小鼠shRNA-Slfn3重組腺病毒載體的構(gòu)建及其在EPCs中轉(zhuǎn)染效率的測定*

辛晨, 況春燕*, 劉興德

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院 心內(nèi)科, 貴州 貴陽 550003; 2.貴州省人民醫(yī)院 心內(nèi)科, 貴州 貴陽 550003; 3.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 心內(nèi)科, 貴州 貴陽 550003)

在研究T細(xì)胞譜系的小鼠過程時Schwarz首次發(fā)現(xiàn)Schlafen(Slfn)基因家族,該基因家族僅存在于哺乳動物中[1];也有研究認(rèn)為 Slfn基因在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等方面具有重要的作用[2-3]。Slfn家族成員在哺乳動物中廣泛地表達(dá),但是該家族基因成員在小鼠中的組成部分與人類中的組成部分有所不同[4],小鼠Slfn家族基因的成員有Slfn1、Slfn1L、Slfn2、Slfn3、Slfn4、Slfn5、Slfn8、Slfn9、Slfn10及Slfn14共10個,而組成人類Slfn家族基因的成員只有Slfn5、Slfn11、Slfn12、Slfn13及Slfn14共5個,其中Slfn5和Slfn14是人類和小鼠中共存的Slfn家族基因[5-6]。Slfn家族成員根據(jù)其基因/蛋白質(zhì)大小、序列的同源性以及結(jié)構(gòu)域有所不同,又被劃分為3個亞組[7],目前科研人員對Slfn家族基因的分子功能知之甚少。已有研究顯示,Slfn1在大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)中表達(dá),可調(diào)節(jié)EPCs的生物學(xué)行為,且Slfn1在體外是EPCs增殖和管形成的強(qiáng)大負(fù)性調(diào)節(jié)因子[8-9],然而Slfn3是否能夠像同家族成員Slfn1一樣,對心血管系統(tǒng)起到調(diào)控作用、并對EPCs的增殖及遷移產(chǎn)生影響到目前為止尚未見報道。因此,為了后續(xù)更加深入地探討Slfn3基因?qū)PCs多種生物學(xué)行為的影響,本研究構(gòu)建了小鼠短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)-Slfn3重組腺病毒以供體外感染小鼠脾源EPCs,檢測其在EPCs中的轉(zhuǎn)染效果,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物、細(xì)胞及載體 4～8周齡雄性C57小鼠(重慶貝萊康生物);人胚胎腎細(xì)胞HEK293和pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP載體(上海和元生物),大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞(日本Takara)。

1.1.2主要試劑和儀器 胎牛血清、改良Eagle(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)培養(yǎng)基(美國Gibco),高保真 Prime STAR酶、TaqDNA聚合酶及T4 DNA連接酶(日本Takara),胰蛋白酶(美國Hyclone),質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒和質(zhì)粒純化試劑盒(美國Axygen),限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和EcoRⅠ(華大基因),電熱恒溫水槽(上海一恒),PCR儀(美國Applied Biosystems),移液器(德國Eppendorf),DNA電泳槽(上海天能科技),凝膠成像分析儀(培清科技),超微量分光光度計(北京凱奧科技),冷凍高速離心機(jī)(美國Thermo Fisher)。

1.2 研究方法

1.2.1干擾載體的構(gòu)建 利用GenBank基因軟件獲得了Slfn3基因(NM_011409.1)序列及其上游和下游的序列,并根據(jù)其序列設(shè)計合成3個小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)靶點及1條無義的陰性對照(negative control,NC),siRNA-Slfn3(1)為CTCAATCTCAGATGAAGTGAA,siRNA-Slfn3(2)為AGCAGAATCCAGACCAAGTTC,siRNA-Slfn3(3)為ATCCAGGACAGATCCCGAAGA,NC為CCCGGACTGTAAACTACAGAT;人工合成上述4對引物(表1)[10-11]。利用限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和 EcoRⅠ對載體pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP進(jìn)行雙酶切,使其線性化后,將目的基因Slfn3與其連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,置于含卡那霉素抗性的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng),于37 ℃、5%CO2條件下孵育過夜,PCR鑒定挑選出陽性克隆,并對陽性克隆進(jìn)行DNA測序驗證[10,12];經(jīng)DNA測序驗證正確的質(zhì)粒依次命名為shRNA-Slfn3(1)、shRNA-Slfn3(2)、shRNA-Slfn3(3)及shRNA-Slfn3(NC),并提取質(zhì)粒。測序正向引物序列為CCGGCTCAATCTCAGATGAAGTGAACTCGAGTTCACTTCATCTGAGATTGAGTTTTTTG,位于人U6啟動子序列中;反向引物序列為AATTCAAAAACTCAATCTCAGATGAAGTGAACTCGAGTTCACTTCATCTGAGATTGAG,位于CMV啟動子的5序列。

表1 構(gòu)建的病毒載體框架序列

1.2.2腺病毒的包裝、擴(kuò)增和滴度測定 取HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng);運(yùn)用Admax系統(tǒng),將先前所得的3個穿梭質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中,得重組腺病毒shRNA-Slfn3;HEK293細(xì)胞種植于6孔板之中,等到其生長至密度為70%～80%的時候,去除原培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗2次,加Opti-MEM無血清培養(yǎng)基1.5×10-3/L,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h;骨架質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒按1∶1均勻混合制備得病毒載體質(zhì)粒,取病毒載體質(zhì)粒4 μg 按2.5×10-4/L加入含Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)液中,混合均勻,再加腺病毒包裝轉(zhuǎn)染試劑室溫放置20 min,待轉(zhuǎn)染復(fù)合體狀態(tài)穩(wěn)定后在先前培養(yǎng)HEK293細(xì)胞的6孔板之內(nèi)加入上述所得的轉(zhuǎn)染復(fù)合體,37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h,吸取原有的舊培養(yǎng)基,再加2×10-3/L新鮮培養(yǎng)基,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每隔3 d換液1次,出現(xiàn)病毒空斑則停止換液處理,待所有細(xì)胞完全發(fā)生病變后采集上清液[12-13]。將HEK293細(xì)胞直接接種于規(guī)格為10 cm×10 cm×2 cm的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞生長密度達(dá)到90%以上,加合適度的病毒感染細(xì)胞;待細(xì)胞全部病變后,收取病毒并分裝[10,14]。將生長狀態(tài)良好的HEK293細(xì)胞接種于24孔板,每孔種植的細(xì)胞數(shù)量為5.0×105個,放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng);等細(xì)胞的生長密度達(dá)到90%以上,分別將病毒液按照10-5～10-8的濃度梯度進(jìn)行稀釋,按1×10-4/L依次加入接種有HEK293細(xì)胞的24孔板中,待病毒感染細(xì)胞48 h;運(yùn)用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察,每個培養(yǎng)孔中隨機(jī)選擇5個觀察視野,統(tǒng)計陽性細(xì)胞的數(shù)目,并計算每個培養(yǎng)孔內(nèi)陽性細(xì)胞的平均數(shù)目及病毒的滴度[12-13]。

1.2.3小鼠EPCs的培養(yǎng) 斷頸法處死C57小鼠,取其脾臟剪碎研磨,用PBS沖洗過濾獲得細(xì)胞懸液。將淋巴細(xì)胞分離液與細(xì)胞懸液以1∶4的比例(切勿混勻)加入離心管,放入水平離心機(jī),4 ℃條件下2 000 r/min離心20 min。離心后的液體被分為4層,其中單個核細(xì)胞位于第2層、呈薄薄的白膜層,將其吸出放入離心管,1 500 r/min離心10 min;棄上清,加PBS洗滌3次,培養(yǎng)于含20%胎牛血清及青霉素-鏈霉素雙抗溶液的低葡萄糖L-DMEM培養(yǎng)基中,每隔48 h換液1次,待細(xì)胞生長密度達(dá)70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.4shRNA-Slfn3轉(zhuǎn)染EPCs 取生長密度達(dá)到70%的EPCs,加shRNA-Slfn3進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染EPCs 至48 h,應(yīng)用熒光顯微鏡檢測視野內(nèi)的染上EGFP的細(xì)胞(綠色熒光細(xì)胞),計算細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(轉(zhuǎn)染效率=視野內(nèi)可見的綠色熒光細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量×100%)。

2 結(jié)果

2.1 目的穿梭質(zhì)粒的鑒定

利用測序軟件對4組序列進(jìn)行DNA測序分析驗證。結(jié)果顯示,3組shRNA-Slfn3以及1組對照序列內(nèi)均含有設(shè)計的目的序列(圖1),表明目的穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 重組腺病毒的包裝

將DNA測序無誤的shRNA-Slfn3與輔助質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后13 d左右即可在光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞大量漂浮,且細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光,最后收集細(xì)胞得重組腺病毒。見圖2。

注：綠色熒光表示轉(zhuǎn)染上shRNA-slfn3質(zhì)粒的細(xì)胞。

2.3 重組腺病毒的擴(kuò)增

將收集得到的病毒再次用于感染HEK293細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增,可以在熒光顯微鏡下觀察到大量EGFP的表達(dá)(圖3)。

2.4 重組病毒的滴度

重組病毒滴度的結(jié)果顯示,shRNA-Slfn3(1)、shRNA-Slfn3(2)及shRNA-Slfn3(3)的病毒滴度分別為2.37×1013pfu/L、3.16×1013pfu/L及4.74×1013pfu/L。

2.5 shRNA-Slfn3 轉(zhuǎn)染EPCs

用shRNA-Slfn3轉(zhuǎn)染EPCs 48h,熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞中有強(qiáng)綠色熒光效應(yīng),則為成功地轉(zhuǎn)染上shRNA-Slfn3的EPCs,轉(zhuǎn)染效率為(67.64±2.58)%。見圖4。

圖4 EPCs轉(zhuǎn)染shRNA-Slfn3 48 h后熒光的表達(dá)(100×)

3 討論

本研究構(gòu)建了小鼠shRNA-Slfn3的重組腺病毒質(zhì)粒,并且進(jìn)行了腺病毒的包裝,為Slfn3基因后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ);成功地從小鼠脾臟提取到EPCs,在體外培養(yǎng),并用構(gòu)建的小鼠shRNA-Slfn3重組腺病毒質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染到EPCs中,為后續(xù)Slfn3基因和EPCs的相關(guān)研究提供了可靠的保障。

多年來,許多研究者對大多數(shù)Slfn家族基因的功能進(jìn)行了深入研究,盡管Slfn家族不同基因和蛋白質(zhì)的確切功能還尚待確定,但是有最新的研究證據(jù)表明,該家族的多個成員參與了發(fā)育、免疫反應(yīng)和細(xì)胞的增殖[15]。在胸腺細(xì)胞的成熟過程和T細(xì)胞的發(fā)育過程之中,Slfn家族成員的表達(dá)呈顯著上調(diào),與之相反的是其在胸腺瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中的表達(dá)則為抑制細(xì)胞的增殖[16]。Slfn3基因隸屬于Slfn家族的第二亞群,蛋白分子的大小介于58～68 kDa,其蛋白結(jié)構(gòu)中包含有一個“SLFN盒”,與一個不同的AAA結(jié)構(gòu)域相鄰,還有一個此亞群特有但功能未知的高度保守的“Ser-Trp-Ala-Asp-Leu(SWADL)”結(jié)構(gòu)域[17]。最新研究已經(jīng)確定Slfn3基因是外圍CD4+CD25+T細(xì)胞中過度表達(dá)的基因,可以在T細(xì)胞分化和激活中發(fā)揮作用,并可能成為T細(xì)胞激活的新標(biāo)志物。在T細(xì)胞激活和增殖的時候,Slfn3基因的mRNA在CD4+CD25+Tregs中呈現(xiàn)出下調(diào)的趨勢,與此不同的是,其在CD4+CD25-Teffs中受到明顯上調(diào)。而且TGF-β能夠抑制Slfn3基因在抗CD3/CD28激活的CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)[18]。此外,Slfn3基因已經(jīng)被證實是細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)節(jié)劑,其能夠在體內(nèi)和體外介導(dǎo)嚙齒動物腸細(xì)胞的分化,并且Slfn3基因的表達(dá)可以明顯抑制富含癌干細(xì)胞、抗FOLFOX的結(jié)腸癌細(xì)胞的多種特征,它的表達(dá)可能會使結(jié)腸癌更容易受到癌癥化療的影響[19]。在更進(jìn)一步的研究中還發(fā)現(xiàn),Slfn3基因在 EPCs 中也有明顯的表達(dá),先前有研究證實另一Slfn家族成員Slfn1被證實在大鼠EPCs中表達(dá)并且調(diào)節(jié)EPCs的生物學(xué)行為,由此可以推測Slfn3也在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用,極有可能參與了心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程。然而,目前Slfn3基因在這方面的研究少之又少,這極大地限制了其臨床應(yīng)用。

科研人員經(jīng)常通過操縱某個基因的表達(dá)來研究這個基因的功能,降低目的基因的表達(dá)或者完全敲除目的基因是最常用的兩種方法[20]。其中敲減基因的方法多種多樣,比如siRNA、shRNA及CRISPR-CasRx等。本研究采用的是shRNA敲低技術(shù),shRNA是一種類似于發(fā)卡狀的短頸環(huán)結(jié)構(gòu),通常是借助質(zhì)粒病毒等載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),需要經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的酶進(jìn)行切割,才能轉(zhuǎn)變成siRNA而發(fā)揮作用[21];shRNA被連接在病毒載體上,以DNA的形式導(dǎo)入細(xì)胞,在細(xì)胞核內(nèi),被轉(zhuǎn)錄為pri-miRNA,細(xì)胞內(nèi)的Drosha酶修剪pri-miRNA的兩端序列,使其變成一種具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的小RNA(microRNA, miRNA),即shRNA的前體pre-shRNA;接下來pre-shRNA從細(xì)胞核內(nèi)游走到細(xì)胞質(zhì),在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成了成熟的shRNA;在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Dicer酶作用下,shRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)被切掉,只剩下核心的siRNA序列;siRNA可以降解mRNA,干擾翻譯過程,從而降低蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。與siRNA的瞬態(tài)效果相比,shRNA雖然發(fā)揮作用的過程更加復(fù)雜,但是其可以通過病毒載體整合到基因組內(nèi),更加穩(wěn)定地表達(dá),并且能夠長久持續(xù)地發(fā)揮作用[22]?；蚯脺p技術(shù)在這些年不斷地取得進(jìn)步和創(chuàng)新,已經(jīng)從最開始最基本的將目的基因完全敲除,發(fā)展到現(xiàn)在可以在特定的組織、特定的時間敲除目的基因,在特異性得到了提高的同時,基因敲除的效率也得到了顯著的提高。基因敲減技術(shù)在基因組學(xué)中的廣泛應(yīng)用,極大地推動了全球醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的不斷發(fā)展和進(jìn)步。

本研究選用Slfn3作為目的基因片段,pADV-U6-shRNA- CMV-EGFP作為干擾載體,Slfn3基因片段被成功地插入到重組腺病毒載體中,構(gòu)建了shRNA-Slfn3重組腺病毒;并對小鼠脾源EPCs進(jìn)行了體外培養(yǎng),用該重組腺病毒能夠成功感染EPCs,轉(zhuǎn)染效率為(63.64±2.58)%,為更進(jìn)一步研究利用腺病毒敲低Slfn3基因表達(dá)在EPCs生物學(xué)功能中的作用打下了基礎(chǔ)。