黃酮類衍生物的合成及對黃嘌呤氧化酶活性的影響*

謝珺, 苗菁, 崔杏, 王建塔, 王聰, 湯磊

(貴州醫(yī)科大學 藥學院, 貴州 貴陽 550025; 貴州省化學合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心, 貴州 貴陽 550004)

痛風是由長期高尿酸(uric acid, UA)血癥引起的一組異質(zhì)性代謝性疾病[1]。UA在關(guān)節(jié)、腎臟及其他器官的積累可引起痛風性關(guān)節(jié)炎、腎結(jié)石、胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿病及肥胖,并加速心血管和周圍血管疾病及腎臟損害[2]。黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XO)是嘌呤代謝途徑中的關(guān)鍵酶,催化次黃嘌呤氧化為黃嘌呤,并由黃嘌呤氧化為UA[3]。目前痛風的治療方法是通過抑制XO、刺激UA排泄或堿化尿液來降低血清UA水平。對于高UA血癥患者,使用XO抑制劑治療是最有效的方法,可直接阻止次黃嘌呤和黃嘌呤氧化為UA[4]。XO抑制劑一般分為嘌呤類和非嘌呤類,目前已開發(fā)獲臨床批準的有別嘌醇、非布索坦及托吡司他等,但藥物存在一些副作用,如別嘌呤醇和非布索坦長期口服可造成肝腎損傷[5],托吡司他可引起爆發(fā)性肝炎[6-7]。隨著全球痛風患者數(shù)量的增加,尋找新的非嘌呤XO抑制劑可為臨床治療痛風提供潛在的解決方案[8]。近年研究發(fā)現(xiàn),許多中藥中含黃酮類結(jié)構(gòu)的化合物在體外可抑制XO的活性,如山奈酚[9]、香豆酸[10]、槲皮素和黃芩素[11]及木犀草素[12]等。槲皮素的苯并吡喃部分夾在Phe914和Phe1009氨酸殘基之間,其共軛三環(huán)結(jié)構(gòu)與氨基酸殘基之間的空間互補作用以及范德華力也使其能形成緊密復合物[13]。近年來,槲皮素衍生物的合成研究主要是在環(huán)上的修飾[14],拼合設(shè)計化合物的研究報道較少。因此,本研究將槲皮素的苯并吡喃酮與苯溴馬隆的二溴苯酚進行拼合,合成了黃酮類衍生物并進行了XO的活性研究,以期發(fā)現(xiàn)有苗頭的先導化合物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1材料及主要試劑 黃嘌吟氧化酶(西格瑪奧德里奇公司),實驗柱層析所用200～300目的硅膠(煙臺新諾化工),實驗所用化學反應試劑和層析溶劑均為分析純(上海沃化化工);試劑為國產(chǎn)市售分析純試劑,GF254薄層層析硅膠和200～300目柱層析硅膠(青島海洋化工有限公司)。

1.1.2主要儀器 Bruker Avance 400 MHz核磁共振儀(美國Varian公司),Bruker Daltonics Bio-TOF-Q Ⅲ型質(zhì)譜儀(美國 Waters 公司),81-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司),ZF-2型三用紫外儀(上海安亭儀器廠)。

1.2 研究方法

1.2.1目標化合物的合成 10 mL圓底燒瓶中加2, 4, 6-三羥基苯乙酮0.2 mmol、碳酸鉀300 mg及丙酮3 mL,滴加氯甲基甲醚0.05 mL,回流1 h、冷卻、過濾,減壓濃縮后硅膠柱層析分離純化得化合物1;5 mL圓底燒瓶中加0.2 mmol 化合物1、 二溴對羥基苯甲醛0.19 mmol、乙醇2 mL及四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)0.17 mL,0 ℃冷卻,加氫氧化鉀0.22 g,室溫攪拌36 h、升溫40 ℃、攪拌4 h,減壓濃縮后硅膠柱層析分離純化得化合物2;5 mL圓底燒瓶中加0.112 mmol 化合物2和甲醇1 mL攪拌,加熱至40 ℃,逐滴加鹽酸0.6 mL,反應2 h,減壓濃縮后硅膠柱層析分離純化得化合物3;25 mL單頸瓶中加0.056 mmol化合物3、無水醋酸鈉48 mg及甲醇12 mL,40 ℃回流,攪拌5 h,減壓濃縮后硅膠柱層析分離純化得化合物a;無水、無氧條件下間苯三酚0.05 mol、氯乙腈0.1 mol及無水氯化鋅1.3 g混合,加無水乙醚30 mL,冰鹽浴冷卻,通入干燥氯化氫2 h,置于冰箱1 h,再通氯化氫2 h、置于冰箱3 d,傾出乙醚,粗體物經(jīng)熱水轉(zhuǎn)至圓底燒瓶,回流1 h,靜止過夜,水重結(jié)晶得化合物4;在圓底瓶中加0.165 mmol化合物4、氫氧化鈉0.5 g、水1 mL、乙醇4 mL及二溴對羥基苯甲醛0.11 mmol 混合攪拌,10%鹽酸調(diào)pH至7,室溫攪拌48 h,抽濾,95%乙醇重結(jié)晶,得化合物b;100 mL圓底燒瓶中加對羥基苯丙酸0.01 mol和冰醋酸50 mL,15 ℃攪拌,緩慢滴加溴素0.021 mol,攪拌48 h,處理冷卻,加水100 mL,固體析出、抽慮,得化合物5;10 mL圓底燒瓶中加1.5 mmol化合物5、間苯二酚1.5 mmol及BF3·OEt20.1 mL,氮氣保護,80 ℃攪拌24 h,冷卻,倒入水中,乙酸乙酯萃取(20 mL,3次),水洗有機相,干燥、蒸干,硅膠柱層析分離得化合物6;10 mL圓底燒瓶中加0.025 mmol化合物6和BF3·OEt20.7 mL、攪拌5 min、加N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide,DMF)0.7 mL得反應液Ⅰ,10 mL圓底燒瓶中加三氯氧磷和DMF各0.7 mL得反應液Ⅱ,反應液Ⅱ慢慢滴入反應液Ⅰ中,回流3 h,冷卻,倒入水中,過濾得粗品,重結(jié)晶得化合物c。

1.2.2XO的活性測試 XO是體內(nèi)嘌呤代謝的關(guān)鍵酶,能催化黃嘌呤氧化生成UA,UA的生成量與XO的酶活力成正比;UA于295 nm處有特征吸收峰,采用酶標儀檢測295 nm處體系UA的變化量,進而得到XO酶活力的大小;96孔板中5個復孔,加25、50、100 及 200 μmol/L 不同濃度的樣品溶液[終濃度含1% 的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)∶吐溫=1∶1溶液] 50 μL、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)50 μL、XO溶液50 μL(終濃度25 mg/L)及底物50 μL(終濃度0.225 mmol/L),混合均勻,37 ℃下酶標儀記錄295 nm處的光密度(optical density,OD)值;對照樣中把XO用PBS代替,空白對照中不加待測化合物或陽性藥,用PBS(終濃度含1%DMSO∶吐溫=1∶1溶液)代替,最后計算抑制率(%)。

1.2.3分子對接 用藥物與分子設(shè)計專業(yè)工具,SYBYL-X軟件繪圖工具繪制XO抑制劑非布索坦和黃酮類衍生物的三維結(jié)構(gòu)并進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化;檢索自結(jié)構(gòu)生物信息學蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)(structural bioinformatics protein data bank,RCSB;http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do),下載編號為1FO4的蛋白晶體結(jié)構(gòu),應用SYBYL-X 2.0軟件包對該蛋白結(jié)構(gòu)進行蛋白準備,采surflex-dock模塊對上述小分子化合物與XO進行虛擬對接,得到打分值。

2 結(jié)果

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1化合物1系1-[2-羥基-4,6-雙(甲氧基甲基)苯基]甲酮,黃色固體,熔點163～165 ℃,收率97%;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ為6.15～6.23(d,J=1.8 Hz,1H),6.20～6.20(d,J=2.43 Hz,1H),5.25～5.35(q,J=43.2 Hz,4H),3.45～3.56(m,J=21.3 Hz, 6H);HRMS (ESI),m/z為C12H16O6,257.102 4(理論值257.102 5)[M+H]+。

2.1.2化合物2系(E)-3-(3, 5-二溴-4-羥基苯)-1-[2-羥基- 4, 6-雙(甲氧基甲基)苯基]-2-丁烯-1-酮,黃色固體,收率10%,熔點253～255 ℃;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ為7.79～7.83(d,J=15.2 Hz,1H),7.70(s,2H),7.55～7.59(d,J=27.9 Hz,1H),6.32～6.33(d,J=1.6 Hz,1H),6.21～6.22(d,J=2.39 Hz,1H),5.20～5.30(q,J=42.8 Hz,4H),3.44～3.57(m,J=20.4 Hz, 6H);HRMS(ESI),m/z為C20H20Br2O7,530.965 3(理論值530.965 4)[M+H]+。

2.1.3化合物3系(E)-3-(3,5二溴-4-羥基苯)-1-(2,4,6-三羥基苯)丙-2-烯-1-酮,黃色固體,收率21%,熔點248～249 ℃;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ為7.91(s,2H),7.55～7.59(d,J=27.9 Hz,1H),6.42～6.45(d,J=1.7 Hz,1H),6.31～6.35(d,J=4.2 Hz,2H),5.23～5.35(q,J=48 Hz,4H),3.34～3.41(m,J=28 Hz, 2H);HRMS(ESI),m/z為C16H12Br2O5,442.913 1(理論值442.913 0)[M+H]+。

2.1.4化合物a系2-(3,5 -二溴-4 -羥基苯)-5,7-二羥基-苯并哌喃- 4-酮,淺黃色固體,收率70%,熔點237～238 ℃;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ為7.02～7.07(m,2H),5.86～5.88(d,J=1.6 Hz,1H),5.80～5.81(d,J=2.0 Hz,1H),3.14～3.18(q,J=4 Hz,2H),2.83～2.89(q,J=7.2 Hz,1H);HRMS(ESI ),m/z為C15H10Br2O5,428.897 2(理論值428.897 3)[M+H]+。

2.1.5化合物4系2 -氯-1-(3,5-三羥基苯)-乙酮,黃色固體,收率50%,熔點175～178 ℃;1H NMR (400 MHz,CD3OD)δ為4.56(s,2H),5.88～5.88(d,J=1.60 Hz,1H),5.94～5.95(d,J=2.0 Hz,1H);HRMS(ESI),m/z為C8H7ClO3,187.016 3(理論值187.016 2)[M+H]+。

2.1.6化合物b系 2-(3,5-二溴- 4 -羥基苯)- 5,7 -二羥基-4H-苯并哌喃-4-酮,黃色固體,收率70%,熔點 303～305 ℃;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ為7.90(s,2H),6.42(s,1H),6.14(s,1H),5.93(s,1H);HRMS(ESI),m/z為C15H8Br2O5,426.881 6(理論值426.881 7)[M+H]+。

2.1.7化合物5系二溴對羥基苯丙酸,粉色固體3.475 g,熔點196～197 ℃;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ為7.10(s,2H),5.42(s,1H),3.83(s,1H);HRMS(ESI ),m/z為C8H6Br2O3,308.876 0(理論值308.876 2)[M+H]+。

2.1.8化合物6系2-(3,5-二溴-4-羥基苯)-1-(2,4-二羥基苯)丙酮,棕色油狀物,收率13%,熔點232～233 ℃;1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ為7.56(d,J=7.8,1H),7.17(d,J=1.8 Hz,2H),6.47(m,1H),6.35(s,1H),5.40(s,3H),4.28(s,1H);HRMS(ESI),m/z為C14H10Br2O4,400.902 2(理論值 400.902 4)[M+H]+。

2.1.9化合物c系3-(3,5-二溴-4-羥基)-7-羥基-4-色原烷酮,黃色固體,收率30%,熔點278～280 ℃;1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ為10.11(s,1H),8.56(s,1H),8.00(d,J=8.8 Hz,1H),7.80(s,2H),7.18(d,J=2.0 Hz,1H),7.07(dd,J=8.8, 2.0 Hz,2H);HRMS(ESI),m/z為C15H10Br2O4,412.902 2(理論值412.902 4)[M+H]+。

2. 2 XO活性測試

目標化合物對XO的抑制活性從表1中可以看出,所設(shè)計的化合物均有一定XO抑制活性,其中活性最好的是黃酮類化合物(化合物b),XO的抑制作用優(yōu)于二氫黃酮類(化合物a)和異黃酮類化合物(化合物c)。

表1 化合物對XO的抑制活性

2.3 分子對接

用surflex-dock模塊對目標化合物與XO進行虛擬對接,打分值見表2,非布索坦和黃酮類衍生物(化合物a～c)打分值均達到4.0以上;非布索坦與XO的相互作用結(jié)果表明(圖1),非布索坦分子中的2個環(huán)與氨基酸Ile431之間存在π-烷基疏水作用,五元環(huán)上的的甲基也與該氨基酸之間存在明顯的烷基疏水作用,而分子中的羧基與Glu45、Gly47,氰基與Asp360、Ser359以及異丁氧基中的氧與Ser356之間均形成了明顯的氫鍵相互作用;黃酮類化合物(化合物b)與XO受體的相互作用結(jié)果表明(圖1),二者間有多個氨基酸結(jié)合位點,如與氨基酸Ala338、Phe337及Asp360形成多個π-烷基疏水作用,而與氨基酸Gly47和Glu45形成典型和非典型的氫鍵。

圖1 非布索坦、化合物b與XO受體結(jié)合位點的相互作用

表2 非布索坦和黃酮類衍生物虛擬對接的surflex-dock模塊打分值

3 討論

XO是包括人類在內(nèi)的一些物種嘌呤分解代謝的關(guān)鍵酶,在次黃嘌呤氧化為黃嘌呤和黃嘌呤氧化為UA的過程中起主要作用[15]。由于XO活性異常,UA產(chǎn)生過多導致高UA血癥,這也與痛風有關(guān)[16]。痛風是一種代謝性疾病,UA水平過高導致關(guān)節(jié)UA鹽結(jié)晶沉積[17]。此外,高UA血癥還與其他疾病相關(guān),如炎癥、慢性腎臟疾病、高血壓疾病及心血管疾病等[18]。XO抑制劑可以阻斷嘌呤生物合成UA,從而降低UA的產(chǎn)量[19];別嘌呤醇、非布司他和托吡洛司他是XO的臨床抑制劑,用于治療高UA血癥[20];目前XO的抑制劑有幾種副作用(如皮疹、過敏反應、血壓升高和白內(nèi)障風險增加等),因此需要有更好療效和更低副作用的XO抑制劑被研發(fā)出來[21]。

雜環(huán)化合物因其結(jié)構(gòu)特點和優(yōu)越的生物活性,在藥物合成領(lǐng)域有著廣泛的應用[22]。近年來,研究重點轉(zhuǎn)向發(fā)現(xiàn)基于雜環(huán)化合物的新型有效、廉價且副作用最小的XO抑制劑[23]。噻唑烷是五元雜環(huán)化合物的代表,已被廣泛應用于醫(yī)藥、材料、生物染料及離子受體等不同領(lǐng)域[24];作為一種典型的噻唑烷衍生物,噻唑環(huán)是制藥和農(nóng)用化學品的重要有機中間體,具有多種生物活性,如醛糖還原酶抑制劑、抗癌、抗炎和抗真菌等[25]。近年來,許多非嘌呤類似物化合物,如姜黃素、萘吡喃、蘆薈大黃素衍生物、吡喃(3,2-d)嘧啶衍生物、羥基查維醇類似物、黃酮類化合物及查爾酮和黃酮衍生物被報道為XO抑制劑[26]。

黃酮類化合物降UA作用的機制主要表現(xiàn)為抑制UA生成和促進UA排泄[27]。XO是復合黃素酶,在UA的形成過程中主要起催化黃嘌吟和次黃嘌吟的作用,一些黃酮類化合物可有效抑制XO酶,從而減少UA生成,例如山奈酚、樹皮素、蘆丁以及艾葉的乙醇提取物可顯著降低小鼠血清中的UA、肌酐、尿素氮水平,抑制肝臟XO活性[28]。另有研究指出,一些黃酮對腎臟近端小管上皮細胞頂端膜上的UA鹽轉(zhuǎn)運蛋白 1(recombinant urate transporter 1,URAT1)表達具有有效的抑制作用,從而降低UA被腎臟重吸收的量,促進UA被排出體外,例如糊皮素[29];有研究結(jié)果顯示,芹菜素可抑制XO,同時也可下調(diào)高UA小鼠腎臟中URAT1蛋白的表達,最終達到降低UA的目的[ 30]。

本研究采用藥物化學的拼合原理設(shè)計并合成了去氫黃酮類化合物(化合物a)、黃酮類化合物(化合物b)及異黃酮類化合物(化合物c);化合物的結(jié)構(gòu)通過1H NMR和HRMS檢測手段驗正;通過XO抑制作用活性測試,目標化合物均有XO抑制活性,且化合物b活性較好,可作為進一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化的先導化合物;非布索坦和黃酮類衍生物打分值均達到4.0以上,從打分結(jié)果可以認為在虛擬對接條件下,小分子配體與蛋白受體之間具有較好的相互作用。分子對接顯示黃酮類化合物(化合物b)與XO受體結(jié)合的位置和非布索坦相近,均與氨基酸Gly47和Glu45形成氫鍵。本研究可為后期XO抑制的研究提供參考依據(jù)。