廣譜抗菌活性瑞士乳桿菌AJT 在發(fā)酵乳中的應(yīng)用

張恩馨，劉娜，劉瑋，梁程媛，塔娜，烏云達(dá)來

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018;2.赤峰市農(nóng)牧局，內(nèi)蒙古 赤峰 150400）

0 引 言

隨著生活水平的快速發(fā)展，發(fā)酵乳逐漸變成了人們的剛需[1]。發(fā)酵乳在發(fā)酵過程中可將牛奶中的乳糖分解為半乳糖和葡萄糖[2]，緩解乳糖不耐癥[3]，同時(shí)可將蛋白質(zhì)分解為細(xì)微的蛋白質(zhì)顆粒，還可以降解酪蛋白，使得發(fā)酵乳比一般乳中的必需氨基酸和肽更豐富[4-5]，還可以降低膽固醇濃度[6-7]，對(duì)人體健康有益[8]。目前市場(chǎng)上的發(fā)酵乳存在著質(zhì)量安全問題引起了政府、媒體和消費(fèi)者的高度關(guān)注[9]，發(fā)酵乳產(chǎn)品由于貨架期較短使得發(fā)酵乳在長(zhǎng)時(shí)間跨區(qū)域銷售受到了一定的限制[10]，消費(fèi)者對(duì)發(fā)酵乳質(zhì)量的期望值不斷下降[11]。而發(fā)酵乳在生產(chǎn)過程中，影響發(fā)酵乳保質(zhì)期的因素有很多，如生產(chǎn)原料的微生物含量、生產(chǎn)過程中的衛(wèi)生條件、發(fā)酵乳后酸化過程、包裝材料的衛(wèi)生等[12]。發(fā)酵乳的質(zhì)量安全問題源于其保質(zhì)期短，冷鏈運(yùn)輸成本高及品質(zhì)安全，所以延長(zhǎng)發(fā)酵乳的保質(zhì)期就尤為關(guān)鍵。

瑞士乳桿菌（L.helveticus）為乳酸桿菌屬中常見的益生菌[13-15]，是發(fā)酵乳制品的發(fā)酵劑[16]。L.helveticus 能賦予產(chǎn)品優(yōu)良的感官性質(zhì)，且能產(chǎn)生一些生物活性肽，如ACE 抑制肽和細(xì)菌素[17-18]，其產(chǎn)生的具有抑菌或殺菌作用的物質(zhì)在食品防腐、保鮮和延長(zhǎng)貨架期等方面起重要作用[19-21]。L.helveticus AJT 篩選自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，具有廣譜抗菌活性，對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌均有抑制作用，尤其對(duì)真菌的抑制作用更為突出[22]。因此，將L.helveticus AJT 用于發(fā)酵乳制備中，探究其對(duì)發(fā)酵乳保質(zhì)期的延長(zhǎng)效果。

1 材料與方法

1.1 菌株與主要試劑

廣譜抗菌活性L.helveticus AJT 分離自內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)乳制品；S.thermophilus ST962 和L.bulgaricus LB1823均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵乳的制備工藝

全脂奶粉→加蔗糖→水化（45 ℃，30 min）→預(yù)熱（65 ℃）→均質(zhì)→殺菌（95 ℃，加熱5 min）→迅速冷卻到（45 ℃）→接種（接種時(shí)要求按無菌操作進(jìn)行，避免污染）→發(fā)酵→迅速冷卻→放在冰箱中4 ℃后熟

實(shí)驗(yàn)組以L.helveticus AJT 與S.thermophilus ST962作為發(fā)酵劑；對(duì)照組以S.thermophilus ST962 和L.bulgaricus LB1823 作為發(fā)酵劑。

1.2.2 發(fā)酵乳正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)發(fā)酵乳制備具有主要影響的4 種因素（菌株AJT 和菌株ST962 配比（A），接種量（B），培養(yǎng)溫度（C），蔗糖濃度（D））作為自變量，利用SPSS 軟件設(shè)計(jì)正交設(shè)實(shí)驗(yàn),如表1 所示，以感官評(píng)分作為響應(yīng)值，對(duì)發(fā)酵乳發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.2.3 發(fā)酵乳感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

以RHB-2020《發(fā)酵乳感官評(píng)鑒細(xì)則》為參照[23]，并修訂制作發(fā)酵乳感官評(píng)分表進(jìn)行評(píng)定，如表2 所示。

表2 發(fā)酵乳感官評(píng)分

1.2.4 滴定酸度的測(cè)定

以GB 5009.239-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測(cè)定》測(cè)定發(fā)酵乳的滴定酸度[24]。

1.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇4 組發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 乳酸菌活菌數(shù)計(jì)數(shù)

以GB 4789.35-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》測(cè)定發(fā)酵乳活菌數(shù)[25]。

1.2.7 大腸菌群、霉菌、金黃色葡萄球菌的檢測(cè)

大腸菌群的計(jì)數(shù)根據(jù)GB 4789.3-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》進(jìn)行[26]；霉菌的計(jì)數(shù)根據(jù)GB 4789.15-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》進(jìn)行[27]；金黃色葡萄球菌的檢測(cè)根據(jù)GB 4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》進(jìn)行[28]。

1.2.8 黏度的測(cè)定

將樣品從冰箱中取出放置使其達(dá)到室溫后，取100 mL 發(fā)酵乳用SNB-2 型數(shù)字黏度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，采用3 號(hào)轉(zhuǎn)子，保持扭矩在10%～90%內(nèi)有效，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3 次，計(jì)算平均值[28]。

1.2.9 發(fā)酵乳保質(zhì)期的研究

將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別放置于4 ℃和室溫（20 ℃）條件下，每隔7 d 分別取樣，測(cè)定發(fā)酵乳中滴定酸度、乳酸菌活菌數(shù)、霉菌、大腸菌群、金黃色葡萄球菌的指標(biāo)。

1.2.10 室溫暴露試驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組于室溫（20 ℃）條件下敞口放置，每隔一日取樣（共7 d）檢測(cè)霉菌，每個(gè)樣品做3 組平行樣。霉菌計(jì)數(shù)方法同1.2.7。

1.2.11 數(shù)據(jù)分析

用Excel 處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵乳制備條件正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

從發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果可知，如表3 所示，凝乳時(shí)間在3.0～5.0 h 之間，符合工業(yè)化發(fā)酵要求。經(jīng)方差分析確定，影響發(fā)酵乳感官評(píng)分的因素主次順序?yàn)镈＞A＞C＞B，即蔗糖含量＞菌種配比＞培養(yǎng)溫度＞接種量。確定發(fā)酵乳最優(yōu)發(fā)酵條件組合為A2B2C3D1，即菌種比例為1∶3、接種量為4%（體積比）、培養(yǎng)溫度為42 ℃、蔗糖濃度為6.0 g/mL。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

發(fā)酵乳發(fā)酵條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)如表4 所示，與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，發(fā)酵乳滋味純正、香氣濃郁、凝乳質(zhì)地光滑、無不良發(fā)酵氣味。

表4 試驗(yàn)結(jié)果比較

表5 發(fā)酵乳中微生物變化

2.3 發(fā)酵乳酸度的變化

在4 ℃貯藏期實(shí)驗(yàn)組的滴定酸度如圖1（a）低于對(duì)照組，尤其在冷藏至35 d 時(shí)對(duì)照組滴定酸度已經(jīng)超過120.0 °T，而實(shí)驗(yàn)組的滴定酸度較適宜（<110.0 °T）。在常溫（20 ℃）貯藏至第21 天時(shí)實(shí)驗(yàn)組的滴定酸度如圖1（b）為120.2 °T，而對(duì)照組的滴定酸度為142.8 °T，且有令人不愉快的氣味。因此，菌株AJT 對(duì)發(fā)酵乳的后酸化起到抑制作用。

圖1 發(fā)酵乳酸度的變化

2.4 發(fā)酵乳乳酸菌數(shù)的變化

在4 ℃貯藏期實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的乳酸菌總數(shù)如圖2（a）所示差距不大，而到后期由于菌株AJT 抑制發(fā)酵乳后酸化作用，實(shí)驗(yàn)組乳酸菌數(shù)高于對(duì)照組。在常溫（20 ℃）貯藏期，對(duì)照組乳酸菌數(shù)高于實(shí)驗(yàn)組，貯藏至第35 天時(shí)實(shí)驗(yàn)組乳酸菌數(shù)如圖2（b） 為2.39×106CFU/mL，對(duì)照組乳酸菌數(shù)為1.2×106CFU/mL，此時(shí)兩種發(fā)酵乳酸度已超150 °T，雖實(shí)驗(yàn)組乳酸菌數(shù)高于對(duì)照組，但實(shí)驗(yàn)組的酸度低于對(duì)照組。因此，菌株AJT 能顯著抑制發(fā)酵乳的后酸化作用，該結(jié)果與發(fā)酵乳酸度的變化結(jié)果一致。

圖2 發(fā)酵乳乳酸菌數(shù)的變化

2.5 發(fā)酵乳的微生物變化

在4 ℃貯藏期實(shí)驗(yàn)組符合GB 19302-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》的要求[29]，未檢出霉菌，只檢出少量大腸菌群，均符合國家標(biāo)準(zhǔn)（≤5 CFU/mL）。而對(duì)照組貯藏至第7 天時(shí)大腸菌群數(shù)達(dá)15 CFU/mL，超出國家標(biāo)準(zhǔn)。因此，實(shí)驗(yàn)組能夠顯著抑制大腸菌群的生長(zhǎng)。

在常溫（20 ℃）貯藏期實(shí)驗(yàn)組未檢出霉菌，只檢出少量的大腸菌群，貯藏至第7 天大腸菌群數(shù)為4 CFU/mL，符合國家標(biāo)準(zhǔn)（≤5 CFU/mL），而對(duì)照組貯藏至第7天時(shí)大腸菌群數(shù)為10 CFU/mL，已超出國家標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組貯藏至第7 天和第14 天時(shí)有金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，可能是由于檢測(cè)過程中受到污染所致。因此，實(shí)驗(yàn)組能夠顯著抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。

2.6 室溫暴露試驗(yàn)

在發(fā)酵乳的生產(chǎn)過程中的質(zhì)量問題有可能是因?yàn)槊咕廴驹斐傻腫30]。發(fā)酵乳室溫暴露試驗(yàn)見結(jié)果如表6 所示，在室溫條件下，將對(duì)照組放置第2 天就被檢出霉菌（10 CFU/mL），而實(shí)驗(yàn)組到第5 天時(shí)才檢出霉菌（10 CFU/mL）。因此，實(shí)驗(yàn)組具有抑制霉菌特性，尤其與菌株AJT 對(duì)真菌的抑制作用更為突出相吻合。

表6 常溫條件下發(fā)酵乳中霉菌的變化

3 結(jié) 論

發(fā)酵乳的消費(fèi)量日益增大，已成為人們生活中的重要乳制品之一。從廣譜抗菌活性L.helveticus AJT 的發(fā)酵乳制備中的應(yīng)用可知，菌株AJT 具有良好的發(fā)酵特性；菌株AJT 和S.thermophilus ST962 作為混合發(fā)酵菌種的發(fā)酵乳最優(yōu)發(fā)酵條件確定為菌株AJT 和ST962 配比為1∶3，接種量4.0%（體積比），發(fā)酵溫度42 ℃，蔗糖添加量6.0 g/mL；相比于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組可抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，并且具有抑制發(fā)酵乳后酸化作用，其在4 ℃條件下可貯藏42 d，常溫（20 ℃）條件下能夠貯藏21 d。本研究結(jié)果為菌株AJT 的發(fā)酵乳應(yīng)用研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。