北京地區(qū)貓泛白細(xì)胞減少癥病毒VP2基因的遺傳進(jìn)化分析

董悅欣，張啟龍，程敏姮，王林，栗云鵬，傅彩霞，張永紅，崔德鳳*，張瑋*

(1. 北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100080；3. 北京市動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102629)

貓泛白細(xì)胞減少癥又稱貓傳染性腸炎、貓瘟熱，是由貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(feline panleukopenia virus，F(xiàn)PV)引起的[1]。FPV是細(xì)小病毒科(Parvoviridae)細(xì)小病毒屬(Parvovirus)成員，為單股無囊膜線狀DNA病毒。細(xì)小病毒適于在增殖能力強(qiáng)并處于有絲分裂過程中的細(xì)胞內(nèi)增殖，故其主要侵害動物快速分化或分裂迅速的組織，如腸上皮細(xì)胞及骨髓等，會導(dǎo)致出現(xiàn)腸炎等相關(guān)疾病[2]。目前，貓泛白細(xì)胞減少癥在全球范圍廣泛流行，大多以雙相熱、嘔吐、脫水、白細(xì)胞顯著減少和出血性腸炎為主要臨床特征，給我國貓科動物的健康帶來巨大的影響[3-4]。妊娠早期的母貓在感染FPV后，有可能造成流產(chǎn)、死胎等癥狀[5]。該病毒還可以通過母體直接感染胎兒，并對胎兒的神經(jīng)發(fā)育造成影響，出現(xiàn)小腦發(fā)育不全、腦積水等癥狀。

貓泛白細(xì)胞減少癥主要根據(jù)白細(xì)胞減少進(jìn)行初步診斷，由于FPV具有血凝性，故可使用血清中和試驗、血凝和血凝抑制試驗進(jìn)行鑒定，還可以通過采用ELISA、PCR等方法進(jìn)行確診[6-7]。免疫接種是該病主要防控措施，目前用于預(yù)防FPV感染的疫苗有弱毒疫苗和滅活疫苗2種。FPV基因組全長為5 kb，在電子顯微鏡下觀察，能夠看到FPV粒子呈現(xiàn)為一個等軸對稱的二十面體，直徑大小為 20～24 nm。FPV二十面對稱結(jié)構(gòu)的核衣殼蛋白的每一面，都是由VP1、VP2和VP3這3個結(jié)構(gòu)蛋白按一定的方式進(jìn)行裝配蛋白分子構(gòu)成的，其中VP2蛋白理化性質(zhì)穩(wěn)定，抗原性較強(qiáng)，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的抗體，為主要的結(jié)構(gòu)蛋白，在決定病毒的宿主范圍和病毒抗原性方面起到了重要作用，是病毒主要的免疫保護(hù)性抗原蛋白[8]。FPV共擁有2種非結(jié)構(gòu)蛋白，分別為NS1和NS2，主要作用是調(diào)控以及保護(hù)FPV基因的表達(dá)，這2種蛋白是在病毒早期的增殖過程中最優(yōu)先被合成的。NS1影響貓細(xì)小病毒的基因組以及核衣殼蛋白的組裝，也能剪切或者結(jié)合DNA片段，以此來調(diào)節(jié)FPV基因組的復(fù)制，不僅在FPV感染宿主體內(nèi)的時候發(fā)揮著重要的作用，同時也在FPV的體外感染中發(fā)揮不可或缺的功能；NS2蛋白在病毒復(fù)制增殖的過程中，影響病毒衣殼蛋白在靶細(xì)胞核內(nèi)的運輸和組裝[9-10]。

如今，隨著病毒不斷地進(jìn)化和宿主范圍的擴(kuò)大，F(xiàn)PV出現(xiàn)了抗原變異，臨床上也出現(xiàn)了貓免疫失敗的現(xiàn)象。因此了解FPV的遺傳變異和流行情況對新型疫苗的研發(fā)和該疾病的防治具有重要作用[11-12]。本研究從北京寵物醫(yī)院患貓采集肛拭子，擴(kuò)增VP2基因并對其序列進(jìn)行分析，以期了解北京地區(qū)FPV的流行趨勢，豐富我國FPV的流行病學(xué)資料，為控制該病的傳播提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

從北京地區(qū)寵物醫(yī)院收集了不同品種、不同月齡、不同免疫狀況的疑似感染FPV的貓肛拭子16份(詳見表1)，已對貓冠狀病毒、貓杯狀病毒及沙門菌等其他疑似致病原進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性。樣品于-20 ℃保存，備用。

表1 樣本信息

1.2 主要試劑與儀器

PCR MasterMix購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；磁珠法核酸提取試劑購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA的小量純化試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)DH5α、質(zhì)粒連接試劑盒，均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

生物安全柜購自美國Nuaire公司，TGuide S32全自動核酸提取純化儀購自天根生化科技有限公司，PCR儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，電泳儀購自北京六一儀器廠，移液器購自德國Eppendorf公司。

1.3 樣品的處理與核酸提取

在樣品中分別加入500 μL生理鹽水，4 000 r/min離心10 min，取200 μL上清液至一新離心管中，按核酸提取試劑盒說明進(jìn)行核酸的提取，得到DNA溶液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 VP2基因的PCR鑒定

根據(jù)FPV VP2基因保守序列設(shè)計引物[13]，上游引物序列為：ATGAGTGATGGAGCAGTT；下游引物序列為：TTAATATAATTTTCTAGG，擴(kuò)增片段的大小為1 755 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：DNA模板3 μL[14]，上、下游引物各1 μL，2×Buffer 25 μL，超純水20 μL，總反應(yīng)體積50 μL。循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共 35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。取出PCR產(chǎn)物20 μL在1%瓊脂糖凝膠電泳上電泳檢查結(jié)果。將擴(kuò)增產(chǎn)物交由生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.5 12株FPV VP2基因的克隆與測序

1.5.1 PCR產(chǎn)物的回收

對1.4中PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收：在紫外分析儀下，切下帶有目的條帶的瓊脂塊。將其放入離心管中，計算凈重，用于確定DNA回收過程中溶膠試劑的用量[15]。參考DNA凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，將回收樣品置于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 PCR產(chǎn)物的克隆

按照PLB Vector連接體系：目的基因5 μL，載體1 μL，Buffer 1 μL，酶1 μL，超純水2 μL，總反應(yīng)體積10 μL。在恒溫水浴鍋中進(jìn)行目的片段和載體PUC57質(zhì)粒的連接[16]。參考文獻(xiàn)[6]的方法，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，參考文獻(xiàn)[17]進(jìn)行提取質(zhì)粒，將所提取的質(zhì)粒DNA送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 12株FPV VP2基因遺傳進(jìn)化分析

將測序獲得的序列通過NCBI、MEGA 7.0等軟件進(jìn)行分析。本研究中所使用的51個參考序列(表2)均從GenBank獲得。

表2 VP2基因的參考序列

2 結(jié)果

2.1 VP2基因鑒定

對動物醫(yī)院采集的疑似感染FPV的16份貓肛拭子進(jìn)行VP2基因的PCR鑒定與擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果顯示，從12份樣品中獲得與預(yù)期一致的目的基因片段(圖1)。

2.2 目的片段測序

將目的片段經(jīng)膠回收、純化、連接載體后測序，測序結(jié)果顯示12個基因片段大小均為1 755 bp，經(jīng)Blast與標(biāo)準(zhǔn)株(NCBI登錄號：M38246.1)序列比對，一致度為99.20%～99.54%，分析均為FPV VP2基因。對12條序列進(jìn)行編號，分別命名為：FPV-2021-BJ01、FPV-2021-BJ02、FPV-2021-BJ03、FPV-2021-BJ04、FPV-2021-BJ05、FPV-2021-BJ06、FPV-2021-BJ07、FPV-2021-BJ08、FPV-2021-BJ09、FPV-2021-BJ10、FPV-2021-BJ11、FPV-2021-BJ12。

2.3 VP2基因遺傳進(jìn)化分析

對GenBank發(fā)布的所有FPV、犬細(xì)小病毒(CPV)VP2序列進(jìn)行分析，由于有些來自同一國家或省市的流行毒株序列完全一致，最終篩選到51條VP2基因序列(包括6株CPV毒株、2株疫苗株和44株FPV毒株)[13]，與試驗所得12份陽性樣品使用MEGA 7.0等軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。其中亞洲40株(中國32株，日本5株，韓國3株)；歐洲17株(意大利10株，英國 3株、疫苗株2株，葡萄牙1株，法國1株)；北美洲5株(美國5株)；大洋洲1株(澳大利亞1株)。圖2的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，形成了FPV和CPV兩大分支，其中CPV單獨形成一個基因群(CPV-Group)，F(xiàn)PV在不斷進(jìn)化過程中形成3個基因群，即G1、G2和 G3[18]。G1型34株，包括亞洲32株和歐洲2株；G2型16株，包括亞洲5株、歐洲8株、大洋洲1株和北美洲2株；G3型7株，全部來自歐洲(意大利)。本次試驗所得的12份陽性樣品屬于G1型，與標(biāo)準(zhǔn)株M38246.1、疫苗株EU498680、EU498681之間親緣性較遠(yuǎn)；與韓國2007年分離株KF002(EU252146.1)在同一基因群內(nèi)，親緣性高；與意大利2003年分離株150 03(EU498685.1)分群不同，親緣性低。

注：○代表本研究中測得的FPV的VP2序列。

2.4 VP2基因同源性比對

使用DNAStar等軟件將試驗獲得的12條VP2基因序列與全球代表性的11個來自不同國家和地區(qū)的毒株參考序列進(jìn)行對比分析(圖3)。12條序列核苷酸同源性比對顯示，它們之間的同源性為 99.0%～100%；與FPV參考株M38246.1同源性為99.2%～99.5%；與2株疫苗株EU498680、EU498681進(jìn)行比較，同源性為99.0%～99.4%；與意大利2003年分離株150 03 (EU498685.1)的同源性為98.9%～99.3%；與法國2009年分離株P(guān)LI-IV 166 (D88287.1)和英國2006年分離株97 06-10 (EU498713.1)同源性為99.0%～99.4%；與韓國2007年分離株KF002 (EU252146.1)同源性為99.7%～99.9%；與中國北京2018年分離株Beijing-L4(MK266796.1)和日本2000年分離株V208(AB054226.1)同源性為99.1%～99.4%。

圖3 FPV VP2基因同源性分析

2.5 VP2關(guān)鍵氨基酸位點的突變情況

通過查閱文獻(xiàn)資料，F(xiàn)PV VP2蛋白的第80、87、93、101、103、297、300、305、323、426、555、564和568位氨基酸位點是決定分離株抗原性和宿主范圍的關(guān)鍵位點，這些關(guān)鍵位點的變化會影響其抗原特性和宿主范圍[19-20]。將本研究獲得的序列與國內(nèi)外部分FPV和CPV毒株的 VP2基因上關(guān)鍵氨基酸位點進(jìn)行分析對比，結(jié)果見表3。試驗所得的12條序列的關(guān)鍵氨基酸位點均相同，未出現(xiàn)突變現(xiàn)象；與參考株CU-4相比，第101位出現(xiàn)了突變I-T，但對比其他毒株，除意大利的Purevax merial vaccine疫苗株外，其余毒株的101位氨基酸均為T；針對第323位氨基酸位點，僅有意大利2008年分離株V142(AB054226)出現(xiàn)突變D-N；與CPV VP2蛋白關(guān)鍵氨基酸位點比對，多個位點出現(xiàn)明顯差異：第80位(K-R)、第93位(K-N)、第103位(V-A)、第323位(D-N)、第564位(N-S)、第568位(A-G)；與CPV2a、CPV2b、New CPV2a、New CPV2b毒株在個別關(guān)鍵位點顯示出差異性，如第87位(M-L)、第93位(K-N)、第300位(A-G)、第305位(Y-D)和第101位(T-I)等。

表3 FPV、CPV的VP2基因上關(guān)鍵位點氨基酸突變情況

3 討論

FPV對貓科動物的危害較大，其核衣殼蛋白由60個VP1及VP2蛋白按照特定的排列方式相互交替結(jié)合而成，其中VP1蛋白約占FPV核衣殼蛋白的10%，而VP2蛋白約占90%[12]，所以VP2蛋白對于FPV感染有重要影響，VP2基因在決定其抗原性和宿主范圍中起到了重要作用[16]。本研究通過收集疑似感染FPV的貓肛拭子擴(kuò)增VP2基因，共獲得12條基因序列，對其進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析、同源性比對和關(guān)鍵氨基酸位點突變情況分析。

根據(jù)VP2基因遺傳進(jìn)化分析，G1群多數(shù)由亞洲毒株組成；G2群由世界各地毒株聚集組成，但主要為歐洲、亞洲毒株，與G1群比較，起源較早且包括2株疫苗株；G3群多數(shù)由歐洲毒株組成。從世界范圍分布上分析，亞洲、歐洲流行株在G1、G2、G3群均有分布，北美洲、大洋洲流行株主要位于G2群內(nèi)。就我國而言，F(xiàn)PV毒株主要為G1群，且不同地區(qū)之間未發(fā)現(xiàn)有明顯的地理分離現(xiàn)象。到目前為止，世界范圍內(nèi)FPV的流行株是以G1和G2群為主，G3群也在部分國家流行。本次試驗所得的12條 VP2基因序列均屬于G1群，與中國、日本和韓國毒株之間親緣性更近，這說明，在不同國家之間FPV的演化存在地理分離的現(xiàn)象，與翟志安[14]報道一致。

本試驗12條VP2基因序列與國內(nèi)外最近流行株的序列對比，關(guān)鍵的氨基酸位點鮮有突變，表明FPV VP2蛋白的抗原性和宿主范圍等在進(jìn)化過程中較少發(fā)生改變，與洪馬林等[21]報道一致；與意大利的Purevax merial vaccine疫苗株相比，第101位氨基酸發(fā)生突變，可能是導(dǎo)致免疫失敗的原因之一[11]。FPV和CPV 毒株的VP2蛋白關(guān)鍵氨基酸位點存在一定的突變，表明VP2蛋白在不同宿主上可能表現(xiàn)出功能差異性。與CPV相比，F(xiàn)PV在VP2基因的遺傳進(jìn)化上更為保守[19-20]。

由于FPV不斷進(jìn)化，對FPV抗原變異株的分子監(jiān)測尤為重要，不僅為FPV感染的防控提供一定的理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)，而且對研究細(xì)小病毒的生物學(xué)特性、新型疫苗的研發(fā)等具有重要意義。