響應(yīng)面法優(yōu)化新疆紙皮核桃分心木中總黃酮提取工藝

周煜凡，馮疆濤，白冰瑤

1.阿克蘇地區(qū)疾病預(yù)防控制中心（阿克蘇 843000）；2.塔里木大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（阿拉爾 843300）

核桃分心木（Diaphragma juglandisFructus）又稱核桃夾，是果核內(nèi)的木質(zhì)隔膜。新疆少數(shù)民族醫(yī)學(xué)記載，分心木可改善體寒、腎虛的生理虛弱，在臨床上主要用于治療遺精滑泄、尿頻遺尿、崩漏、帶下、泄瀉、痢疾[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，核桃分心木中富含黃酮、多酚、多糖、皂苷、生物堿、揮發(fā)油、氨基酸及微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分[2-3]，具有良好的藥理作用。

紙皮核桃因皮薄如紙、易取整仁而得名，又名露仁核桃，在我國(guó)主要產(chǎn)地分布在新疆和云南，又以新疆阿克蘇的產(chǎn)品為佳。紙皮核桃中含有豐富的蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)和微量元素及維生素[4]，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在脫貧攻堅(jiān)及鄉(xiāng)村振興中具有重要地位。當(dāng)前，新疆紙皮核桃分心木多以丟棄為主，利用率極低，造成生物資源的極大浪費(fèi)和一定程度的環(huán)境破壞，因此，通過(guò)化學(xué)方法建立分心木黃酮提取工藝是解決資源浪費(fèi)的重要手段之一。科研工作者對(duì)核桃分心木中各種具有藥用價(jià)值物質(zhì)提取研究較多[5-9]，但對(duì)于新疆紙皮核桃分心木報(bào)道較少，因此，采用新疆紙皮核桃分心木為原料，采用熱回流法提取分心木中的總黃酮，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，為深入開發(fā)紙皮核桃分心木提供研究基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

新疆紙皮核桃（購(gòu)自阿克蘇市三角地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)），將核桃分心木清洗后放置在陰涼處充分干燥，干脆后粉碎，過(guò)0.250 mm（60目）篩，置于保鮮袋中妥善保存；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇（均為分析純）。

GX-20多功能粉碎機(jī)（浙江高鑫工貿(mào)有限公司）；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器（金華市醫(yī)療儀器廠）；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；QENE單道移液器（上海寶予德科學(xué)儀器有限公司）；LE204E萬(wàn)分之一天平（梅特勒托利多集團(tuán)）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；DHG-9203A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參考文獻(xiàn)[10]方法，將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品充分干燥后精確稱取10.0 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶液將稱取的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品定容在100 mL容量瓶中，搖勻后作為0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。將配制好的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為母液，在10 mL容量瓶中按梯度精準(zhǔn)配制質(zhì)量濃度為0.00，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.06 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液中分別加入0.3 mL 5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的NaNO2溶液和10% Al(NO3)3，混合均勻后靜置6 min，加入4 mL 4%的NaOH溶液，用體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶液定容。靜置15 min，待定容好的溶液充分混合均勻，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品的吸光度，平行測(cè)定3次。

可根據(jù)紫外-可見分光光度法測(cè)得各濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（X）對(duì)應(yīng)的吸光度（Y），對(duì)結(jié)果進(jìn)行擬合，得到回歸方程Y=11.779X+0.067 6，R2=0.999 4。結(jié)果表明在0～0.06 mg/mL范圍內(nèi)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度與吸光度之間具有良好線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2 總黃酮提取工藝

采用熱回流法提取分心木中的黃酮，稱取1 g核桃分心木粉末置于圓底燒瓶，用一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液，冷凝回流，在一定溫度下以1 000 r/min磁力攪拌一段時(shí)間，待回流結(jié)束后將圓底燒瓶中的混合溶液倒出并抽濾，得黃酮粗提液。以30%乙醇將收集的粗提液定容至100 mL，備用，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方案，測(cè)定分心木黃酮粗提液的吸光度，平行測(cè)定3次，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算黃酮濃度，按式（1）計(jì)算黃酮提取率。

式中：Y為黃酮提取率，%；C為黃酮質(zhì)量濃度，g/mL；V為黃酮提取液體積，mL；m為紙皮核桃分心木質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察4個(gè)不同因素對(duì)黃酮吸光度的影響，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表1。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4 紙皮核桃總黃酮提取工藝優(yōu)化

采用Design-Expert 12.0.3.0軟件，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別將乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)影響因素組合，形成四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，以總黃酮提取率為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平表見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)測(cè)定3次，取平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差值；繪圖采用Origin 2019b軟件；響應(yīng)面分析軟件為Design-Expert 12.0.3.0；采用IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行顯著性分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紙皮核桃分心木總黃酮提取的影響。對(duì)不同乙醇的體積分?jǐn)?shù)（30%，40%。50%，60%和70%）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

由圖2可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)開始增大時(shí)，吸光度增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)總黃酮提取率為3.83%，達(dá)到最大，但乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，黃酮提取率降低。可能的原因是乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)，溶液極性較大，提取物溶出的雜質(zhì)較多，黃酮得率較低[11]，濃度增大時(shí)，極性開始減小，分心木中黃酮的極性與此體積分?jǐn)?shù)乙醇極性接近，提取率增大，但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，醇溶性的雜質(zhì)開始增多，而黃酮的溶出量減少[12]。由此得出乙醇體積分?jǐn)?shù)60%較為適宜。

2.1.2 不同料液比對(duì)紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

溶劑的用量會(huì)對(duì)總黃酮的提取率產(chǎn)生影響?？疾炝瞬煌弦罕龋?︰20，1︰30，1︰40，1︰50和1︰60 g/mL）對(duì)核桃分心木總黃酮的提取率的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

從圖3可以看出，料液比從1︰20（g/mL）變化至1︰40（g/mL）時(shí)，總黃酮提取率從2.75%增大至3.83%，繼續(xù)增加料液中液體占比，總黃酮提取率呈降低趨勢(shì)，1︰60（g/mL）時(shí)，總黃酮提取率3.04%。主要是由于溶劑對(duì)分心木中的黃酮具有溶解和擴(kuò)散作用，溶劑用量增大時(shí)，黃酮溶解得越多，提取率越高[13]，隨著溶劑體積繼續(xù)增大，黃酮溶解基本達(dá)到飽和，但醇溶性雜質(zhì)的溶解也逐漸增多[14]，黃酮提取率隨之降低，因此，料液比選擇1︰40（g/mL）。

2.1.3 不同提取時(shí)間對(duì)紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

溶劑萃取法提取總黃酮中，提取時(shí)間也會(huì)有重要影響。將核桃分心木分別浸泡1，2，3，4和5 h，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時(shí)間對(duì)紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，總黃酮提取率顯著增加，提取時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最大，提取時(shí)間超出3 h時(shí)，提取率呈降低趨勢(shì)?？赡艿脑蚴请S著時(shí)間的延長(zhǎng)，紙皮核桃分心木中的雜質(zhì)析出增多，黃酮提取率降低[15]。因此，提取時(shí)間選擇3 h。

2.1.4 不同提取溫度對(duì)紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

溫度的升高有利于溶劑分子熱運(yùn)動(dòng)，加快反應(yīng)速率。在核桃分心木提取總黃酮中，分別考察提取溫度為40，50，60，70和80 ℃時(shí)的總黃酮提取率，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取溫度對(duì)紙皮核桃分心木總黃酮提取率的影響

由圖5所示，隨著提取溫度的升高，總黃酮提取率逐漸增大，提取溫度70 ℃時(shí)為最大，提取溫度大于70 ℃時(shí)，提取率卻隨之降低?？赡艿脑蚴请S著提取溫度的升高，小分子運(yùn)動(dòng)加快，有利于紙皮核桃分心木黃酮的溶出[16]，但溫度繼續(xù)增加，有可能導(dǎo)致部分黃酮的結(jié)構(gòu)受到破壞[17]，此外，高溫下乙醇揮發(fā)，濃度降低也會(huì)導(dǎo)致黃酮提取率下降[18]。因此選擇提取溫度為70 ℃。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化分心木總黃酮提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以總黃酮提取率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表3所示的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用Design-Expert 12.0.3.0軟件進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程Y=3.86+0.149 2A+0.133 3B+0.717 5C+0.1D-0.18AB-0.172 5AC+0.21AD+0.157 5BC-0.322 5BD+0.057 5CD-0.276 2A2-0.262 5B2-0.323 8C2-0.387 5D2。

2.2.2 方差分析

從方差分析可以看出模型的P值小于0.000 1，響應(yīng)面回歸模型為極顯著水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，失擬項(xiàng)的P值大于0.05，影響不顯著，試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合良好，說(shuō)明各因素選擇合理。從表4可以看出，交互項(xiàng)BD，二次項(xiàng)A2，B2的P值小于0.05，說(shuō)明對(duì)紙皮核桃分心木總黃酮提取影響顯著，一次項(xiàng)C，二次項(xiàng)C2，D2的P值小于0.01，說(shuō)明對(duì)總黃酮提取影響極顯著，其他因素不顯著。根據(jù)F值和P值可以得到各因素影響分心木總黃酮提取率的順序：提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取溫度。

表4 方差分析

模型的多元相關(guān)系數(shù)R2=0.914 7，說(shuō)明所構(gòu)建的模型相關(guān)性較好；Radj2=0.829 4，Rpred2=0.683 3，Radj2-Rpred2＜0.2，回歸模型能充分說(shuō)明工藝過(guò)程；C.V.為7.50%（＜10%），表明試驗(yàn)的可信度和精確度較高；精密度為11.438 4（＞4），用此模型預(yù)測(cè)紙皮核桃分心木中總黃酮提取率合適[19-21]。

2.2.3 交互作用分析

為考察各個(gè)因素交互作用對(duì)總黃酮提取率的影響，根據(jù)二次方程分別作出任意2個(gè)試驗(yàn)因素間交互作用三維響應(yīng)面圖和等高線圖。

等高線和響應(yīng)曲面圖能直觀反映交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響程度，等高線越密集，曲面越陡，則交互作用的影響越顯著，且等高線越接近橢圓，2個(gè)因素的交互作用越強(qiáng)[22-23]。從圖6可以看出，料液比和提取溫度的交互作用最強(qiáng)，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度交互作用次之，對(duì)應(yīng)的響應(yīng)面圖坡度陡峭，與方差分析中的結(jié)論一致。

圖6 各因素交互作用對(duì)總黃酮提取率影響的等高線及響應(yīng)面圖

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Design-Expert 12.0.3.0預(yù)測(cè)結(jié)果可得：乙醇體積分?jǐn)?shù)56.110%、料液比1︰43.334（g/mL）、提取時(shí)間3.631 h、提取溫度69.312 ℃時(shí)，總黃酮提取率為4.200%。參照預(yù)測(cè)得到的最優(yōu)試驗(yàn)條件，同時(shí)為驗(yàn)證試驗(yàn)易于操作，將各條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)56%、料液比1︰43（g/mL）、提取時(shí)間3.6 h、提取溫度69℃，此時(shí)紙皮核桃分心木總黃酮提取率為4.131%±0.045%（n=3），預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間相差1.64%，結(jié)果吻合度高，說(shuō)明該模型的可靠性良好，工藝具有良好的穩(wěn)定性和可行性。

3 結(jié)論

以新疆紙皮核桃分心木為原料，采用熱回流法提取總黃酮，可以發(fā)現(xiàn)紙皮核桃分心木總黃酮的提取率與乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度有直接關(guān)系，并且運(yùn)用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化紙皮核桃分心木總黃酮提取工藝，得到總黃酮提取的最佳條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)56%，料液比1︰43（g/mL）、提取時(shí)間3.6 h、提取溫度69 ℃，黃酮提取率為4.131%±0.045%。該方法簡(jiǎn)單易行，產(chǎn)率較可觀，適用于新疆紙皮核桃分心木中黃酮的提取。