滇黃精皂苷飲料的研制及DPPH自由基清除能力

余晚霞，陳勇杏，董奎奎，郭磊，魯斌，華燕

西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（昆明 650224）

滇黃精（Polygonatum kingianumColl.et Hemsl）是百合科黃精屬植物，藥食兩用植物之一[1]，其根莖功效始見(jiàn)于《名醫(yī)別錄》，述其“調(diào)養(yǎng)心臟、脾胃、腎，祛除風(fēng)濕，長(zhǎng)期服用有益于身心健康、延長(zhǎng)壽命、且能作為充饑食物”[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為其具有調(diào)節(jié)免疫功能、提高記憶和學(xué)習(xí)的能力，并具有抗氧、延緩衰老的功用，起到延長(zhǎng)壽命的作用，另具有緩解疲乏、勞累，保護(hù)心臟和肝功能，亦可降低血糖濃度、抗癌、治療骨頭松散等多種藥用功能[3-4]。

滇黃精主要成分為甾體皂苷、三萜皂苷、異黃酮、多糖、苯丙素類(lèi)、生物堿及揮發(fā)油等多種活性成分，具有降血糖、抗炎等功能[5-6]。

竹葉黃酮是從淡竹葉中提取出的生物黃酮，具有保護(hù)心腦血管、調(diào)節(jié)血脂、增強(qiáng)免疫、抗疲勞、消炎抗菌、有效降低血小板集、防止血栓形成和延緩皮膚衰老等藥理作用[7]。同時(shí)，竹葉黃酮還可作風(fēng)味增強(qiáng)劑、甜味劑、色素在食品行業(yè)中應(yīng)用[8]。

已有學(xué)者研究了黃精保健酒、黃精速溶茶、黃精橙汁復(fù)合飲料等產(chǎn)品[9-11]，其中以皂苷為主要原料的產(chǎn)品有三七皂苷固體速溶顆粒劑[12]、滇黃精皂苷微膠囊[13]。以滇黃精皂苷、竹葉黃酮制作復(fù)合飲料的報(bào)道鮮少，試驗(yàn)在滇黃精提取物（皂苷）中添加自然風(fēng)味增強(qiáng)劑竹葉黃酮制成飲料，向當(dāng)前大眾響應(yīng)的自然、綠色、低糖等產(chǎn)品方向發(fā)展。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器與試劑

Hleidolph Digital旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph Group，德國(guó)）；ZK-100 B型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司）；BSA224S十萬(wàn)分之一電子天平（Sartorius集團(tuán)，德國(guó)）；Evolution 300分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技）；BCD-215KS海爾冰箱（青島海爾股份有限公司）；DHG-9140 A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；HH-2數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（金壇市丹瑞電器廠）；CA-1111冷卻水循環(huán)裝置（上海愛(ài)朗儀器有限公司）。

薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品（云南西力生物技術(shù)股份有限公司）；甲醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；香草醛（上海麥克林生化科技有限公司）；冰醋酸（四川西隴科學(xué)有限公司）；高氯酸（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；乙醇（四川西隴科學(xué)有限公司）；以上均為分析純。

1.2 試驗(yàn)原料

滇黃精于2022年9月26日采自云南臨滄，樣品程度新鮮飽滿；竹葉黃酮（云奇生物），包裝完好無(wú)損，避光保存；甜菊糖苷（食品級(jí)，河南萬(wàn)邦化工科技有限公司），符合國(guó)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)。

2 滇黃精皂苷飲料的生產(chǎn)工藝流程及操作要點(diǎn)

2.1 工藝流程

新鮮黃精→預(yù)處理→醇提水沉→滇黃精皂苷提取液→竹葉黃酮→甜菊糖苷→調(diào)配→蜂蜜→均質(zhì)→裝罐→檢測(cè)→殺菌→成品

2.2 試驗(yàn)操作要點(diǎn)

2.2.1 滇黃精皂苷提取液的制備

將新鮮滇黃精洗凈，切片，經(jīng)干燥，并稱(chēng)取一定量樣品，按料液比1︰20 g/mL用醇提水沉法提取，得到滇黃精皂苷提取液。以薯蕷皂苷元為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛冰醋酸-高氯酸法[14]測(cè)定皂苷含量，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=26.684x+0.018 2（R2=0.999 3）。

2.2.2 調(diào)配飲料

通過(guò)預(yù)試驗(yàn)對(duì)產(chǎn)品配方進(jìn)行組合研究后，將滇黃精皂苷提取液、竹葉黃酮和甜菊糖苷溶液分別按一定比例混合，調(diào)配出口感適宜的飲料，并進(jìn)行風(fēng)味評(píng)價(jià)。

2.2.3 裝罐，檢測(cè)，成品

將調(diào)配好的滇黃精天然飲料裝入玻璃容器，密封，在一定溫度、時(shí)間條件下滅菌，制成成品。

2.3 飲料調(diào)配單因素試驗(yàn)

影響滇黃精皂苷天然飲料風(fēng)味的因素為黃精皂苷提取液、竹葉黃酮、甜菊糖苷，確定其中任意兩個(gè)因素，改變單個(gè)變量，以感官評(píng)價(jià)為參考指標(biāo)開(kāi)展單因素試驗(yàn)。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取每個(gè)因素的三個(gè)水平，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以調(diào)配出滇黃精皂苷飲料的最佳配方比例。

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 感官評(píng)價(jià)指標(biāo)與試驗(yàn)方法

將調(diào)配好的飲料邀請(qǐng)12位學(xué)生，按感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 滇黃精皂苷天然飲料的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

3.1.1 竹葉黃酮提取液添加量對(duì)滇黃精皂苷天然飲料的影響及結(jié)果

在滇黃精皂苷提取液添加量30%、甜菊糖苷添加量0.04%的條件下，分別添加20%，25%，30%，35%和40%竹葉黃酮提取液進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 竹葉黃酮添加量對(duì)滇黃精天然飲料的影響

由表2可知，竹葉黃酮添加量對(duì)滇黃精皂苷天然飲料的風(fēng)味影響，以30%的添加量最適宜。

3.1.2 甜菊糖苷添加量對(duì)滇黃精天然飲料的影響及結(jié)果

當(dāng)竹葉黃酮的添加量為30%、滇黃精皂苷溶液添加量為35%時(shí)，選取0.03%，0.04%，0.05%，0.06%和0.07%甜菊糖苷進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 甜菊糖苷添加量對(duì)滇黃精天然飲料的影響

由表3得出：甜菊糖苷添加量為0.04%時(shí)最好。

3.1.3 滇黃精皂苷提取液添加量對(duì)滇黃精天然飲料風(fēng)味的影響及結(jié)果

當(dāng)竹葉黃酮添加量為30%、甜菊糖苷添加量為0.04%時(shí)，選取25%，30%，35%，40%和45%滇黃精皂苷提取液進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 滇黃精皂苷提取液對(duì)滇黃精天然飲料的影響

由表4得出：當(dāng)竹葉黃酮添加量為30%、甜菊糖苷添加量為0.04%時(shí)，滇黃精皂苷提取液最佳添加量為35%。

3.2 檢測(cè)指標(biāo)

3.2.1 理化指標(biāo)檢測(cè)方法

可溶性固形物，采用手持折光儀法[15]；pH測(cè)定，利用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

3.2.2 微生物檢測(cè)方法

飲料微生物指標(biāo)參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》及GB 4789.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》。

3.2.3 DPPH自由基清除率的測(cè)定

①大江大河治理滯后，防洪工程體系薄弱。黑龍江沒(méi)有經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的規(guī)劃和治理，防洪體系不健全，干流堤防防洪標(biāo)準(zhǔn)大部分不足20年一遇，沙基沙堤多且部分堤段不閉合。嫩江、松花江干流堤防有1/3沒(méi)有達(dá)到規(guī)劃標(biāo)準(zhǔn)，豐滿、察爾森等骨干水庫(kù)還存在病險(xiǎn)問(wèn)題，胖頭泡、月亮泡蓄滯洪區(qū)建設(shè)明顯滯后。

參考Mc Cue等[16]的方法并略修改，采用分光光度法對(duì)DPPH自由基清除率進(jìn)行測(cè)定，取2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液和2 mL DPPH溶液（濃度為0.5 mmol/mL）充分混勻后，避光靜置30 min后在517 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定其吸光度A1，同法，測(cè)定2.0 mL乙醇加2 mL（不同質(zhì)量濃度的）樣品溶液的吸光度A2，以及2.0 mL DPPH溶液，加入2.0 mL甲醇，測(cè)定其吸光度A0，以甲醇為空白。DPPH清除率（%）按式（1）計(jì)算：

3.3 滇黃精皂苷天然飲料配方的優(yōu)選

為使配制的飲料具有良好的口感、風(fēng)味、色澤及穩(wěn)定性，在以竹葉黃酮、甜菊糖苷、滇黃精皂苷提取液三個(gè)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)篩選最佳飲料配方。

3.3.1 響應(yīng)面（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果

采用響應(yīng)面（Box-Behnken）優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以滇黃精皂苷提取液、竹葉黃酮、甜菊糖苷的添加量為自變量，以滇黃精皂苷天然飲料的感官評(píng)分為響應(yīng)值繪制響應(yīng)面，分析出滇黃精皂苷飲料的最佳配方。

以滇黃精皂苷飲料的感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，在配方優(yōu)化的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取竹葉黃酮添加量（A）、甜菊糖苷添加量（B）、滇黃精皂苷提取液添加量（C）為影響因素。Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5，回歸模型方差分析見(jiàn)表6。

表5 飲料配方優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 飲料配方優(yōu)化回歸模型方差分析

由表6中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次項(xiàng)回歸擬合，得到以感官評(píng)價(jià)（Y）為響應(yīng)值，以竹葉黃酮添加量（A）、甜菊糖苷添加量（B）、滇黃精皂苷提取液添加量（C）為自變量的二次項(xiàng)回歸方程：Y=91.06+1.69A-0.875 0B+0.937 5C+1.87AB-1.50AC-1.62BC-5.28A2-5.66B2-2.78C2。

響應(yīng)面二次回歸方差及顯著性分析結(jié)果（模型的P＜0.000 1）說(shuō)明該方程模型級(jí)為顯著，失擬項(xiàng)（Lack of it）檢驗(yàn)為不顯著，說(shuō)明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合性較好。在此試驗(yàn)條件下，回歸模型所考察的因素足以反映各成分對(duì)滇黃精皂苷飲料口感的影響，判定系數(shù)R2=0.986 6，Radj2=0.969 4，說(shuō)明回歸模型與試驗(yàn)值擬合較好，可用于滇黃精皂苷飲料感官評(píng)分的理論推測(cè)和分析。

應(yīng)用多元二次回歸方程，擬合表6的試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，該方程可推算出試驗(yàn)因素在響應(yīng)面曲面中所覆蓋的區(qū)域并進(jìn)行初步篩選因素的最佳取值范圍，根據(jù)多元二次回歸方程模型分別做出試驗(yàn)因素間交互作用的3-D響應(yīng)曲面和等高線（見(jiàn)圖1～圖3）以評(píng)價(jià)竹葉黃酮與滇黃精皂苷、竹葉黃酮與甜菊糖苷、滇黃精皂苷與甜菊糖苷之間因素作用試驗(yàn)評(píng)分的影響。

圖1 試驗(yàn)因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

由圖1可知，滇黃精皂苷在一定條件下，各影響因素在一定區(qū)域內(nèi)，試驗(yàn)感官評(píng)分隨甜菊糖苷和竹葉黃酮的改變而呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，研究發(fā)現(xiàn)滇黃精皂苷天然飲料感官評(píng)分獲得最高值存在于響應(yīng)面曲面的最頂部，口感適中，色澤清亮、狀態(tài)具穩(wěn)定性。

由圖2可知，甜菊糖苷在一定條件下，各影響因素在一定區(qū)域內(nèi)，試驗(yàn)感官評(píng)分隨滇黃精皂苷和竹葉黃酮的改變而呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，滇黃精皂苷天然飲料感官評(píng)分獲得最高值存在于響應(yīng)面曲面的最頂部，口感適中，飲料具自然的風(fēng)味。

圖2 試驗(yàn)因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

由圖3可知，竹葉黃酮在一定條件下，各影響因素在一定區(qū)域內(nèi)，試驗(yàn)感官評(píng)分隨滇黃精皂苷提取液和竹葉黃酮的改變而呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，滇黃精皂苷天然飲料感官評(píng)分獲得最高值存在于響應(yīng)面曲面的最頂部，口感適中，風(fēng)味獨(dú)特。

圖3 試驗(yàn)因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

4 驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)Design-Expert 13.0軟件得出滇黃精皂苷飲料最優(yōu)配比：滇黃精皂苷36.59%，竹葉黃酮31.22%，甜菊糖苷0.048 3%，接近于天然飲料，此條件下，感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為91.27分。且A2B2C2的數(shù)值P值均為顯著，對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響為顯著。為最大化降低滇黃精皂苷固有苦澀味，故加0.5%的蜂蜜，以蜂蜜的醇香味掩蓋其不良風(fēng)味。

為便于生產(chǎn)和實(shí)際操作，故將配方修改為滇黃精皂苷為36%、竹葉黃酮30%、甜菊糖苷0.04%，選取該組合做進(jìn)一步的驗(yàn)證試驗(yàn)，得出滇黃精皂苷飲料的感官評(píng)分為90.43分，與預(yù)測(cè)值相近，證明了該方法的可行性。

5 滇黃精皂苷飲料的質(zhì)量評(píng)價(jià)

5.1 感官指標(biāo)

色澤：呈淡茶色，色澤均一飲料穩(wěn)定，富有較好光澤，口感純正，甜度適中，無(wú)異味，流動(dòng)性好；滋味：有滇黃精氣味和竹葉黃酮特有風(fēng)味。

5.2 理化指標(biāo)

飲料的主要理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如表7所示。

表7 飲料的主要理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

5.3 微生物指標(biāo)

微生物指標(biāo)及結(jié)果如表8所示。

表8 微生物指標(biāo)及結(jié)果

5.4 滇黃精皂苷飲料對(duì)DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基清除能力可以作為天然抗氧化劑抗氧化活性的衡量指標(biāo)[17]。不同質(zhì)量濃度滇黃精皂苷飲料對(duì)DPPH自由基清除能力見(jiàn)圖4。

圖4 滇黃精皂苷飲料溶液質(zhì)量濃度對(duì)DPPH自由基清除能力的影響

由圖4可知，不同質(zhì)量濃度（0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50和2.00 mg/mL）的滇黃精皂苷飲料溶液對(duì)DPPH自由基均有一定的清除作用，且隨著提取液濃度的增加清除率也隨之身高，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度達(dá)1.50 mg/mL時(shí)，清除率趨于平衡。通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)其對(duì)DPPH自由基清除率為59.81%，說(shuō)明該飲料具有一定體外抗氧化活性。

滇黃精主要含有多糖、皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)等成分。趙明等[18]已研究并證實(shí)滇黃精具有抗氧化活性及對(duì)人體具有安全性；陳斌等[19]研究含滇黃精的組合物，亦表明其具有抗氧化作用；以滇黃精與玉米須、苦瓜等制備滇黃精飲料，具有止渴、降糖作用[20]。結(jié)合試驗(yàn)，推測(cè)滇黃精皂苷飲料抗氧化性除了與其自身含有的甾體皂苷發(fā)揮主要效用外，還可能與黃酮類(lèi)物質(zhì)有關(guān)。

6 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定滇黃精皂苷天然飲料的最佳配方：滇黃精皂苷提取液36%，竹葉黃酮30%，甜菊糖苷0.04%，蜂蜜0.5%。配制的滇黃精皂苷天然飲料呈淡茶色，有光澤，入口甘甜，口感適宜、清爽細(xì)膩，有竹葉黃酮、皂苷自然風(fēng)味，其中可溶性固形物含量為0.8%，pH為5.43，總皂苷含量為1.75 mg/100 mL，飲料對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到59.81%，具有良好的抗氧化性，是一種含天然風(fēng)味劑的低糖、營(yíng)養(yǎng)型飲料，具有可觀的發(fā)展前景。