阿司匹林對慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道平滑肌細胞增殖和凋亡的影響及機制*

李曉華, 王慧敏, 溫霞

(1.赤峰市醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 內(nèi)蒙古 赤峰 024000; 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 急診科, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017)

慢性阻塞性肺疾病( chronic obstructive pulmonary disease,COPD) 主要是由肺部慢性炎癥導(dǎo)致支氣管與肺泡受損使肺功能喪失,嚴重的患者最終發(fā)生心肺衰竭或死亡[1]。我國COPD的患病率每年均呈現(xiàn)增加的趨勢[2]。COPD已經(jīng)逐漸成為全球第三大死因[3],其發(fā)病機制與慢性炎癥、氧化應(yīng)激等有關(guān),臨床常用的藥物主要有支氣管擴張劑、抗生素類以及糖皮質(zhì)激素類藥物等[4]。阿司匹林(Aspirin)作為環(huán)氧化酶抑制劑,可以在體內(nèi)發(fā)揮抗血小板聚集、改善凝血功能等作用[5]。最近的一項前瞻性隊列研究結(jié)果顯示,抗血小板治療與COPD患者的1年死亡率較低相關(guān)[6],并且在一項回顧性分析研究中,阿司匹林能夠顯著降低急性加重的COPD患者的院內(nèi)死亡率及有創(chuàng)通氣的使用率,并縮短住院時間[7]。COPD患者每日使用阿司匹林可降低病情的惡化率,減少呼吸困難的發(fā)生率并改善生活質(zhì)量[8]。在作用機制上,阿司匹林可以通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因B淋巴細胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)及Bcl-2 關(guān)聯(lián)的X 蛋白(BCL2-Associated X, Bax)的表達進而影響細胞的凋亡[9]。但阿司匹林對COPD的作用機制是否與其凋亡調(diào)控作用有關(guān),仍需進一步研究。本研究將針對COPD大鼠,探討阿司匹林的對其作用機制是否與氣道平滑肌細胞增殖和凋亡過程有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 清潔級的SD大鼠30只

1.1.2試劑與儀器 水合氯醛、阿司匹林購于Sigma公司,青霉素、青霉素-鏈霉素、PBS、蘇木素染液、伊紅染液、碘化丙啶 (PI) 及(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購于碧云天生物,香煙購于紅塔煙草集團公司,胎牛血清(fatal bovine serum,FBS) 購于 Gibco公司,中性樹脂購于索萊寶公司,山羊抗鼠或山羊抗兔抗體購于武漢三鷹公司;二氧化碳培養(yǎng)箱購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司,培養(yǎng)瓶/板購于無錫耐思生命科技股份有限公司,Tanon 5200 全自動化學(xué)及發(fā)光圖像分析系統(tǒng)熒光顯微成像系統(tǒng)購于德國徠卡。

1.2 研究方法

1.2.1動物實驗 (1)模型制備與分組 清潔級SD大鼠30只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機取10只作為對照組,其余20只建立COPD大鼠模型。20只大鼠禁食但不禁水24 h后,腹腔注射10%水合氯醛,以0.003 5 mL/g的劑量以達到麻醉的效果,待大鼠進入深度麻醉狀態(tài)后,固定大鼠于潔凈的操作臺上,頸部去毛暴露皮膚,以碘伏擦拭消毒,依次切開表皮、淺筋膜、深筋膜直至暴露氣管,應(yīng)用 1 mL 注射器插入氣管并注射200 μL(1 g/L)脂多糖,抬高頭位并輕輕按揉大鼠頸部以加速擴散脂多糖,待脂多糖吸收后逐層縫合筋膜、皮膚,消毒并注射50 000 U的青霉素防止感染,大鼠呼吸、心率平穩(wěn)后下臺放入籠內(nèi)[10]。接下來的2 d處理組大鼠每天均注射50 000 U的青霉素,在術(shù)后第9天將大鼠至于煙熏密閉箱中。每5只大鼠置于一個煙熏箱,每日點燃香煙10支,保持大鼠處于煙熏狀態(tài),每隔20 min晃動煙熏箱一次以防止抱團,連續(xù)煙熏15 d。煙熏結(jié)束后造模大鼠再次進行頸部手術(shù)以給與200 μL脂多糖,并于第2次術(shù)后第9天繼續(xù)煙熏15 d。模型構(gòu)建成功后,取10只模型組大鼠設(shè)為阿司匹林組,每天給與100 mg/kg的阿司匹林灌胃,連續(xù)灌胃30 d;對照組與模型組每天給與等量的生理鹽水灌胃。(2)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining , HE) 染色法檢測大鼠肺組織改變 取灌胃結(jié)束時3組大鼠的肺部組織固定后制備石蠟切片。切片經(jīng)高溫、二甲苯、無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇脫蠟后,用蘇木素染液染色2 min,快速將切片置入蒸餾水中終止染色。以1%鹽酸浸泡切片30 s后蒸餾水中蕩洗切片,用1%氨水浸泡切片30 s使藍色復(fù)染后洗滌切片。用伊紅染液浸泡切片2 min,以中性樹脂封片后鏡下觀察。(3)Western blot實驗檢測大鼠氣道平滑肌組織相關(guān)蛋白的表達提取灌胃結(jié)束時3組大鼠肺組織氣道平滑肌組織內(nèi)總蛋白。蛋白樣品在對鈉十二烷基的硫酸鹽-聚丙烯酰胺凝膠 (dodecyl sulfate, sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)中電泳以分離;在恒流條件下將膠中蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯 (PVDF)膜, 5%牛奶封閉2 h。在4 ℃條件下,孵育一抗過夜。以5%牛奶配制辣根過氧化物酶標記二抗,37 ℃孵育1 h,顯影并拍照。

1.2.2細胞實驗 (1)大鼠氣道平滑肌原代細胞(airway smooth muscle cells, ASMCs)的制備 在模型構(gòu)建成功后,取對照組、模型組大鼠麻醉處死后置于75%酒精中消毒并迅速提取氣管、支氣管段組織放入含有100 000 U/L青霉素-鏈霉素的PBS溶液中清洗數(shù)遍去除血污,并盡量去除結(jié)締、上皮、軟骨等組織。將剪碎的平滑肌組織用膠原酶消化至溶液渾濁。以400目篩網(wǎng)過濾消化液,收集溶液并終止消化,離心棄上清,加入10% FBS的改良Eagle/F-12培養(yǎng)基 (DMEM/F-12)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。每隔2～3 d換液或傳代。用小鼠平滑肌α-肌動蛋白進行細胞免疫化學(xué)染色鑒定,>97%的細胞均呈陽性則為ASMCs。(2)MTT實驗檢測ASMCs的增殖能力取對照組和模型組ASMCs種植于96孔板中,使其細胞濃度達到3 000個/孔,對照組種于1列孔,模型組種2列孔,取模型組中的1列給予終濃度為5 mmol/L的阿司匹林作為阿司匹林組,對照組與另一列模型組給與等量的培養(yǎng)基,均培養(yǎng)24 h,每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出96孔板避光去上清,每孔加入150的二甲基亞砜溶解,于490 nm的波長下檢測吸光度值。(3)Western blot實驗檢測ASMCs內(nèi)相關(guān)蛋白的表達 待阿司匹林處理ASMCs結(jié)束后,提取3組細胞的總蛋白。蛋白樣品在SDS-PAGE凝膠中電泳,在恒流條件下將膠中蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用5%牛奶封閉2 h。在4 ℃條件下,孵育一抗過夜。以5%牛奶配制辣根過氧化物酶標記二抗,37 ℃孵育1 h;顯影并拍照。(4)流式細胞術(shù)檢測凋亡 待阿司匹林處理ASMCs結(jié)束后,收集3組細胞,洗滌后避光加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexinⅤ-fluorescein isothiocyanate,AnnexinV-FITC)和PI,于流式細胞儀中檢測凋亡細胞比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 阿司匹林對大鼠肺部的影響

如圖1所示,對照組大鼠肺部未見明顯變化;模型組大鼠可見肺泡腔擴大后形成肺大泡,并且管壁出現(xiàn)明顯的增厚現(xiàn)象,管壁周圍有炎性細胞浸潤;阿司匹林組大鼠管壁相對于模型組變薄,炎癥細胞浸潤現(xiàn)象減少,肺泡腔擴大融合現(xiàn)象改善,說明阿司匹林對肺部組織具有較好的保護作用。

對照組 模型組 阿司匹林組

2.2 阿司匹林對氣道平滑肌凋亡的影響

從圖2可以看出,Bax與Bcl-2蛋白均為凋亡標志蛋白,當(dāng)?shù)蛲鲈龆鄷r,Bax表達增高而Bcl-2降低,模型組大鼠凋亡較對照組較少,經(jīng)阿司匹林治療后,阿司匹林大鼠凋亡比例較模型組升高 (P<0.05)。

注：A、B為Western blot電泳結(jié)果及對應(yīng)的統(tǒng)計結(jié)果;(1)與對照組相比,P<0.05;(2)與模型組相比,P<0.05。

2.3 阿司匹林對ASMCs增殖的影響

MTT結(jié)果顯示(圖3),模型組ASMCs細胞增值活力高于對照組,而模型組ASMCs細胞經(jīng)阿司匹林處理后增殖活力降低(P<0.05)。Western blot實驗檢測抗增殖細胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表達,結(jié)果顯示,模型組ASMCs PCNA蛋白表達水平高于對照組(P<0.05),但經(jīng)阿司匹林治療后其表達量下調(diào)(P<0.05),表明阿司匹林抑制了模型組ASMCs的增殖能力(圖4)。表明阿司匹林可以抑制COPD大鼠ASMCs的增殖能力。

注：A、B為Western blot 電泳結(jié)果及對應(yīng)的統(tǒng)計結(jié)果;(1)與對照組相比,P<0.05;(2)與模型組相比,P<0.05。

2.4 阿司匹林對ASMCs凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測ASMCs凋亡比例,對照組、模型組、阿司匹林組ASMCs凋亡比例分別為13.47%、3.29%、6.70%(圖5),模型組凋亡細胞比例低于對照組(P<0.05),經(jīng)阿司匹林治療后凋亡細胞增多(P<0.05);Western blot實驗檢測Bax、Bcl-2蛋白表達的變化,結(jié)果顯示,模型組ASMCs Bcl-2/Bax比值高于對照組(P<0.05),經(jīng)阿司匹林治療后,Bcl-2/Bax比值下調(diào)(P<0.05)(圖6)。表明阿司匹林可以誘導(dǎo)COPD大鼠ASMCs凋亡。

對照組 模型組 阿司匹林組

注：A、B為Western blot 電泳結(jié)果及對應(yīng)的統(tǒng)計結(jié)果;(1)與對照組相比,P<0.05;(2)與模型組相比,P<0.05。

3 討論

COPD是以持續(xù)氣流受限為主要特征的疾病,患者通常存在不同程度的肺功能下降和氣道損傷導(dǎo)致氣道的清除力下降從而使防御機制下降[11]。目前治療主要是以延緩病情進展、緩解臨床癥狀為主,部分治療藥物停藥后病情容易反彈[12]。COPD的影響因素與機制主要有炎癥、氧化應(yīng)激、細胞凋亡、營養(yǎng)不良及氣溫變化等,氣道重塑是其主要的病理特征[13-14]。氣道重塑時所發(fā)生的結(jié)構(gòu)性改變是由于氣道反復(fù)損傷與修復(fù)所致,主要以管壁變厚、平滑肌增生等為主要特征,是COPD病程發(fā)展的關(guān)鍵因素[15-16]。人支氣管平滑肌細胞(human bronchial smooth muscle cells, HBSMC)的研究表明,COPD相關(guān)LncRNA 1 (chronic obstructive pulmonary disease associated lncRNA 1, lncRNA COPDA1)上調(diào)可以增加HBSMCs中鈣離子的轉(zhuǎn)運,從而促進平滑肌細胞的增殖以及氣道重塑,參與COPD的發(fā)展[17]。徐賢華等[18]發(fā)現(xiàn),鈣激活鉀通道(Kca通道)的開放劑脫氫表雄甾酮 (Dehydroepiandrosterone, DHEA)干預(yù)能使COPD大鼠氣道平滑肌細胞Kca通道激活,在COPD防治中起著一定的作用。有關(guān)大鼠氣道平滑肌細胞研究發(fā)現(xiàn),細胞外基質(zhì)蛋白通過激活PI3K/AKT信號通路,能促進COPD大鼠模型中ASMCs的增殖、遷移和黏附能力[19]。在本研究中,體內(nèi)和體外結(jié)果均顯示COPD大鼠氣道平滑肌細胞的增殖活力提高,凋亡比例下降,表明COPD的發(fā)展與氣道平滑肌細胞的異常增殖有關(guān)。

阿司匹林又名乙酰水楊酸,對發(fā)熱、疼痛、炎癥等癥狀有效[20-21]。張瀟瀟等[22]發(fā)現(xiàn),大鼠急性心肌缺血損傷的模型中,阿司匹林能顯著降低血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)以及內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1)的表達水平,并且使血清生化指標如血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸激酶同功酶(creatine kinase isoenzyme, CK-MB)和心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin I, cTnⅠ)等降低,抑制心肌組織RhoA/ROCK信號通路活化,達到減輕急性心肌缺血損傷大鼠的炎性反應(yīng)以及心肌損傷程度的目的。阿司匹林作為常用的抑制血小板的藥物,對降低心、腦血管等的發(fā)病及死亡率具有重要作用[23]。阿司匹林能夠通過抑制前列腺素的合成從而阻斷血小板聚集以降低血液的高凝狀態(tài)[24]。研究表明,阿司匹林可以降低血液的黏稠度并抑制炎癥反應(yīng)和炎性因子的形成,從而抑制氧化應(yīng)激達到保護肺血管、改善肺功能的作用[25]。在本研究中,阿司匹林可以抑制COPD大鼠氣道平滑肌細胞的增殖能力,并誘導(dǎo)細胞凋亡,其誘導(dǎo)的凋亡與Bax和Bcl-2有關(guān)。

綜上所述,本研究主要發(fā)現(xiàn)了阿司匹林可以抑制COPD大鼠氣道平滑肌的增殖能力并誘導(dǎo)細胞凋亡,進而改善氣道重塑以延緩COPD的病程,為COPD的治療提供可參考的方向。