腹腔注射GnIH對(duì)瑤雞卵巢糖代謝的影響

韓東洋，劉澄澄，徐暢臨，張?chǎng)?，宋星星，張佳妮，沈冰茜，辛園園，張凌源，李珣

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/廣西壯族自治區(qū)獸用生物制品工程研究中心/廣西畜禽繁育與疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西高校動(dòng)物疫病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004)

大量研究證實(shí)雌性動(dòng)物的生殖功能與能量代謝息息相關(guān)，能量代謝的不同狀態(tài)可直接影響動(dòng)物的生殖活動(dòng)[1-2]。隨著神經(jīng)內(nèi)分泌研究的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)多種神經(jīng)肽不僅參與動(dòng)物的生殖活動(dòng)和能量代謝，而且作為能量代謝信號(hào)調(diào)控動(dòng)物的生殖功能[3-4]。2000年，Tsutsui等[5]在鵪鶉的下丘腦中發(fā)現(xiàn)了一種由12種氨基酸組成的神經(jīng)肽，命名為促性腺激素抑制激素(GnIH)。大量研究證實(shí)GnIH在下丘腦、垂體和性腺水平均可參與動(dòng)物的生殖調(diào)控[6]。有研究證明GnIH在卵巢水平參與動(dòng)物的生殖調(diào)控，尤其影響卵巢顆粒細(xì)胞的生理功能，但其具體調(diào)控機(jī)制尚未完全明確[7-9]。

隨著GnIH生理功能研究的深入，發(fā)現(xiàn)GnIH還參與攝食、應(yīng)激和能量代謝等多種生理活動(dòng)。2005年，Tachibana等[10]給雞側(cè)腦室注射GnIH后發(fā)現(xiàn)能夠顯著增加動(dòng)物的攝食量，推測(cè)GnIH可能是下丘腦中一種新型促食欲素。隨后，其他研究人員在羊、小鼠及獼猴上也得到相似的結(jié)論[11]。Benton等[12]研究發(fā)現(xiàn)GnIH促進(jìn)動(dòng)物攝食，并顯著升高脂肪中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)表達(dá)和甘油三酯(TGs)的含量，抑制睪丸中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8(GLUT8)和胰島素受體的表達(dá)，同時(shí)顯著降低血清中睪酮含量。因此我們推測(cè)GnIH可能是聯(lián)系動(dòng)物生殖與能量代謝的一種新型調(diào)控因子，并猜測(cè)GnIH可能通過(guò)調(diào)控卵泡的糖代謝影響卵巢的生殖功能。

本研究以廣西特色的瑤雞作為研究對(duì)象，研究GnIH對(duì)瑤雞卵巢葡萄糖攝入、糖酵解和三羧酸循環(huán)(TCA)過(guò)程的影響。期望通過(guò)本研究證實(shí)GnIH是一種新型的能量代謝調(diào)控因子，從而進(jìn)一步完善GnIH生理功能，并為探究能量代謝異常導(dǎo)致卵巢功能障礙提供新的突破口。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

南丹瑤雞10只，雌性，180日齡，體重(1 700±100)g，購(gòu)自南寧禽苗市場(chǎng)?，庪u適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組，其中對(duì)照組注射0.9%生理鹽水，每次0.1 mL/只；GnIH組注射24.54 μg/kg GnIH，每次0.1 mL/只，每天注射2次(7：00和19：00)，連續(xù)2周。

1.2 主要儀器及試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；葡萄糖(GLU)試劑盒、丙酮酸測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

GnIH購(gòu)自生工生物工程(上海)科技有限公司；糖代謝相關(guān)基因葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3(GLUT3)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸果糖激酶(PFK)、乳酸脫氫酶A(LDHA)、乳酸脫氫酶B(LDHB)和琥珀酸脫氫酶B(SDHB)引物均由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計(jì)及合成，詳見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.3 采食模式監(jiān)測(cè)

瑤雞在恒定光照(12 h光照、12 h黑暗)和溫度(25±2)℃的條件下飼養(yǎng)，自由采食和飲水。分別記錄2組每天光照和黑暗條件下的采食量，每2 d記錄注射后1、2、4和8 h采食量。

1.4 臟器指數(shù)檢測(cè)

最后一次注射15 min后，將瑤雞頸動(dòng)脈放血處死，取出卵巢并稱(chēng)重，計(jì)算卵體比(卵巢重量/體重)。

1.5 葡萄糖和丙酮酸含量檢測(cè)

收集卵巢，稱(chēng)重后于液氮速凍，儲(chǔ)存在-80 ℃?zhèn)溆?。將卵巢組織研磨，按照測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作測(cè)定葡萄糖和丙酮酸的含量。

1.6 熒光定量RT-PCR檢測(cè)基因mRNA表達(dá)水平

按照TRIzol法提取各組卵泡總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用熒光定量RT-PCR的方法檢測(cè)mRNA的表達(dá)情況。qPCR反應(yīng)體系為20 μL，其中10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR 酶溶液、8 μL ddH2O、0.5 μL Primer 1、0.5 μL Primer 2和1 μL Template cDNA。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt計(jì)算所檢測(cè)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 GnIH對(duì)瑤雞表觀指標(biāo)的影響

2.1.1 GnIH對(duì)瑤雞采食量的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，腹腔注射GnIH后瑤雞的采食量增多。其中，注射GnIH后1、2、4、8 h瑤雞的采食量均顯著增加(P<0.05)，提示腹腔注射GnIH可引起瑤雞采食量的增加。

注：*表示P<0.05。下同。

由圖2所示，與對(duì)照組相比，腹腔注射GnIH后瑤雞的夜間平均采食量極顯著升高(P<0.01)。

注：**表示P<0.01。下同。

2.1.2 GnIH對(duì)瑤雞卵巢臟器指數(shù)的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，腹腔注射GnIH后瑤雞的卵體比顯著降低(P<0.05)。

2.2 GnIH對(duì)卵巢糖代謝的影響

2.2.1 GnIH對(duì)瑤雞卵巢組織葡萄糖攝入的影響

由圖4可知，腹腔注射GnIH后，瑤雞GLUT1和GLUT3基因mRNA的表達(dá)量極顯著上升(P<0.01)，但卵巢組織中葡萄糖含量沒(méi)有顯著差異。

圖4 GnIH對(duì)卵巢GLUT1(A)、GLUT3(B)表達(dá)量和葡萄糖(C)含量的影響

2.2.2 GnIH對(duì)瑤雞卵巢組織葡萄糖酵解的影響

由圖5可知，腹腔注射GnIH后可使卵巢中糖酵解關(guān)鍵限速酶PK和PFK基因mRNA的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，卵巢組織中LDHA基因mRNA的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，而LDHB基因mRNA的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。

圖5 GnIH對(duì)糖酵解相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

2.2.3 GnIH對(duì)瑤雞卵巢組織線粒體能量代謝的影響

由圖6可知，腹腔注射GnIH后，瑤雞卵巢組織中線粒體能量代謝的底物丙酮酸含量顯著上升(P<0.05)，而線粒體能量代謝和TCA循環(huán)中關(guān)鍵酶SDHB的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。

圖6 GnIH對(duì)瑤雞卵巢組織線粒體能量代謝的影響

3 討論

近年研究證明，GnIH可以影響機(jī)體的采食并可能參與能量代謝[13-14]。Tachibana等[10]首次報(bào)道了GnIH作為一種新的促食欲肽，能促進(jìn)雞的采食。McConn等[15]通過(guò)腦室內(nèi)注射(ICV)給藥也觀察到GnIH可增加不同品系雞食物攝入的結(jié)果。先前研究證明慢性腹腔注射GnIH會(huì)導(dǎo)致小鼠發(fā)生胰島素抵抗，采食量增加，進(jìn)而引起小鼠糖代謝紊亂[16 ]。以上研究與本試驗(yàn)的結(jié)果一致，腹腔注射GnIH可導(dǎo)致瑤雞的采食量增加，猜測(cè)食物攝入異常能夠引起能量代謝的紊亂。糖代謝的改變對(duì)卵巢的發(fā)育產(chǎn)生有害影響[17]。GnIH與母雞的卵巢退化有關(guān)[18-19]，本研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射GnIH會(huì)導(dǎo)致瑤雞卵巢臟器指數(shù)顯著降低，證實(shí)了該結(jié)論。

卵巢發(fā)育所需的能量主要來(lái)源于TCA循環(huán)[20]。丙酮酸含量升高，表明卵巢顆粒細(xì)胞的代謝模式發(fā)生了變化[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射GnIH會(huì)導(dǎo)致丙酮酸含量升高，TCA循環(huán)關(guān)鍵酶(SDHB)的表達(dá)量顯著下降。Mao等[22]在線粒體功能損傷的卵巢顆粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)葡萄糖消耗明顯增高，糖酵解活性增強(qiáng)。糖酵解和氧化磷酸化是細(xì)胞葡萄糖代謝的主要途徑和主要的能量來(lái)源。然而，在卵母細(xì)胞中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和磷酸果糖激酶的表達(dá)水平極低，表明卵母細(xì)胞很少直接消耗葡萄糖作為代謝底物[23]。本研究結(jié)果表明，腹腔注射GnIH可導(dǎo)致卵巢內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1、GLUT3和糖酵解相關(guān)酶PK、PFK、LDHA、LDHB的表達(dá)增加，提示腹腔注射GnIH可引起TCA循環(huán)異常并增加卵巢糖酵解的活性。

4 結(jié)論

本研究探討了腹腔注射GnIH對(duì)瑤雞采食和卵巢糖代謝的影響，結(jié)果提示腹腔注射GnIH可增加瑤雞的采食量，導(dǎo)致瑤雞卵巢葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的加快，促進(jìn)糖酵解的發(fā)生，TCA循環(huán)異常和丙酮酸的積累，引起卵巢糖代謝紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致卵巢發(fā)育異常。