響應(yīng)面法優(yōu)化雙黃連口服液醇沉物乳酸菌發(fā)酵工藝

王清龍，王坤麗，趙圣振，袁琦昱，湯法銀*

(1. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2. 河南炎黃生物工程有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453000)

2020年以來中國畜牧業(yè)步入“飼料端禁抗、養(yǎng)殖端限抗、產(chǎn)品端無抗”快速推進(jìn)期，中藥作為“替抗”的主力軍，也迎來了高質(zhì)量發(fā)展的大好時機(jī)[1]。但中藥屬于資源性產(chǎn)物，加上全球需求逐步增加和養(yǎng)殖成本限制，一定程度上制約著其在畜牧業(yè)上的應(yīng)用發(fā)展。而 “不與人藥爭資源”和“吃干榨凈”的系統(tǒng)研發(fā)思路[2]，為破除獸用中藥資源和價格瓶頸提供了可能。我國現(xiàn)行藥典和獸藥典中雙黃連口服液制法均采用了水提醇沉法[3-4]，其工業(yè)化生產(chǎn)過程會產(chǎn)生大量的絮凝廢棄沉淀物——雙黃連口服液醇沉物，其主要成分為大分子多糖、黏液質(zhì)、蛋白質(zhì)等，也包含部分次生代謝活性物如黃酮、生物堿等[5-7]，是潛在的獸用中藥開發(fā)資源。同時益生菌發(fā)酵中藥，可利用益生菌降解大分子物質(zhì)，產(chǎn)生小分子活性成分、代謝產(chǎn)物及活性酶等，因而成為“替抗”產(chǎn)品研發(fā)熱點(diǎn)[8]。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類能利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌總稱，屬于革蘭陽性菌，兼性厭氧，不產(chǎn)生芽胞。這類菌廣泛分布于自然界中，是人和動物常用益生菌，具有促進(jìn)消化吸收、維持機(jī)體腸道菌群平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能[9]。利用乳酸菌對中藥進(jìn)行發(fā)酵，能提高中藥的藥效，應(yīng)用于動物能提高動物生產(chǎn)性能和抗氧化能力，調(diào)節(jié)腸道菌群[10-12]?；诖耍驹囼?yàn)選用乳酸菌對雙黃連口服液醇沉物進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝制成發(fā)酵中藥制劑[13]，不僅能“變廢為寶”，推進(jìn)中藥制劑工業(yè)廢棄物的資源化利用，更拓寬了獸用中藥資源，為中獸醫(yī)藥“治未病”的養(yǎng)-調(diào)-防-治的健康養(yǎng)殖提供更多可用中藥產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 雙黃連口服液醇沉物干粉制備

雙黃連口服液醇沉物來自于河南某知名中藥制藥企業(yè)，取適量置 105 ℃烘箱中烘至干燥后粉碎，過4號篩即得(水分≤9.0%)。

1.2 乳酸菌種活化

乳酸菌菌種由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院發(fā)酵中藥實(shí)驗(yàn)室提供。將放于-20 ℃冰箱中乳酸菌甘油凍存管置室溫融化后，劃線接種于固體MRS培養(yǎng)基(北京澳博星生物技術(shù)有限公司)，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，再將其轉(zhuǎn)接至MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h后備用，并吸取菌液置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，確定菌種是否恢復(fù)活性。

1.3 雙黃連口服液醇沉物添加量的確定

分別按每組總質(zhì)量的10%、20%、30%準(zhǔn)確稱取雙黃連口服液醇沉物加入發(fā)酵瓶中，加水后混勻并滅菌，按總質(zhì)量6%接種乳酸菌，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，以活菌數(shù)為指標(biāo)選取最佳濃度，取平均值作為單因素試驗(yàn)所用底物濃度。

1.4 發(fā)酵液中活菌數(shù)的測定

采用平板活菌計數(shù)法測量其活菌數(shù)[14]。

1.5 單因素試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件篩選

以活菌數(shù)為指標(biāo)，以優(yōu)選的添加量、接種量6%、發(fā)酵溫度37 ℃和發(fā)酵時間48 h為基礎(chǔ)方案，按單因素試驗(yàn)分別研究接種量2%、4%、6%、8%，發(fā)酵時間12 h、24 h、36 h、48 h，發(fā)酵溫度27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃對乳酸菌發(fā)酵雙黃連口服液醇沉物結(jié)果的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件設(shè)計

參照單因素試驗(yàn)結(jié)果，以接種量(A)、發(fā)酵時間(B)和發(fā)酵溫度(C)3個因素為自變量，以發(fā)酵產(chǎn)物活菌數(shù)(Y)為響應(yīng)值，通過 Design-Expert 11.0軟件，采用 Box-Behnken設(shè)計法[15]，對雙黃連口服液醇沉物乳酸菌液態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，見表1。

表1 發(fā)酵工藝響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 雙黃連口服液醇沉物添加量的確定

試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，當(dāng)雙黃連口服液醇沉物添加量為20%時，接種量6%，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后活菌數(shù)平均值最大，為2.2×109CFU/mL，而添加量為10%和30%時活菌數(shù)均較低，因此確定單因素試驗(yàn)中所添加的雙黃連口服液醇沉物含量為20%。

圖1 醇沉物添加量對發(fā)酵結(jié)果的影響

2.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件

不同接種量、發(fā)酵時間和溫度對發(fā)酵效果的影響如圖2、圖3和圖4所示，3種因素對乳酸菌液體發(fā)酵雙黃連口服液醇沉物均具有影響，且接種量4%時活菌數(shù)最大值可達(dá)2.47×109CFU/mL，發(fā)酵時間24 h時活菌數(shù)最大值可達(dá)1.86×109CFU/mL，發(fā)酵溫度32 ℃時活菌數(shù)最大值可達(dá)1.95×109CFU/mL。因此單因素試驗(yàn)確定的最佳條件為接種量4%、發(fā)酵溫度32 ℃和發(fā)酵時間24 h。

圖2 不同接種量對發(fā)酵結(jié)果的影響

圖3 不同發(fā)酵時間對發(fā)酵結(jié)果的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析

采用響應(yīng)面法所得發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果見表2。利用Design-Expert 11.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行BBD分析，可以得到接種量(A)、發(fā)酵時間(B)和發(fā)酵溫度(C)對發(fā)酵終產(chǎn)物活菌數(shù)(Y)的響應(yīng)值回歸方程為：Y=306.80+25.25A+13.31B+7.81C-0.2500AB+1.25AC+1.38BC-135.09A2-37.46B2-28.96C2。

對該回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3數(shù)據(jù)可知，該二次回歸模型的F值為123.54，P<0.000 1，說明該回歸模型極顯著；失擬項P=0.897 8，說明該模型結(jié)果可靠。一次項中的接種量(A)、發(fā)酵時間(B)和二次項中的A2、B2、C2的P值均小于0.01，說明這幾項因素對于最終產(chǎn)物的活菌數(shù)影響極為顯著，且3個單因素的F值結(jié)果可知其影響順序?yàn)椋航臃N量(A)>發(fā)酵時間(B)>發(fā)酵溫度(C)，最佳發(fā)酵條件為：接種量4%、發(fā)酵時間24 h和發(fā)酵溫度32 ℃。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果

2.3.2 二次回歸模型分析

利用Design-Expert 11.0軟件對表3的二次回歸模型進(jìn)行分析，可得接種量(A)、發(fā)酵時間(B)和發(fā)酵溫度(C)3個因素交互影響發(fā)酵終產(chǎn)物活菌數(shù)的響應(yīng)曲面圖。

由圖5可知，接種量(A)和發(fā)酵時間(B)交互影響所得圖像的等高線趨近于橢圓形且橢圓度較大，其3D圖像坡度較陡，說明這2個因素的交互作用對發(fā)酵終產(chǎn)物的影響顯著。由圖6可知，接種量(A)和發(fā)酵溫度(C)交互影響的等高線為橢圓形，其3D圖像坡度陡峭，說明這2個因素的交互作用對發(fā)酵終產(chǎn)物的影響特別顯著。由圖7可知，發(fā)酵時間(B)和發(fā)酵溫度(C)的交互影響所得圖像的等高線更近似于圓形并且其3D圖像的坡度相較于前兩組緩和，等高線近乎圓形，足以見得這兩個因素交互作用的影響不如前兩組顯著，不過仍具有一定的影響。由圖5～7可知，發(fā)酵終產(chǎn)物的活菌數(shù)隨著接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度的逐漸遞增總體有著上升下降趨勢，說明存在發(fā)酵終產(chǎn)物活菌數(shù)的極值，且交互作用對其發(fā)酵結(jié)果影響最大的是接種量和發(fā)酵溫度。

圖7 發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度交互作用的響應(yīng)曲面

2.3.3 最佳發(fā)酵條件確定

從單因素試驗(yàn)結(jié)果表明最佳條件為接種量4%、發(fā)酵時間24 h和發(fā)酵溫度32 ℃時，說明極值點(diǎn)應(yīng)當(dāng)存在于附近。利用Design-Expert 11.0軟件可以求出發(fā)酵終產(chǎn)物活菌數(shù)的極值點(diǎn)，結(jié)果接種量4.188%、發(fā)酵時間26.165 h、發(fā)酵溫度32.710 ℃條件下，發(fā)酵終產(chǎn)物活菌數(shù)理論極值上可達(dá)到3.03×109CFU/mL?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)過程中條件與工藝限制，將最佳發(fā)酵條件修正為接種量4%、發(fā)酵時間26 h、發(fā)酵溫度32.7 ℃。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照優(yōu)化的最佳條件，在實(shí)驗(yàn)室采用10 L發(fā)酵罐進(jìn)行3次平行擴(kuò)大試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)酵終產(chǎn)物活菌數(shù)的平均值為2.98×109CFU/mL，與響應(yīng)面預(yù)測極值相近，證明該優(yōu)化條件切實(shí)可行。

3 討論

3.1 中藥提取制劑廢棄物開發(fā)利用

中藥提取后，藥渣中殘留30%的活性成分[16]。我國中藥制藥產(chǎn)業(yè)化過程中，每年產(chǎn)生固體、液體廢棄物及副產(chǎn)物達(dá)數(shù)億噸，造成中藥資源的嚴(yán)重浪費(fèi)，也對生態(tài)環(huán)境帶來巨大壓力?；诖?，段金廒等[2]提出 “吃干榨凈、物盡其用”的中藥資源循環(huán)利用原則，構(gòu)建了中藥資源全產(chǎn)業(yè)鏈廢棄物及副產(chǎn)物的四級分類體系，并提出藥用、飼料化、肥料化等多途徑資源化模式。秦夢等[17]在系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，提出中藥廢渣在畜禽飼料及添加劑生產(chǎn)等方面具有極大的開發(fā)應(yīng)用潛能，并呼吁相關(guān)部門加大中藥廢渣的綜合開發(fā)利用，以減少污染保護(hù)生態(tài)環(huán)境，同時實(shí)現(xiàn)中藥產(chǎn)業(yè)的良性循環(huán)發(fā)展。研究表明，中藥提取制劑工業(yè)廢棄物——醇沉物，含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)和部分免疫活性物質(zhì)，主要是植物多糖、蛋白質(zhì)及次級代謝產(chǎn)物[5，18]，具有綜合開發(fā)利用價值。植物多糖具有促生長、提高免疫力、抗氧化功能，同時作為益生元能調(diào)節(jié)腸道菌群和腸道組織形態(tài)[19-21]。湯法銀等[22]選用當(dāng)歸補(bǔ)血口服液制劑的廢棄醇沉物添加在雛雞日糧中，結(jié)果與對照組比較，添加醇沉物組的雛雞各方面生長指數(shù)及抗體效價均有顯著提高。張麗霞[23]研究發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根水提醇沉物干物質(zhì)中含有總糖 52.49%，蛋白質(zhì)13.19%，益生菌發(fā)酵后在肉雞飼糧中添加，可顯著提高肉雞平均日增重，降低料重比，同時增強(qiáng)免疫力。隨著研究的深入，水提醇沉法為主制備的多種中藥多糖被證實(shí)具有免疫增強(qiáng)等生物活性，并在畜牧業(yè)上得到廣泛應(yīng)用[24-25]，進(jìn)一步提示中藥提取制劑的醇沉物存在較大的開發(fā)潛力。

3.2 影響發(fā)酵的因素及條件優(yōu)化

益生菌發(fā)酵中藥與多種因素相關(guān)，發(fā)酵菌種及數(shù)量、發(fā)酵溫度、時間、濕度、氧氣等受環(huán)境影響較大[26-28]。本研究單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法回歸模型均表明，接種量對發(fā)酵結(jié)果影響顯著，但也并非越多越好，隨著接種量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物活菌總數(shù)反而逐漸下降，其原因可能是因?yàn)殡p黃連口服液醇沉物所提供的的營養(yǎng)物質(zhì)會被乳酸菌用來進(jìn)行呼吸和繁殖，當(dāng)菌種數(shù)量達(dá)到一定時就出現(xiàn)了飽和狀態(tài)，雙黃連口服液醇沉物所提供的營養(yǎng)物質(zhì)不足以供養(yǎng)如此數(shù)量的菌種，菌種的生長繁殖也會受到抑制，也就是菌種數(shù)量超出了底物所能提供的最大限度，不僅發(fā)酵結(jié)果不佳，還會造成一定程度上的浪費(fèi)。響應(yīng)面法回歸模型表明，接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對發(fā)酵終產(chǎn)物活菌總數(shù)的影響都極為顯著，且3個單因素的F值表明其對發(fā)酵終產(chǎn)物活菌數(shù)的影響順序?yàn)椋航臃N量(A)>發(fā)酵時間(B)>發(fā)酵溫度(C)。然而，利用Design-Expert 11.0軟件進(jìn)行二次回歸模型進(jìn)行分析可知：三因素交互作用對發(fā)酵結(jié)果影響最大的是接種量和發(fā)酵溫度，而發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度的交互作用基本不顯著；同時單因素試驗(yàn)優(yōu)化最佳條件和響應(yīng)面法計算極值條件相近，3次平行擴(kuò)大驗(yàn)證試驗(yàn)也表明優(yōu)化條件可行，因此在發(fā)酵條件優(yōu)化時要充分考慮發(fā)酵過程是多種因素互作結(jié)果，在科學(xué)設(shè)計基礎(chǔ)上應(yīng)充分考慮實(shí)際生產(chǎn)條件，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵工藝的效益最大化。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)表明，乳酸菌液態(tài)發(fā)酵雙黃連口服液醇沉物的最佳條件為：醇沉物添加量20%、接種量4%、發(fā)酵溫度32.7 ℃、發(fā)酵時長26 h。3次平行擴(kuò)大試驗(yàn)所得發(fā)酵終產(chǎn)物活菌數(shù)的平均值為2.98×109CFU/mL。在此條件下利用乳酸菌對雙黃連口服液醇沉物進(jìn)行發(fā)酵，制備發(fā)酵中藥制劑，不僅能變廢為寶，避免了中藥制劑工業(yè)廢棄殘渣對環(huán)境造成的污染，也為其合理開發(fā)應(yīng)用提供了新思路，更為畜牧業(yè)健康養(yǎng)殖提供了更多綠色、低廉、有效的中藥或飼料添加劑產(chǎn)品。