蜀葵ArbHLH148 基因克隆與表達(dá)分析

高 文，閆庚洋，左俊凱，許 樂(lè)，侯蕊利，景其昌，任 昊

（河南科技大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471000）

植物在生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)各種脅迫時(shí)，其結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)除了受外部環(huán)境因素的調(diào)控，還受內(nèi)部轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，如MYB、bHLH、WRKY、MADS-box、bZIP、NAC、AP2/ERF、TCP 等轉(zhuǎn)錄因子[1-8]。它們主要通過(guò)與結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子中的順式作用元件相結(jié)合來(lái)激活或者抑制結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，從而滿足植物生長(zhǎng)發(fā)育需求或者響應(yīng)脅迫反應(yīng)。其中，堿性螺旋-環(huán)-螺旋（Basic helix-loop-helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子[9]，在其氨基酸序列的N端有15～20個(gè)保守氨基酸組成的堿性區(qū)域（Basic region），該區(qū)域可識(shí)別Ebox（5′-CANNTG-3′）結(jié)構(gòu)，并與之結(jié)合。在C 端有約40 個(gè)疏水氨基酸組成的螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)域（Helix-loop-helix，HLH），2 個(gè)HLH 區(qū)域通過(guò)疏水氨基酸的相互作用形成同源或者異源二聚體來(lái)調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。目前已在多種植物中鑒定出了大量的bHLH 轉(zhuǎn)錄因子，如在水稻、擬南芥、玉米、番茄、海濱木槿、枇杷、梅中分別有167、147、208、159、162、160、100個(gè)成員[10-16]。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子在植物花器官發(fā)生、激素應(yīng)答、次生代謝、脅迫響應(yīng)等方面均有重要作用[17-21]。

蜀葵是我國(guó)的傳統(tǒng)觀賞花卉之一，因具有豐富的花色和漂亮的花型而深受人們青睞。尤其是重瓣花型，因具有層次分明、形式多樣、立體感強(qiáng)等特點(diǎn)而備受關(guān)注。趙印泉等[22]認(rèn)為重瓣花有6 種起源方式，包括積累起源、苞片起源、雌雄蕊起源、臺(tái)閣起源、重復(fù)起源和花序起源。而雄蕊瓣化現(xiàn)象在蜀葵中非常普遍，是產(chǎn)生重瓣花型的重要原因。課題組前期采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析了蜀葵雄蕊瓣化的相關(guān)基因[23]，篩選出一個(gè)高表達(dá)的bHLH 轉(zhuǎn)錄因子基因，根據(jù)功能注釋，將其命名為ArbHLH148。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄PCR 方法克隆該基因并進(jìn)行生物信息學(xué)鑒定、qPCR 表達(dá)分析等，進(jìn)一步探討其生物學(xué)功能，旨為該基因在蜀葵花型分子改良中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蜀葵材料

供試蜀葵種植于農(nóng)豐農(nóng)業(yè)科技有限公司（洛陽(yáng)辛店鎮(zhèn)）。采集剛開(kāi)放的紅色重瓣蜀葵的花朵及其萼片、花瓣、雄蕊、瓣化雄蕊，每樣5 份，分別置于50 mL 塑料管中，液氮速凍后，于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.2 RNA抽提及其反轉(zhuǎn)錄

RNA 抽提嚴(yán)格按照M5 HiPer Plant RNeasy Complex Mini Kit（貨號(hào)MF045-01，北京聚合美生物科技有限公司）使用說(shuō)明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄則按照M5 First Strand cDNA Synthesis Kit（貨號(hào)MF011-T，北京聚合美生物科技有限公司）使用說(shuō)明書執(zhí)行。

1.3 ArbHLH148基因克隆及其序列分析

將轉(zhuǎn)錄組拼接結(jié)果TRINITY_DN6354_c0_g2 用NCBI 中的ORF finder 工具進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其具有672 bp 的開(kāi)放閱讀框，編碼223 個(gè)氨基酸。據(jù)此開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)引物bHLH148-Fo：5′-TAGTGGATCCAAAGAATTCATGGCGTCCACGATAACGAAT-3′，bHLH148-Ro：5′-CGAGAAGCTTTTTGAATTCTTACTGACAAGTCGACGGAGGAG-3′。以紅色重瓣蜀葵花朵cDNA 為模板，按照M5 Magic High-Fidelity DNA Polymerase（with dNTPs）使用說(shuō)明書進(jìn)行擴(kuò)增。具體擴(kuò)增條件：95 ℃2 min；95 ℃25 s，61 ℃25 s，68 ℃25 s，共36 個(gè)循環(huán)；68 ℃5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確的PCR 產(chǎn)物與載體pSAK277 重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

首先，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLASTn分析（NCBI），以確認(rèn)其是否為bHLH 轉(zhuǎn)錄因子。其次，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析（MEGA 11.0），以明確其進(jìn)化關(guān)系；用在線程序（MEME）識(shí)別其結(jié)構(gòu)功能區(qū)域。然后，對(duì)其蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、疏水性、跨膜區(qū)域、亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽等信息進(jìn)行分析（Protparam 程序等），進(jìn)一步了解其可能的結(jié)構(gòu)和功能。

1.4 ArbHLH148基因表達(dá)模式分析

分別抽提紅色重瓣蜀葵萼片、花瓣、雄蕊、瓣化雄蕊的RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體操作與1.2 相同。為了更好地了解ArbHLH148基因功能，同時(shí)分析了與其功能發(fā)揮有關(guān)的基因［24-27］的表達(dá)模式。以18S作為內(nèi)參基因，引物序列詳見(jiàn)表1。qPCR 按照2×M5 HiPer SYBR Premix Es Taq（with Tli RNaseH）（貨號(hào)MF787-01，北京聚合美生物科技有限公司）使用說(shuō)明書于CFX96 PCR 儀中完成，每樣品設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。具體程序：預(yù)變性95 ℃30 s；變性95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)量采用2－△△Ct方法計(jì)算。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCR

1.5 生長(zhǎng)素（IAA）含量檢測(cè)

采用植物IAA 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)FX-96T，上海研謹(jǐn)生物科技有限公司）分別檢測(cè)萼片、花瓣、雄蕊、瓣化雄蕊的IAA 含量。按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行具體操作。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 基因表達(dá)量與IAA含量之間的相關(guān)性分析

為 了 明 確ArbHLH148、ArIAA1、ArARF8和ArTIR1基因表達(dá)量與IAA 含量之間的相關(guān)性，根據(jù)宋粉鮮等[28]的相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)對(duì)二者進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ArbHLH148基因克隆

以紅色重瓣蜀葵花朵cDNA 為模板，以引物bHLH148-Fo 和bHLH148-Ro 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可知其片段大小與引物擴(kuò)增長(zhǎng)度相吻合（圖1a）。通過(guò)測(cè)序分析可知，其片段大小為672 bp，編碼223個(gè)氨基酸（圖1b）。與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與樹(shù)棉（Gossypium arboreum）bHLH148 轉(zhuǎn)錄因子基因（LOC108487387）序列具有80%的一致性（E 值為1e-119），因此命名為ArbHLH148。

圖1 ArbHLH148基因克隆Fig.1 Cloning of ArbHLH148 gene

2.2 ArbHLH148系統(tǒng)進(jìn)化分析

用MEGA 11.0 軟件對(duì)ArbHLH148 與162 個(gè)擬南芥的bHLH 轉(zhuǎn)錄因子[29]做系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明，其與擬南芥AtbHLH147、AtbHLH148、AtbHLH149、AtbHLH150在進(jìn)化關(guān)系上很近（圖2）。

2.3 ArbHLH148結(jié)構(gòu)功能域識(shí)別

在http://meme-suite.org/meme/tools/meme 網(wǎng)站，進(jìn)一步將ArbHLH148 與AtbHLH147、AtbHLH148、AtbHLH149、AtbHLH150 的氨基酸序列做比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其具有典型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，即bHLH 保守結(jié)構(gòu)域（圖3）。表明ArbHLH148 確實(shí)是 bHLH家族成員之一。

圖3 ArbHLH148及其同源蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 The conserved domain analysis of ArbHLH148 and its homologous proteins

2.4 與ArbHLH148功能相關(guān)的其他分析

采用http://web.expasy.org/網(wǎng)站的Protparam 程序?qū)rbHLH148的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，其氨基酸序列由223個(gè)氨基酸組成，分子式為C1056H1798N332O314S10，相對(duì)分子質(zhì)量為24 490.53。理論等電點(diǎn)為11.09。其在280 nm 處的水溶液消光系數(shù)為14 105 L/（mol·cm）。不穩(wěn)定指數(shù)為44.08。親水性平均值（GRAVY）為-0.613。表明該蛋白質(zhì)是中性溶液中帶正電荷的、不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)。

采用http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/eukmulti-2/網(wǎng)站的Euk-mPLoc 2.0 軟件對(duì)ArbHLH148的亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明，其定位于細(xì)胞核中。采用http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/網(wǎng)站的SignalP-5.0 軟件對(duì)ArbHLH148 的信號(hào)肽進(jìn)行分析，結(jié)果表明，其沒(méi)有信號(hào)肽。采用www.cbs.dtu.dk/services/網(wǎng)站的TMHMM-2.0 軟件對(duì)ArbHLH148 的跨膜區(qū)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明，其沒(méi)有跨膜區(qū)。

綜合上述分析結(jié)果，表明該蛋白質(zhì)是位于細(xì)胞核內(nèi)的、沒(méi)有跨膜區(qū)的非分泌蛋白。這些結(jié)果與ArbHLH148的轉(zhuǎn)錄因子屬性是一致的。

2.5 qPCR表達(dá)分析

以紅色重瓣蜀葵的萼片、花瓣、雄蕊和瓣化雄蕊為試材，并以18S作為內(nèi)參基因，對(duì)ArbHLH148及其功能相關(guān)基因在不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析。結(jié)果顯示，ArbHLH148在萼片、花瓣、雄蕊和瓣化雄蕊中均有表達(dá)。但其在雄蕊中的表達(dá)量相對(duì)較多，在花瓣、瓣化雄蕊和萼片中的表達(dá)量依次減少。而且，ArbHLH148與生長(zhǎng)素信號(hào)相關(guān)基因ArIAA1、ArARF8、ArTIR1在雄蕊和瓣化雄蕊中的表達(dá)量差異很大，均已達(dá)到了顯著水平（圖4）。表明其在蜀葵花的發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，特別是對(duì)蜀葵雄蕊的發(fā)育影響較大。說(shuō)明ArbHLH148基因可能通過(guò)生長(zhǎng)素信號(hào)途徑間接對(duì)蜀葵雄蕊發(fā)育起重要作用。

圖4 ArbHLH148及其功能相關(guān)基因在不同組織中的表達(dá)分析Fig.4 The expression analysis of ArbHLH148 and itsfunctionally related genes in different tissues

2.6 IAA含量分析

為 了 驗(yàn) 證ArbHLH148、ArIAA1、ArARF8和ArTIR1基因的表達(dá)差異對(duì)IAA 含量水平的影響，進(jìn)一步對(duì)萼片、花瓣、雄蕊和瓣化雄蕊中的IAA 含量進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IAA在雄蕊、花瓣和瓣化雄蕊中的含量依次降低，且在雄蕊中的平均含量最多（159.16 ng/g），而在瓣化雄蕊中的平均含量最少（49.58 ng/g），二者差異達(dá)到了顯著水平（圖5）。這與IAA 信號(hào)相關(guān)基因在雄蕊、花瓣和瓣化雄蕊中的相對(duì)表達(dá)量依次降低相似。說(shuō)明這些基因的表達(dá)差異與IAA含量水平可能有一定的關(guān)聯(lián)。

圖5 不同組織IAA含量分析Fig.5 Analysis of auxin content in different tissues

2.7 基因表達(dá)量與IAA含量的相關(guān)性分析

為 了 明 確ArbHLH148、ArIAA1、ArARF8和ArTIR1基因的表達(dá)差異與IAA 含量水平之間的關(guān)系，分析這些基因的相對(duì)表達(dá)量與IAA 含量的相關(guān)性。結(jié)果表明，每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量與IAA 含量均呈正相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)r＞0）（圖6）。其中，ArbHLH148和ArIAA1基因的相對(duì)表達(dá)量與IAA含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.994 和0.961（圖6a—b）；而ArARF8和ArTIR1基因的相對(duì)表達(dá)量與IAA 含量呈高度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到了0.887和0.854（圖6c—d）。說(shuō)明不同組織中的IAA含量水平確實(shí)與這些基因的表達(dá)差異密切相關(guān)。尤其是在雄蕊和瓣化雄蕊中IAA 含量的劇烈變化可能是造成蜀葵雄蕊瓣化的重要原因。

圖6 不同組織中基因表達(dá)量與IAA含量的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of gene expression levels and IAA content in different tissues

3 結(jié)論與討論

有研究表明，隨著植物花發(fā)育的啟動(dòng)，植物生長(zhǎng)素信號(hào)被生長(zhǎng)素受體蛋白TIR1/AFBs 感知，同時(shí)招募AUX/IAA-ARFs 蛋白復(fù)合體并降解其中的AUX/IAA 蛋白，從而釋放ARFs 轉(zhuǎn)錄因子以調(diào)節(jié)雄蕊的發(fā)育[24]。與野生型相比，在tir1、afb1、afb2和afb3四重突變體中，由于缺乏感知生長(zhǎng)素信號(hào)的TIR1/AFBs蛋白，造成雄蕊發(fā)育異常，致使約25%的花絲變短和約90%的早熟花藥開(kāi)裂[25]。在生長(zhǎng)素反應(yīng)因子arf6和arf8的雙重突變體中，由于生長(zhǎng)素信號(hào)缺失導(dǎo)致下游茉莉酸水平的降低，從而使雄蕊和花瓣的生長(zhǎng)均受到了阻礙，最終造成了花苞開(kāi)放延遲。但是在噴施外源茉莉酸后，該雙重突變體的雄蕊和花瓣又恢復(fù)了正常生長(zhǎng)[26]。在茉莉酸誘導(dǎo)下，JAZ 蛋白被降解了，使bHLH-MYB 轉(zhuǎn)錄復(fù)合體激活下游基因的表達(dá)以促進(jìn)雄蕊發(fā)育[27]。這些結(jié)果表明，參與生長(zhǎng)素和茉莉酸信號(hào)途徑的TIR1、ARF8、bHLH基因的異常表達(dá)確實(shí)造成了雄蕊發(fā)育異常。為了驗(yàn)證ArbHLH148 轉(zhuǎn)錄因子與蜀葵雄蕊瓣化的關(guān)系，選取了與其功能發(fā)揮密切相關(guān)的基因進(jìn)行qPCR 分析，如ArIAA1、ArARF8、ArTIR1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了ArIAA1外，ArbHLH148、ArARF8、ArTIR1在雄蕊中的表達(dá)量均較高，但是這4 個(gè)基因在瓣化雄蕊中的表達(dá)量卻相對(duì)較低。表明生長(zhǎng)素水平降低可能是導(dǎo)致蜀葵雄蕊發(fā)育異常，造成其雄蕊瓣化的原因。進(jìn)而對(duì)樣品中的生長(zhǎng)素含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素在雄蕊、花瓣和瓣化雄蕊中的含量依次降低，這與ArbHLH148、ArIAA1、ArARF8、ArTIR1基因在雄蕊、花瓣和瓣化雄蕊中的表達(dá)趨勢(shì)一致。進(jìn)一步表明，生長(zhǎng)素含量變化及其相關(guān)基因的表達(dá)差異可能是蜀葵雄蕊瓣化的原因。但是，關(guān)于生長(zhǎng)素含量變化以及ArbHLH148、ArIAA1、ArARF8、ArTIR1基因的表達(dá)差異是否為蜀葵雄蕊瓣化的直接原因，仍需要轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)加以驗(yàn)證。這也為進(jìn)一步研究雄蕊瓣化現(xiàn)象指明了方向。

花瓣原基的起始也是受植物生長(zhǎng)素信號(hào)調(diào)控的[30]，且生長(zhǎng)素水平梯度變化是所有植物器官形成的一種共同的調(diào)控方式，而無(wú)論其成熟形態(tài)或發(fā)育起源如何[31]。蜀葵ArbHLH148、ArIAA1、ArTIR1和ArARF8基因在瓣化雄蕊、花瓣、雄蕊中的表達(dá)量呈現(xiàn)由低到高的趨勢(shì)，表明這些基因的表達(dá)變化調(diào)控著雄蕊和花瓣的發(fā)育。擬南芥bHLH 轉(zhuǎn)錄因子BIGPETALp（BPEp）與ARF8 的復(fù)合體通過(guò)控制細(xì)胞的分裂和繁殖來(lái)影響花瓣的發(fā)育，如arf8突變體的花瓣明顯大于野生類型，且這種變化是與早期生長(zhǎng)素反應(yīng)基因的表達(dá)變化相一致的[17]。同時(shí)，通過(guò)生長(zhǎng)素信號(hào)調(diào)控的ETTIN/ARF3 也影響著花瓣的數(shù)量[32]。菊花bHLH 轉(zhuǎn)錄因子CmBPE2 與TIFY 家族CmJAZ1-like 的復(fù)合體通過(guò)調(diào)控細(xì)胞擴(kuò)張來(lái)影響花瓣的大小，如抑制CmBPE2的表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞擴(kuò)張相關(guān)基因的下調(diào)表達(dá)，從而導(dǎo)致花瓣變小[33]。這些研究表明，bHLH 轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)植物生長(zhǎng)素信號(hào)途徑和茉莉酸信號(hào)途徑參與了花瓣發(fā)育過(guò)程。

綜上所述，ArbHLH148 轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)復(fù)雜的植物激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)間接參與了蜀葵雄蕊瓣化現(xiàn)象。但是這需要進(jìn)一步的試驗(yàn)加以驗(yàn)證。希望將來(lái)有更多的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)解析雄蕊瓣化現(xiàn)象，為重瓣植物的選育及其觀賞品質(zhì)的提升奠定基礎(chǔ)。