脂質(zhì)納米粒載體共遞送抗原和雷西莫特佐劑對(duì)黑色素瘤小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答及瘤體生長(zhǎng)的影響*

金育, 羅佳, 何春艷, 羅忠瑞, 張玉芳, 劉野

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 & 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所, 云南 昆明 650118)

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物和細(xì)胞來(lái)源 6～8周齡C57BL/6雌性小鼠30只,體質(zhì)量18～22 g,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)條件下飼養(yǎng),定期更換墊料、添加食物與飲用水,所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(DWSP202203032);小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10-OVA來(lái)自國(guó)家納米科學(xué)中心。

1.1.2主要試劑和儀器 Liposome Kit(美國(guó)Sigma-Aldrich公司),Zombie NIRIM Fixable Viability Kit和流式染色抗體(美國(guó)Biolegend公司),Cytofix/Cytoperm固定破膜試劑(美國(guó)BectonDickinson公司),腫瘤疫苗多肽(氨基酸序列為SMLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKLTEWTS;合肥國(guó)肽生物有限公司),磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)、改良Eagle(Dulbecco's modified Eagle medium,DMEM)高糖培養(yǎng)基、雙抗、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS;美國(guó)Gibco公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)板(江蘇求精新材料集團(tuán)),70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)(中國(guó)Biosharp公司),水平離心機(jī)和流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司),CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司),T75培養(yǎng)瓶(無(wú)錫耐思生物科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠黑色素瘤B16F10-OVA細(xì)胞于含有10% FBS,105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中,37 ℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每2～3 d傳代1次。

1.2.2小鼠造模、分組及免疫 取“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制作成2×1010個(gè)/L細(xì)胞懸液,接種于小鼠右側(cè)前肢皮下,200 μL /只,30 min內(nèi)接種完畢,7 d后觀察腫瘤形成情況,以確定造模成功。取造模成功小鼠隨機(jī)均分為空白(Blank)組(生理鹽水100 μL)、LNP+抗原組(腫瘤疫苗多肽50 μg和LNP 10 μg 混合配成終體積為100 μL的混合液,現(xiàn)配現(xiàn)用)、LNP+R848組(LNP 10 μg和R848 3.18 μg混合配成終體積為100 μL的混合液,現(xiàn)配現(xiàn)用)、R848+抗原組(腫瘤疫苗多肽50 μg和R848 3.18 μg混合配成終體積為100 μL的混合液,現(xiàn)配現(xiàn)用)及LNP+R848+抗原組(腫瘤疫苗多肽50 μg、LNP 10 μg及R848 3.18 μg混合配成終體積為100 μL的混合液,現(xiàn)配現(xiàn)用),2次免疫,間隔7 d。

1.2.3瘤體測(cè)量 “1.2.2”項(xiàng)下各組小鼠免疫處理期間每隔1 d測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(length,L)、短徑(width,W),并依此計(jì)算腫瘤體積[volume,V;V=(L×W2)/2]。

1.2.4腫瘤細(xì)胞的制備 “1.2.2”項(xiàng)下各組小鼠第2次免疫后第7天麻醉處死,取出瘤體,于生物安全柜中用滅菌剪刀剪碎,置于70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)研磨、過(guò)濾,收集細(xì)胞懸液至離心管;每管加紅細(xì)胞裂解液5 mL,輕輕震蕩混勻,裂解時(shí)間不超過(guò)5 min,加 PBS 5 mL終止裂解,混勻離心;加PercollTM分離液離心分離細(xì)胞,4 ℃、1 800 r/min離心30 min,吸出表面黑色液體,加DMEM高糖培養(yǎng)基10 mL重懸洗滌細(xì)胞,4 ℃、1 800 r/min離心10 min,棄上清,收集細(xì)胞計(jì)數(shù)備用。

1.2.5腫瘤CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞(CD8+T)和CD4+T細(xì)胞的檢測(cè) 取“1.2.4”項(xiàng)下細(xì)胞1×109個(gè)/L到96孔板,加5 mg/L腫瘤疫苗多肽刺激6 h進(jìn)行染色分析;使用Zombie NIRTM染色(0.1 μL /孔),室溫避光孵育15 min,以評(píng)估細(xì)胞的生存能力;2% FBS/PBS洗滌,加CD45-Brilliant Violet 605、CD3-Brilliant Violet 510、CD4-Fluoresceine Isothiocyanate、CD8-Alexa Fluor 700及CD107a-Phycoerythrin流式染色抗體,4 ℃避光孵育30 min,2% FBS/PBS洗滌細(xì)胞;加固定破膜液,4 ℃避光孵育30 min,用Permeabilization Wash buffer洗2次;加干擾素γ(interferon γ,IFN-γ )-Allophycocyanin抗體、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)-Preactivated PerCP-Cy5.5 Maleimide抗體,4 ℃避光孵育30 min,用Permeabilization Wash buffer洗滌細(xì)胞,重懸細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管后上機(jī)進(jìn)行檢測(cè);使用FlowJo軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,3組及以上比較采用單因素方差分析,2組間比較用t檢驗(yàn)來(lái)檢測(cè)顯著性;P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤生長(zhǎng)情況

免疫期間,各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)結(jié)果顯示(圖1),LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤生長(zhǎng)較慢,且免疫后第12天 ,腫瘤體積分別小于Blank組、LNP+抗原組、LNP+ R848組及R848+抗原組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注： (1)與同時(shí)點(diǎn)Blank組比較,P<0.05;(2)與同時(shí)點(diǎn)LNP+抗原組比較,P<0.05;(3)與同時(shí)點(diǎn)LNP+R848組比較,P<0.05;(4)與同時(shí)點(diǎn)抗原+R848比較,P<0.05。

2.2 CD4+T細(xì)胞分泌CD107a的水平

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示(圖2),LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤組織中CD4+T細(xì)胞分泌的CD107a分別高于Blank組、LNP+抗原組、LNP+R848組及R848+抗原組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明該組小鼠T細(xì)胞活化程度增高。

注：A為流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果,B為定量結(jié)果; (1)與Blank組比較,P<0.05;(2)與LNP+抗原組比較,P<0.05;(3)與LNP+ R848組比較,P<0.05;(4)與抗原+R848組比較,P<0.05。

2.3 CD8+T細(xì)胞分泌CD107a的水平

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示(圖3),LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞分泌的CD107a高于Blank組、LNP+抗原組、LNP+R848組及R848+抗原組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明該組小鼠腫瘤組織中T細(xì)胞活化程度增高。

注：A為流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果,B為定量結(jié)果;(1)與Blank組比較,P<0.05;(2)與LNP+抗原組比較,P<0.05;(3)與LNP+ R848組比較,P<0.05;(4)與抗原+R848組比較,P<0.05。

2.4 CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示(圖4和圖5),LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤組織中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平高于Blank組、LNP+抗原組、LNP+R848組及R848+抗原組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明該組小鼠的T細(xì)胞在受到疫苗刺激后可產(chǎn)生更高水平的抗原特異性免疫保護(hù)。

注：A、B、C、D及E為流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果,F為流式細(xì)胞儀定量結(jié)果; (1)與同時(shí)點(diǎn)Blank組比較,P<0.05;(2)與同時(shí)點(diǎn)LNP+抗原組比較,P<0.05;(3)與同時(shí)點(diǎn)LNP+R848組比較,P<0.05;(4)與同時(shí)點(diǎn)抗原+R848比較,P<0.05。

注：A、B、C、D及E為流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果,F為流式細(xì)胞儀定量結(jié)果; (1)與同時(shí)點(diǎn)Blank組比較,P<0.05;(2)與同時(shí)點(diǎn)LNP+抗原組比較,P<0.05;(3)與同時(shí)點(diǎn)LNP+ R848組比較,P<0.05;(4)與同時(shí)點(diǎn)抗原+R848組比較,P<0.05。

2.5 CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌TNF-α的水平

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示(圖6和圖7),LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤組織中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌TNF-α的水平高于Blank組、LNP+抗原組、LNP+R848組及R848+抗原組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明LNP對(duì)R848和抗原的共遞送可以刺激T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生更高水平的抗原特異性的細(xì)胞免疫效應(yīng)。

3 討論

腫瘤疫苗利用腫瘤特異性抗原觸發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤疫苗靶向腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原,通過(guò)活化CD8+T細(xì)胞達(dá)到初步激活主動(dòng)免疫殺傷癌細(xì)胞的作用。而后裂解的癌細(xì)胞又會(huì)釋放不同種類的腫瘤抗原經(jīng)抗原提呈細(xì)胞[例如:樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)]提呈給T細(xì)胞,進(jìn)而引發(fā)更為廣泛的抗腫瘤應(yīng)答[15]。腫瘤疫苗的類型可以分為:肽段疫苗、樹(shù)突細(xì)胞疫苗、核酸疫苗[信使RNA(message RNA,mRNA)或者DNA疫苗]、病毒疫苗以及原位腫瘤疫苗[16]。目前抗腫瘤疫苗的研發(fā)面臨著以下幾個(gè)難點(diǎn):疫苗分子的選擇、遞送系統(tǒng)的選擇、腫瘤微環(huán)境的改善等[17]。在提高疫苗有效性方面,一種已經(jīng)開(kāi)始使用的方法是將腫瘤疫苗與一些免疫刺激劑共用,來(lái)提高疫苗的有效性。另一方面,疫苗的遞送系統(tǒng)在腫瘤疫苗系統(tǒng)中有著重要的作用,需要對(duì)人體傷害小,更容易降解的載體材料。除此之外,有些疫苗本身穩(wěn)定性差,需要遞送系統(tǒng)能夠更穩(wěn)定的裝載,讓抗原能夠長(zhǎng)期耐高溫的儲(chǔ)存,在體內(nèi)時(shí)抗原能夠長(zhǎng)期表達(dá),更好地刺激免疫細(xì)胞[18]。

本研究利用黑色素瘤特異性抗原多肽制備多肽腫瘤疫苗,以R848作為佐劑,增強(qiáng)其免疫原性,并選擇LNP作為遞送載體,探索設(shè)計(jì)的腫瘤疫苗在黑色素瘤小鼠模型上的免疫效果。

在自然殺傷(natural killer, NK)細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cell, CTL)中,CD107a是溶細(xì)胞顆粒中最豐富的蛋白質(zhì)之一,它位于囊泡膜的內(nèi)側(cè),介導(dǎo)蛋白經(jīng)溶酶體途徑的分選[19]。CD107a可以用來(lái)評(píng)價(jià)NK細(xì)胞或者T細(xì)胞活性的原因就是:一旦顆粒到達(dá)NK/T細(xì)胞的漿膜面,顆粒膜與細(xì)胞膜發(fā)生融合,CD107a隨即暴露在細(xì)胞膜表面,這被認(rèn)為是一種保護(hù)效應(yīng)細(xì)胞(NK/T細(xì)胞)免受脫顆粒相關(guān)的自殺機(jī)制[20-22]。目前研究表明,CD107a分子的膜表達(dá)可以直接反映NK細(xì)胞或者CTL的脫顆粒過(guò)程,從而反映其殺傷功能。IFN-γ是抗腫瘤免疫相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞因子,通過(guò)誘導(dǎo)凋亡、或者非凋亡細(xì)胞死亡來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞;還可通過(guò)巨噬細(xì)胞活化、上調(diào)抗原處理及呈遞分子的表達(dá)等方式發(fā)揮抗腫瘤的作用[23-24]。TNF-α是一種主要由活化的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞分泌的多功能性細(xì)胞因子,參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)控,在自身免疫性疾病、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不可忽視的作用[25-26]。本研究以LNP為載體,引入TLR7/8的激動(dòng)劑R848,構(gòu)建了具有高免疫原性的LNP-R848佐劑共遞送系統(tǒng),并在小鼠黑色素瘤模型上進(jìn)行驗(yàn)證,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤組織細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞分泌CD107a、IFN-γ和TNF-α的水平,結(jié)果表明,LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞分泌CD107a、IFN-γ和TNF-α的水平高于Blank組、LNP+抗原組、LNP+R848組及R848+抗原組,說(shuō)明該疫苗能通過(guò)增強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)抑制腫瘤生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明,佐劑共遞送是增強(qiáng)腫瘤疫苗免疫效果的有效策略。

綜上所述,本研究開(kāi)發(fā)了一種腫瘤疫苗的設(shè)計(jì)策略,利用LNP遞送腫瘤抗原和免疫佐劑R848,能有效增強(qiáng)T細(xì)胞免疫反應(yīng),顯著抑制小鼠黑色素瘤的生長(zhǎng),在增強(qiáng)腫瘤疫苗性能方面具有很大的潛力。