子譜圖。在油炸羊肉丸中共檢測出6種HAs（PhIP、IQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx、Norharman、Harman）。由表4可知，油炸羊肉丸中總HAs含量在8.93～10.76 ng/g，單一雜環(huán)胺的HAs含量在0.28～5.95 ng/g，4個(gè)濃度水平的綠茶提取物均降低炸羊肉丸中的IQ和PhIP，但只有添加量超過0.1%的3個(gè)處理組效果顯著（P＜0.05），其抑制效果最好的是0.5%處理組，抑制率為60%。其MeIQx和4,8-DiMeIQx只有在0.5%濃度時(shí)有抑制作用，并且效果不顯著，抑制率分別為12%和24%。0.1%處理組時(shí)MeIQx含量最高5.95 ng/g，濃度增加時(shí)，含量顯著降低（P＜0.05），而綠茶提取物對(duì)Norharman和Harman這2種雜環(huán)胺起到顯著促進(jìn)的影響（P＜0.05），添加量逐漸增加時(shí)，其促進(jìn)效果也逐漸減弱。Quelhas等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在牛肉中添加1%綠茶提取物腌制6 h后進(jìn)行煎炸，PhIP抑制率達(dá)75%，但對(duì)MeIQx和4,8-DiMeIQx沒有抑制作用。Yao等[23]發(fā)現(xiàn)，在雞肉中添加綠茶、烏龍茶及白茶提取物后，230 ℃下經(jīng)木炭烤制后的雞肉中雜環(huán)胺含量顯著下降。綜上所述，GTE在不同條件下對(duì)雜環(huán)胺形成的抑制或促進(jìn)作用也不同，茶多酚對(duì)烤肉中雜環(huán)胺的生成存在一定量效關(guān)系。

圖2 6種HAs的UPLC-ESI-MS離子譜圖

表4 GTE對(duì)炸羊肉丸中雜環(huán)胺形成的影響 單位：ng/g

3 結(jié)論

GTE的添加對(duì)油炸羊肉丸中PhIP和IQ的形成具有顯著抑制作用，隨著GTE添加量的增加，其含量逐漸降低，最高抑制率分別為52%和60%。同時(shí)，添加0.5% GTE對(duì)MeIQx、4,8-DiMeIQx也體現(xiàn)出抑制作用，抑制率分別為12%和24%，而GTE對(duì)Harman和Norharman含量體現(xiàn)促進(jìn)效果。但隨著添加量的增多，促進(jìn)效果逐漸減弱。其中，前體物質(zhì)也有不同程度的增加，添加GTE能夠阻礙前體物向雜環(huán)胺的轉(zhuǎn)化。試驗(yàn)為油炸羊肉丸的合理加工提供理論依據(jù)與參考，在防止食品高溫?zé)峒庸るs環(huán)胺危害、提高食品加工安全性方面具有重要意義。