血清脂肪酸結(jié)合蛋白4與3歲及以下兒童自閉癥譜系障礙診斷及神經(jīng)發(fā)育的相關(guān)性

張靜靜,賈媛媛,胡苗苗,成勝權(quán)

自閉癥譜系障礙(autism spectrum disorder,ASD)是以早期社會(huì)溝通障礙、語言延遲和重復(fù)性感覺運(yùn)動(dòng)行為為特征的神經(jīng)發(fā)育障礙[1,2],影響約1%的學(xué)齡前兒童[2,3]。盡管ASD被認(rèn)為是由遺傳和環(huán)境因素之間的復(fù)雜相互作用引起的,但ASD發(fā)病機(jī)制仍不清楚[4,5]。ASD患兒與早期典型發(fā)育(typical developing,TD)兒童相比會(huì)表現(xiàn)出不同的發(fā)育差異[6]。大腦發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期是胚胎期至3歲[7],ASD兒童越早接受行為干預(yù)就越有可能緩解癥狀[8]。除了大腦發(fā)育差異,多數(shù)ASD患兒在早期發(fā)育階段還表現(xiàn)出與脂質(zhì)代謝相關(guān)的特征,這是因?yàn)橹窘M織可分泌多種生物活性分子(脂肪因子),其中一些因子可調(diào)節(jié)大腦功能[9]。脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)最近被鑒定為一種新型脂肪因子,被認(rèn)為與脂肪酸(fatty acids,FAs)形成復(fù)合物,并作為細(xì)胞內(nèi)FAs的伴侶因子在代謝綜合征的病理學(xué)中發(fā)揮重要作用,這已在精神分裂癥患者中得到證實(shí)[9,10]。然而,到目前為止,FABP4與ASD之間的關(guān)系尚未得到研究。因此,本研究檢查了≤3歲ASD兒童的血清樣本,以確定血清FABP4水平與神經(jīng)發(fā)育特征之間的對應(yīng)關(guān)系,以期為指導(dǎo)臨床預(yù)防和控制提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象 2019-05至2022-04,從我院兒科和兒童心理科共招募60例ASD兒童(ASD組),男45例,女15例,平均(2.02±0.76)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):符合《精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊》第5版(2013年)[11]中ASD診斷標(biāo)準(zhǔn);兒童自閉癥評定量表(childhood autism rating scale,CARS)總分在30分以上;年齡≤3歲;首次確診。排除標(biāo)準(zhǔn):診斷為其他精神疾病(如注意力缺陷多動(dòng)障礙、強(qiáng)迫癥)、其他神經(jīng)發(fā)育障礙、遺傳代謝疾病或嚴(yán)重神經(jīng)疾病;腦損傷史;過去3個(gè)月內(nèi)存在急性/慢性感染或使用任何FABP4補(bǔ)充劑;貧血、代謝紊亂、自身免疫性疾病。另外納入同時(shí)期正常發(fā)育兒童共68例作為對照組,納入標(biāo)準(zhǔn):健康,已知無神經(jīng)發(fā)育或神經(jīng)系統(tǒng)疾病,無感染且未使用維生素補(bǔ)充劑,年齡(P=0.815)和性別(P=0.360)與ASD組相匹配,平均(1.99±0.69)歲,男46例,女22例,排除標(biāo)準(zhǔn)與ASD組相同。對于所有登記的兒童,均獲得了法定監(jiān)護(hù)人的簽字知情同意書。這項(xiàng)研究獲得了我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 觀察指標(biāo) 由ASD患兒和對照兒童的法定監(jiān)護(hù)人完成了信息問卷,包括有關(guān)人口統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(例如,姓名、年齡和性別)、病史和食物偏好。ASD的癥狀用Kaufman兒童成套評價(jià)測驗(yàn)(Kaufman assessment battery for children,K-ABC)、自閉癥診斷觀察量表第2版(autism diagnostic observation schedule second edition,ADOS-2)進(jìn)行評估。K-ABC量表分為智力和成就兩個(gè)子量表[12]。ADOS-2(自閉癥診斷觀察量表第二版)是用于診斷和鑒別自閉癥的一種評估工具,包括重復(fù)刻板行為(restricted and repetitive behaviors,RRB)、社交影響(social affect,SA)兩個(gè)維度,2個(gè)維度得分相加即為總分,并根據(jù)模塊與年齡轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)化的嚴(yán)重程度評分(calibrated severity score,CSS)[13]。分?jǐn)?shù)越高,ASD嚴(yán)重程度越高。

1.3 神經(jīng)發(fā)育評估 采用中國兒童神經(jīng)心理行為檢查量表2016版(children neuropsychological and behavioral scale-revision 2016,CNBS-R2016)評估ASD患兒的神經(jīng)發(fā)育水平,計(jì)算發(fā)育商(development quotient,DQ);DQ<70分定義為發(fā)育障礙(developmental disability,DD)[14]。根據(jù)DQ,我們將ASD患兒分為3個(gè)亞組:無DD,DQ≥70分;輕度DD,55分≤DQ<69分;中度及以下DD,DQ≤54分。對于交流警示行為能區(qū),其得分<7分表示正常發(fā)育,7～<12分提示需要隨訪,12～30分表示有交流和互動(dòng)障礙風(fēng)險(xiǎn),>30分提示高度懷疑ASD[14]。

1.4 血清脂肪因子和代謝生物標(biāo)志物的測定 采集研究對象3～5 ml全血樣本,血清分離,在室溫下凝固2 h或-4 ℃過夜,將血樣以1350 r/min離心20 min。采集血清并立即儲(chǔ)存在-80 ℃,直到分析。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(美國Cayman Chemical)測量血清FABP4濃度。此外使用夾心ELISA試劑盒(美國R&D Systems Inc.)測定脂聯(lián)素、瘦素水平。另外采用75 g葡萄糖耐量試驗(yàn)檢測血清胰島素水平,葡萄糖氧化酶法檢測空腹葡萄糖水平。使用游離脂肪酸熒光測定試劑盒測量游離脂肪酸的水平。每個(gè)血清樣本分析兩次,取平均值進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS26.0軟件處理數(shù)據(jù),二分類變量以%(頻率)表示,進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。偏態(tài)資料采用[M(Q1,Q3)]表示,進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)和多元線性回歸進(jìn)行評估。采用logistic回歸模型分析ASD及神經(jīng)發(fā)育障礙的影響因素。雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組兒童臨床特征資料比較 兩組兒童挑食、排斥蔬菜和肉類、血清瘦素、血清胰島素、血清葡萄糖水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但ASD組血清FABP4、血清游離脂肪酸、血清脂聯(lián)素水平低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1)。

2.2 血清FABP4水平與ASD的關(guān)系 將表1單因素分析中P<0.1的變量作為自變量,有無ASD作為因變量(無ASD賦值為0,有ASD賦值為1)納入多因素logistic回歸模型,結(jié)果顯示,血清FABP4是ASD的獨(dú)立影響因素(P<0.05,表2)。經(jīng)ROC曲線分析,血清FABP4診斷ASD的曲線下面積為0.778(0.685～0.859),最佳截?cái)嘀禐?6.85 ng/ml,敏感度和特異度分別為86.8%和68.3%(圖1)。

表1 兩組兒童臨床特征資料比較 [M(Q1,Q3)]

表2 Logistic回歸分析血清自閉癥譜系障礙與脂肪酸結(jié)合蛋白4的關(guān)系

圖1 血清脂肪酸結(jié)合蛋白4水平與其他脂肪因子和代謝生物標(biāo)志物的關(guān)系

2.3 ASD患兒血清FABP4水平與其他脂肪因子和代謝生物標(biāo)志物的關(guān)系 經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析,血清FABP4與瘦素(r=0.352,P=0.006)、游離脂肪酸(r=0.789,P<0.001,圖2)呈正相關(guān)。進(jìn)一步校正年齡和性別因素后,ASD患兒血清FABP4水平仍是血清瘦素(β=0.636,95%CI:0.293～0.979,P<0.001)和血清游離脂肪酸(β=19.038,95%CI:10.615～27.461,P<0.001)的獨(dú)立影響因子。

圖2 自閉癥譜系障礙患兒血清脂肪酸結(jié)合蛋白4水平與其他脂肪因子和代謝生物標(biāo)志物的關(guān)系

2.4 ASD患兒血清FABP4水平與K-ABC、ADOS-2評分的相關(guān)性 經(jīng)SPSS Spearman法分析,ASD患兒血清FABP4水平與K-ABC智力評分(r=-0.611,P<0.001)、成就評分(r=-0.557,P<0.001)、ADOS-2-SA(r=-0.421,P=0.001)、ADOS-2-RRB(r=-0.437,P<0.001)、總分(r=-0.422,P=0.001)、ADOS-2-CSS(r=-0.384,P=0.002)均呈負(fù)相關(guān)。

2.5 ASD患兒血清FABP4水平與神經(jīng)發(fā)育水平的關(guān)系 DQ<70分亞組ASD患兒血清瘦素、血清游離脂肪酸、血清FABP4顯著低于DQ≥70分亞組(P<0.05,表3)。此外,進(jìn)一步經(jīng)Spearman相關(guān)性分析,3歲及以下ASD患兒血清FABP4水平與DQ(r=0.203,P=0.006),CNBS-R2016粗大運(yùn)動(dòng)(r=0.176,P=0.018)、精細(xì)運(yùn)動(dòng)(r=0.158,P=0.035)、語言(r=0.199,P=0.008)評分均呈正相關(guān)。此外,將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的變量進(jìn)一步納入多因素分析,在校正年齡、性別等干擾因素后,血清FABP4水平是影響ASD患兒神經(jīng)發(fā)育障礙的獨(dú)立保護(hù)因素(OR=0.677,95%CI:0.495～0.925,P=0.014)。

3 討 論

本研究分析了血清FABP4水平與≤3歲ASD患兒核心癥狀和神經(jīng)運(yùn)動(dòng)發(fā)育水平之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASD患兒血清FABP4水平普遍低于對照組兒童,且與3歲及以下ASD兒童DQ、CNBS-R2016粗大運(yùn)動(dòng)、精細(xì)運(yùn)動(dòng)、語言評分呈正相關(guān),與K-ABC評分、ADOS-S評分呈負(fù)相關(guān)性,提示血清FABP4水平與≤3歲ASD患兒的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)發(fā)育水平密切相關(guān)。筆者不僅獲得了FABP4作為ASD發(fā)病基礎(chǔ)因子和早期診斷生物標(biāo)志物的潛力數(shù)據(jù),也可能為ASD“脂肪腦軸”假說提供了部分循證醫(yī)學(xué)支持。

全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)報(bào)道了ASD和肥胖的遺傳風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)的重疊[15,16]。此外,低出生體重會(huì)增加患ASD的風(fēng)險(xiǎn)[17]。作為一種新型脂肪因子,FABP4則已被證明與脂質(zhì)代謝紊亂、糖尿病和肥胖癥密切相關(guān)[18-20]。FABP4是脂肪酸結(jié)合蛋白質(zhì)家族的一員,已被鑒定為與多種疏水化合物(如長鏈脂肪酸、各種環(huán)氧合酶和脂氧合酶代謝產(chǎn)物)相關(guān)的外周膜蛋白[21]。其他研究表明,脂肪細(xì)胞分化過程中FABP4表達(dá)增加,而長鏈脂肪酸(long-chain fatty acid,LCFA)、氧化低密度脂蛋白、過氧化物酶體增殖物激活受體γ和胰島素都可以改變FABP4活性[19]。FABP4被認(rèn)為是一種脂質(zhì)伴侶,因?yàn)樗哂袑CFA與高親和力結(jié)合以提高其溶解度并在膜和細(xì)胞器之間穿梭的特性[9]。因此,FABP4可影響脂肪酸的攝取、運(yùn)輸、酯化和β-氧化,并調(diào)節(jié)體內(nèi)的能量平衡和脂質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。FABP4還將脂肪酸輸送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核,以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和脂質(zhì)介導(dǎo)的信號傳遞,并調(diào)節(jié)酶的活性和生物膜的合成[10]。對于ASD兒童,除了社交能力和溝通能力持續(xù)不足,以及行為和興趣的受限和重復(fù)模式等核心特征外,也會(huì)逐漸影響胃腸、免疫、肝臟和內(nèi)分泌系統(tǒng)。既往有研究發(fā)現(xiàn)3～12歲ASD兒童血液中的FABP4水平比其他兒童低得多[9]。這與本研究結(jié)果基本一致。本研究還發(fā)現(xiàn),≤3歲的ASD兒童血清FABP4水平也明顯低于正常發(fā)育兒童,且與血清瘦素和血清游離脂肪酸呈正相關(guān),這表明ASD兒童可能普遍具有低血清FABP4水平,并且在脂肪代謝紊亂中與瘦素、游離脂肪酸水平協(xié)同變化。此外,本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)血清FABP4水平與K-ABC評分、ADOS-S評分呈負(fù)相關(guān)性,而且ROC曲線也支持了FABP4作為ASD早期診斷生物標(biāo)志物的潛力。

表3 單因素logistic回歸分析血清脂肪酸結(jié)合蛋白4水平與自閉癥譜系障礙患兒神經(jīng)發(fā)育障礙的關(guān)系

FAs從血液到大腦的運(yùn)輸失調(diào)可能在ASD的病理生理中起著潛在的作用[9,22]。FABP超家族的另一成員FABP5在腦內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá),參與22碳六烯酸的攝取和隨后的血腦屏障運(yùn)輸[22]。而FABP4在同一細(xì)胞群中表達(dá)[9]。因此,筆者推測FABP4可能也在ASD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。它可能參與了FAs在血腦屏障中的轉(zhuǎn)運(yùn),并可能影響神經(jīng)運(yùn)動(dòng)發(fā)育,這一點(diǎn)已在精神分裂癥患者中得到證實(shí)[23,24]。此外,既往報(bào)道顯示腦表達(dá)的FABP基因(FABP3、FABP5和FABP7)的遺傳變異參與了ASD和精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制[9,25]。先前研究還發(fā)現(xiàn),FABP4錯(cuò)義突變會(huì)影響配體結(jié)合[9]。而且Maekawa等[9]也報(bào)道了與野生型小鼠相比,FABP4基因敲除小鼠對陌生小鼠的交流互動(dòng)更少,且在空間學(xué)習(xí)和記憶方面有更多困難,證實(shí)了FABP4對ASD發(fā)病機(jī)制的遺傳貢獻(xiàn)。因此,我們推測外周FABP4可能通過改變腦內(nèi)脂肪酸組成間接參與了ASD的發(fā)病機(jī)制。據(jù)報(bào)道,出生后的前3年是突觸形成的高峰期[26]。有證據(jù)證明,神經(jīng)元增殖、髓鞘形成和突觸形成等生理過程對大腦的神經(jīng)發(fā)育非常重要[27]。在之前的一項(xiàng)大規(guī)模外顯子組測序研究中,在ASD患者中發(fā)現(xiàn)了FABP4的從頭錯(cuò)義變異[28]。他們通過外顯子組測序鑒定了102個(gè)ASD風(fēng)險(xiǎn)基因,其中大多數(shù)參與突觸功能和基因表達(dá)調(diào)控[13]。而FABP4與這102個(gè)候選物之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示,FABP4與CREBBP、MED13L、PTEN和NCOA1相互作用[4,13]。這表明FABP4相關(guān)網(wǎng)絡(luò)在ASD神經(jīng)發(fā)育機(jī)制中具有潛在作用。本研究也進(jìn)一步探討了血清FABP4水平與ASD神經(jīng)發(fā)育水平之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),血清FABP4水平≤3歲ASD患兒的DQ、粗大運(yùn)動(dòng)、精細(xì)運(yùn)動(dòng)、語言評分呈正相關(guān),且血清FABP4水平是影響ASD患兒神經(jīng)發(fā)育障礙的獨(dú)立保護(hù)因素。本研究結(jié)果表明,血清FABP4與ASD兒童的認(rèn)知功能密切相關(guān),而且相對較高的FABP4水平可能對ASD兒童的神經(jīng)發(fā)育更有益。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了ASD“脂肪-腦軸”的假說。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)≤3歲ASD兒童血清FABP4水平低于正常發(fā)育兒童,且低血清FABP4水平與ASD兒童神經(jīng)發(fā)育不良有關(guān)。對于≤3歲兒童,血清FABP4可能是用于ASD診斷和預(yù)測神經(jīng)發(fā)育不良風(fēng)險(xiǎn)的候選生物標(biāo)志物。本研究存在一些局限性,如樣本量較小,且FABP4在ASD中的具體作用機(jī)制仍未闡明,需要進(jìn)行前瞻性和隨機(jī)對照試驗(yàn),以進(jìn)一步觀察FABP4在ASD中的潛在作用。