大分割電離輻射對(duì)鼻咽癌細(xì)胞共培養(yǎng)后的樹(shù)突狀細(xì)胞成熟狀態(tài)的影響*

龍金華, 曾憲琳, 金仙槐

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 頭頸腫瘤科, 貴州 貴陽(yáng) 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550004)

放療是一種破壞腫瘤細(xì)胞DNA、抑制腫瘤細(xì)胞增殖的治療方法,是鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)主要的臨床治療手段[1]。研究發(fā)現(xiàn),放療劑量與腫瘤的治療效果密切相關(guān)[2],大分割放療可打破機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫耐受,啟動(dòng)特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答[3],但其具體機(jī)制不清。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)作為一種特殊的抗原提呈細(xì)胞,具有強(qiáng)大的抗原攝取和提呈能力,發(fā)揮著連接先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的作用[4]。DCs獲取腫瘤抗原后,從未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(immature dendritic cells, imDCs)向成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(mature dendritic cells, mDCs)分化,并逐漸上調(diào)白細(xì)胞分化抗原80(cluster of differentiation 80, CD80)、CD83、CD86、人白細(xì)胞抗原DR(human leukocyte antigen DR, HLA-DR)以及CC基序趨化因子受體7(C-C motif chemokine receptor 7, CCR7)等分子表達(dá)[5]。有研究發(fā)現(xiàn),DCs亞群和浸潤(rùn)數(shù)量與NPC患者的生存呈顯著相關(guān)[6-7],提示DCs介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答在NPC治療中可能發(fā)揮著重要作用[8-10]。目前,NPC放療分割模式仍采用常規(guī)劑量(1.8～2.0 Gy)[11-12],大分割放射(>2.0 Gy)對(duì)NPC誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答類型尚不清楚。因此,本文研究經(jīng)大分割(4 Gy和18 Gy)電離輻射照射的NPC細(xì)胞對(duì)imDCs的免疫表型分子、遷移能力以及環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-腺苷合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase, cGAS)和干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes,STING)表達(dá)的影響,以期找到放療過(guò)程中DCs介導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的啟動(dòng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源、主要試劑與儀器

人5-8F NPC細(xì)胞株購(gòu)于富衡生物,RPMI-1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購(gòu)于Gibco,重組人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重組人白介素4(rhIL-4)細(xì)胞因子均購(gòu)于PeproTech,胎牛血清購(gòu)于Gemini Bio,HLA-DR、CD11c、CD80、CD83、CD86以及CCR7的特異性流式抗體均購(gòu)于Biolegend,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、cGAS及STING的特異性抗體均購(gòu)于Abcam,直線加速器購(gòu)于醫(yī)科達(dá),核磁共振掃描儀購(gòu)于西門子,流式細(xì)胞儀購(gòu)于BD。

1.2 研究方法

1.2.1研究對(duì)象 選取2021年1月—2023年1月收治的134例NPC患者為NPC組,納入標(biāo)準(zhǔn):(1)病理學(xué)確診的 NPC 患者,按 第 8 版美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)/國(guó)際抗癌聯(lián)盟(American Joint Committee on Cancer/ Union for International Cancer Control, AJCC/UICC)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(tumor node metastasis, TNM) 分期標(biāo)準(zhǔn)分期(Ⅰ—Ⅵb);(2)治療前簽署放療知情同意書(shū),無(wú)放療禁忌癥;(3)既往無(wú)頭頸部放射治療史;(4)預(yù)計(jì)生存期 6 個(gè)月以上,卡諾夫斯基的功能狀態(tài)(Karnofsky performance scale, KPS)評(píng)分≥70分;(5)患者對(duì)接受治療和隨訪有良好的依從性。排除標(biāo)準(zhǔn):有嚴(yán)重感染或出血傾向者、合并嚴(yán)重且未控制的內(nèi)科疾病、出現(xiàn)主要器官功能衰竭。健康對(duì)照組為153名健康志愿者,均排除鼻咽部相關(guān)疾病,無(wú)心肺等臟器疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批注號(hào)2020162),所有志愿者及患者簽署知情同意書(shū)。

1.2.2鼻咽部核磁共振檢查和流式外周血DCs數(shù)量分群 所有患者均按照ICRU 62號(hào)規(guī)范勾畫(huà)靶區(qū),制定三維適形調(diào)強(qiáng)放療治療計(jì)劃,射線能量為 6 Mv X線,靶區(qū)的劑量為PGTVnx 72.6 Gy/33 f。放療結(jié)束后1周,對(duì)患者行鼻咽部核磁共振檢查。外周血流式細(xì)胞檢測(cè)外周血DCs數(shù)量分群[髓系DCs(CD11c+myeloid DCs,MDCs)和漿系DCs(CD123+plasmacytoid DCs,PDCs)]。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和放射處理 5-8F人NPC細(xì)胞:用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至80%～90%,進(jìn)行傳代培養(yǎng)或使用輻照儀進(jìn)行放射處理,放療劑量為4 Gy和18 Gy。imDCs的分離培養(yǎng):密度梯度離心法從健康人外周血中分離單核細(xì)胞,用含10% FBS、150 μg/L rhGM-CSF和100 μg/L rhIL-4的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d,將其誘導(dǎo)分化為imDCs。

1.2.4NPC細(xì)胞與imDCs共培養(yǎng) 5-8F NPC細(xì)胞照射后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h,收集其培養(yǎng)上清,制成條件培養(yǎng)基。收集imDCs,用含20% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL,每孔加入細(xì)胞懸液1 mL和條件培養(yǎng)基1 mL (imDCs+4 Gy、imDCs+18 Gy)設(shè)為imDCs+4 Gy組和imDCs+18 Gy組,陰性對(duì)照(imDCs組)為細(xì)胞懸液1 mL和PBS 1 mL ,陽(yáng)性對(duì)照(mDCs組)為細(xì)胞懸液1 mL和1mL含100 ng/mL脂多糖的完全培養(yǎng)基,放入37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.5流式檢測(cè)DCs免疫表型分子的表達(dá) 收集共培養(yǎng)后的DCs,加入4%多聚甲醛固定10 min,用PBS洗滌2次,棄上清。加入相應(yīng)抗體混勻后,室溫避光孵育20 min。孵育結(jié)束后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs表面分子HLA-DR、CD11c、CD80、CD83、CD86及CCR7的表達(dá)情況。

1.2.6DCs遷移能力的檢測(cè) 收集共培養(yǎng)后的DCs,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。取24孔板,在Transwell下室加入完全培養(yǎng)基0.6 mL,上室加入0.2 mL細(xì)胞懸液,放入37 ℃, 5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。遷移結(jié)束后,對(duì)遷移至下室的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算遷移率。

1.2.7蛋白印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)cGAS及STING蛋白表達(dá) 收集共培養(yǎng)后的DCs,提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度后,取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜和封閉。TBST洗滌3次,加入GAPDH、cGAS及STING的特異性抗體,4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗,室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,用ECL試劑盒檢測(cè)蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 放療對(duì)NPC患者DCs亞群的影響

核磁共振影像顯示(圖1),放射治療前,NPC組患者腫瘤沿鼻咽壁凸向鼻咽腔,侵及周圍肌肉組織及骨質(zhì)結(jié)構(gòu),核磁共振增強(qiáng)掃描顯示有明顯強(qiáng)化、信號(hào)不均。放射治療后,鼻咽黏膜稍增厚,腫瘤明顯退縮,增強(qiáng)后周圍組織強(qiáng)化減弱。外周血流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表1、表2),與健康對(duì)照組相比,NPC患者外周血中MDCs和PDCs顯著減少(t=-4.041,t=-5.674;P<0.001);放射治療后,NPC患者外周血中MDCs的數(shù)量明顯減少(P<0.001),但PDCs的數(shù)量略有增加,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 兩組被檢者血液中不同DCs亞群比例

表2 治療前與放療結(jié)束后NPC患者外周血中DCs亞群的數(shù)量變化

圖1 放療前后NPC患者鼻咽部腫瘤的核磁共振影像

2.2 大分割電離輻射照射后的NPC細(xì)胞促進(jìn)imDCs成熟

結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2),與imDCs組比較,imDCs+4 Gy組以及imDCs+18 Gy組中imDCs的免疫表型分子HLA-DR、CD80、CD83、CD86及CCR7的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001),表明imDCs向mDCs分化;Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3),DCs遷移能力隨著電離輻射劑量的增加而增強(qiáng)(P<0.05)。

注：A、B分別為HLA-DR、CD11c、CD80、CD83、CD86及CCR7的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果及對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;(1)與imDCs組比較,P<0.05;(2)與mDCs組比較,P<0.05;(3)與imDCs+4 Gy組比較,P<0.05。

注：(1)與imDCs組比較,P<0.05;(2)與imDCs+4 Gy組比較,P<0.05。

2.3 大分割電離輻射對(duì)NPC細(xì)胞與imDCs共培養(yǎng)后cGAS-STING信號(hào)通路的影響

Western blot的結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖4),與imDCs組相比,imDCs+4 Gy組和imDCs+18 Gy組能上調(diào)共培養(yǎng)的imDCs中cGAS和STING蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)。

注：A、B分別為cGAS和STING蛋白的Western blot結(jié)果及對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;(1)與imDCs組比較,P<0.05。

3 討論

NPC是由鼻咽粘膜內(nèi)膜引起的上皮癌,具有較好的放療敏感性。放療后,非轉(zhuǎn)移性NPC患者的5年生存率可達(dá)到67%[13]。本研究發(fā)現(xiàn),放療后NPC患者腫瘤明顯縮小,提示NPC患者對(duì)放療敏感,這與Sham等[14]的研究結(jié)果一致?，F(xiàn)已知道,電離輻射不僅可以殺傷腫瘤細(xì)胞,還可以在一定條件下將免疫抑制的腫瘤微環(huán)境轉(zhuǎn)化為免疫原性腫瘤微環(huán)境[15],促進(jìn)腫瘤抗原提呈和促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的分泌,啟動(dòng)抗腫瘤免疫應(yīng)答[11-12,16]。DCs作為一種特殊的抗原提呈細(xì)胞[4],在NPC治療中發(fā)揮著重要作用[8-10]。有研究表明,不同的DCs亞群和DCs浸潤(rùn)數(shù)量與NPC患者的生存顯著相關(guān)[6-7]。DCs中cGAS-STING通路的激活可促進(jìn)imDCs向mDCs分化[17]。本研究發(fā)現(xiàn),與健康人相比,NPC患者血漿中MDCs和PDCs的數(shù)量顯著減少,說(shuō)明NPC患者的免疫功能受到損害。放療后,NPC患者外周血中MDCs的數(shù)量減少,PDCs的數(shù)量略有增多,說(shuō)明NPC患者的免疫系統(tǒng)正逐步恢復(fù),放療可一定程度改善NPC患者的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境。

有研究發(fā)現(xiàn),電離輻射不僅能激活DCs中NF-κB信號(hào)通路,還能增強(qiáng)DCs的遷移以及對(duì)白細(xì)胞介素-12(IL-12)的分泌[3, 18],且大分割電離輻射照射后的DCs上調(diào)CD40、CD80、CD86及CCR7等免疫表型分子的表達(dá)[19]。本研究將imDCs與經(jīng)大分割電離輻射照射的NPC細(xì)胞共培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)imDCs的免疫表型分子HLA-DR、CD80、CD83、CD86以及CCR7的表達(dá)顯著上調(diào),且其遷移能力隨著電離輻射分割的增加而增強(qiáng),表明imDCs向mDCs分化,可能有利于腫瘤抗原的提呈和特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答的啟動(dòng)。

cGAS是細(xì)胞主要的DNA感受器,能夠識(shí)別病原體的雙鏈DNA后上調(diào)STING信號(hào)通路,誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的表達(dá),啟動(dòng)抗原特異性的T細(xì)胞應(yīng)答[1, 5]。本研究發(fā)現(xiàn),與imDCs組相比,與經(jīng)18 Gy電離輻射照射后的NPC細(xì)胞共培養(yǎng)后,imDCs的cGAS和STING表達(dá)水平顯著上調(diào),意味著cGAS-STING信號(hào)通路的啟動(dòng)可能與大分割電離輻射破壞了更多的NPC細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)有關(guān)。

綜上所述,大分割電離輻射放療除了能夠直接殺死NPC細(xì)胞外,還可通過(guò)cGAS-STING信號(hào)通路誘導(dǎo)imDCs向mDCs分化,進(jìn)而啟動(dòng)特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答,這對(duì)深入理解NPC的臨床治療模式具有重要意義。