• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    石榴皮多酚通過(guò)調(diào)控miR-4316表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)研究

    2023-10-18 08:47:46施勝鈺王旭文趙良偉杜燕青江明劉重斌
    新中醫(yī) 2023年19期
    關(guān)鍵詞:石榴皮湖州劃痕

    施勝鈺,王旭文,趙良偉,杜燕青,江明,劉重斌

    1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院普外科,浙江 湖州 313000

    2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院泌尿外科,浙江 湖州 313000

    3. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院麻醉科,浙江 湖州 313000

    4. 湖州師范學(xué)院,浙江 湖州 313000

    2020 年全球肺癌新發(fā)病例超220 例,死亡病例達(dá)179 萬(wàn)例,肺癌是全球癌癥致死的首位原因[1]。盡管肺癌的診斷方法、手術(shù)技術(shù)和化療方案不斷進(jìn)展,但由于腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高,其5 年生存率仍然較低[2]。微小RNA(miRNA)是在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮作用的小型非編碼RNA,研究報(bào)道m(xù)iRNA 異常表達(dá)與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程相關(guān),是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[3]。胃癌中miR-4316 表達(dá)降低,上調(diào)miR-4316 通過(guò)降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)表達(dá)可抑制胃癌遷移和集落形成能力[4]。膀胱癌中miR-4316 具有抑癌作用,長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)鈣調(diào)素類(lèi)蛋白樣3 基因反義RNA1(CALML3-AS1)通過(guò)抑制miR-4316 表達(dá)促進(jìn)膀胱癌發(fā)生[5]。然而,miR-4316 在肺癌中的作用仍有待闡明。石榴皮多酚廣泛存在于石榴的皮、果肉和籽中,具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、抗炎等有益作用[6-7]。研究報(bào)道石榴皮多酚具有抵抗前列腺癌及乳腺癌的作用,可能與石榴皮多酚對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定抑制作用有關(guān),且可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8-9]。但石榴皮多酚在肺癌中的抗癌作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究首先分析了miR-4316 在肺癌中的表達(dá)作用,并探索石榴皮多酚是否通過(guò)調(diào)控miR-4316 表達(dá)在肺癌中發(fā)揮抗肺癌功能。

    1 材料與方法

    1.1 組織來(lái)源將浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院2018 年1 月—2019 年12 月行手術(shù)切除的45 例肺癌患者及癌旁組織納入研究(男25 例,女20 例;年齡48~75 歲,中位年齡57 歲),排除術(shù)前進(jìn)行放射治療及化學(xué)治療的患者。所有組織保存在液氮中直到使用。樣本采集和使用均獲得書(shū)面知情同意。本研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號(hào):2021-041-A)。

    1.2 細(xì)胞及試劑肺癌A549 細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)、RPMI-1640 培養(yǎng)基、RIPA 緩沖液購(gòu)自北京索萊寶生物公司;miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA 熒光定量專(zhuān)用預(yù)混劑購(gòu)自南京諾唯贊生物公司;miRNA 模擬物(mimics)、miRNA 抑制物(anti-miRNA)及各自陰性對(duì)照(miR-NC、anti-miR-NC)、Trizol 試劑購(gòu)自上海生工生物公司;Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)BD 公司;脂質(zhì)體2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司;一抗和酶標(biāo)二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。

    1.3 方法

    1.3.1 RT-qPCR 檢測(cè)miR-4316 表達(dá)用Trizol 試劑從肺癌組織中提取總RNA,以總RNA 為模板通過(guò)miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA 反轉(zhuǎn)錄。采用miRNA 熒光定量專(zhuān)用預(yù)混劑進(jìn)行RT-qPCR。U6 作為miR-4316 的內(nèi)參,用相對(duì)定量方法(2-ΔΔCt)計(jì)算miR-4316 表達(dá)量。miR-4316 上游引物5′-AAC GAG ACG ACG ACA GAC-3′,下游引物5′-GGT GAG GCT AGC TGG TG-3′;U6 上游引物5′-AAC GAG ACG ACG ACA GAC-3′,下游引物5′-GCA AAT TCG TGA AGC GTT CCA TA-3′。

    1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組A549 細(xì)胞在含10%胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)基置于含5%CO2、95%濕度、37 ℃溫箱孵育,細(xì)胞80%匯合時(shí)1∶3 傳代。取對(duì)數(shù)期A549 細(xì)胞按照2×104個(gè)/孔接種24 孔板,在細(xì)胞50%匯合時(shí)用脂質(zhì)體2000 將miR-NC、miR-4316 mimics 分別轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞以上調(diào)miR-4316 表達(dá),分為miR-NC 組、miR-4316 組。同時(shí),將antimiR-NC、anti-miR-4316 分別轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞,收集轉(zhuǎn)染48 h 細(xì)胞備用。參照王春梅等[9]實(shí)驗(yàn)方法制備石榴皮多酚,用含0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL 石榴皮多酚的培養(yǎng)液分別孵育A549 細(xì)胞72 h,依次記為對(duì)照組、石榴皮多酚-低組、石榴皮多酚-中組、石榴皮多酚-高組。用含2 mg/mL 石榴皮多酚的培養(yǎng)液分別孵育轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、antimiR-4316 的A549 細(xì)胞72 h,依次記為石榴皮多酚+anti-miR-NC 組、石榴皮多酚+anti-miR-4316 組。

    1.3.3 CCK-8 檢測(cè)未轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-4316 mimics、anti-miR-NC 或antimiR-4316 的A549 細(xì)胞接種96 孔板,貼壁后,按照1.3.2 分組,首先進(jìn)行72 h 的石榴皮多酚的培養(yǎng)液孵育,然后進(jìn)行2 h CCK-8(濃度10%)培養(yǎng)液孵育,吸光度(A)用分光光度計(jì)在450 nm 下測(cè)定。抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)A/對(duì)照A)×100%。

    1.3.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)每組取5×102個(gè)細(xì)胞接種6 孔板,37 ℃培養(yǎng)2 周后,用甲醇固定細(xì)胞集落,結(jié)晶紫染色20 min,計(jì)數(shù)大于50 個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)。

    1.3.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)將各組細(xì)胞接種于6 孔板,細(xì)胞單層采用移液槍頭劃傷(10 μL),然后細(xì)胞采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進(jìn)行2 次清洗,清洗完畢在培養(yǎng)基(無(wú)血清)中孵育48 h。在測(cè)量開(kāi)始及24 h 后以顯微鏡對(duì)劃痕寬度進(jìn)行拍照測(cè)量,劃痕愈合率(%)=(初始劃痕寬度-24 h 劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%。

    1.3.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)侵襲實(shí)驗(yàn):準(zhǔn)備好無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞懸液(2×105個(gè)細(xì)胞)后進(jìn)行細(xì)胞接種,并將劑量為200 μL 的血清培養(yǎng)液置入其下室,共同置入培育箱,持續(xù)24 h 后完成培養(yǎng)液丟棄操作后將濃度為4%多聚甲醛置入并完成固定,染色劑采用結(jié)晶紫染色液,染色劑使用劑量為400 μL,濃度為0.5%,顯微鏡儀器對(duì)被侵襲的細(xì)胞進(jìn)行觀察并記錄數(shù)量。

    1.3.7 Western Blot 檢測(cè)MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)向各組細(xì)胞中加入RIPA 緩沖液,在冰上反應(yīng)30 min,蛋白離心和定量后,將上清液按照30 μg/泳道在SDS-PAGE 凝膠上分離進(jìn)行蛋白檢測(cè)。將蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF 膜,用5%脫脂牛奶在37 ℃下阻斷1 h,并暴露于MMP-2 兔多克隆抗體(ab37150)、MMP-9兔多克隆抗體(ab73734)、GAPDH 兔多克隆抗體(ab9485)中4 ℃孵育過(guò)夜。用山羊抗兔IgG 酶標(biāo)二抗(ab205718)在37 ℃下孵育1 h。洗膜3 次后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色,相對(duì)灰度值的檢測(cè)采用Image J 軟件。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以SPSS25.0 對(duì)本研究中所有統(tǒng)計(jì)資料進(jìn)行分析,確定符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,t檢驗(yàn)2 組間數(shù)據(jù),單因素方差檢驗(yàn)多組間數(shù)據(jù),LSD-t檢驗(yàn)組間數(shù)據(jù)比較。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-4316 在肺癌組織中的表達(dá)見(jiàn)表1。肺癌組織中miR-4316 表達(dá)較癌旁組織低(P<0.05)。

    表1 miR-4316 在肺癌組織中的表達(dá)()

    表1 miR-4316 在肺癌組織中的表達(dá)()

    注:①與癌旁組織比較,P<0.05

    ?

    2.2 miR-4316 過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌A549 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響見(jiàn)圖1~2、表2。與miR-NC 組比較,miR-4316 組A549 細(xì)胞抑制率、miR-4316 表達(dá)水平更高,克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)、MMP-2蛋白水平及MMP-9蛋白水平表達(dá)更低(P<0.05)。

    圖1 miR-4316 過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌A549 細(xì)胞克隆形成數(shù)、劃痕愈合率及侵襲數(shù)的影響(×100)

    圖2 miR-4316 過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌A549 細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    表2 miR-4316 過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌A549 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響()

    表2 miR-4316 過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌A549 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響()

    注:①與miR-NC 組比較,P<0.05

    ?

    2.3 石榴皮多酚對(duì)肺癌A549 細(xì)胞增殖的影響見(jiàn)表3。石榴皮多酚-低、中、高組A549 細(xì)胞抑制率均較對(duì)照組高,克隆形成數(shù)較對(duì)照組低(P<0.05),且具有劑量依賴(lài)性。

    表3 石榴皮多酚對(duì)肺癌A549 細(xì)胞增殖的影響()

    表3 石榴皮多酚對(duì)肺癌A549 細(xì)胞增殖的影響()

    注:①與對(duì)照組比較,P<0.05;②與石榴皮多酚-低組比較,P<0.05;③與石榴皮多酚-中組比較,P<0.05

    ?

    2.4 石榴皮多酚對(duì)肺癌A549 細(xì)胞遷移侵襲的影響見(jiàn)圖3、表4。石榴皮多酚-低、中、高組較對(duì)照組A549 細(xì)胞劃痕愈合率、侵襲數(shù)、MMP-2 蛋白水平、MMP-9 蛋白表達(dá)水平低(P<0.05)。

    圖3 石榴皮多酚對(duì)肺癌A549 細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    表4 石榴皮多酚對(duì)肺癌A549 細(xì)胞遷移侵襲的影響()

    注:①與對(duì)照組比較,P<0.05;②與石榴皮多酚-低組比較,P<0.05;③與石榴皮多酚-中組比較,P<0.05

    ?

    2.5 石榴皮多酚對(duì)肺癌A549 細(xì)胞miR-4316 表達(dá)的影響見(jiàn)表5。石榴皮多酚-低、中、高組A549細(xì)胞miR-4316 較對(duì)照組高(P<0.05)。

    表5 石榴皮多酚對(duì)肺癌A549細(xì)胞miR-4316表達(dá)的影響()

    注:①與對(duì)照組比較,P<0.05;②與石榴皮多酚-低組比較,P<0.05;③與石榴皮多酚-中組比較,P<0.05

    ?

    2.6 下調(diào)miR-4316 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了石榴皮多酚(2mg/mL)對(duì)肺癌A549 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用見(jiàn)圖4、表6。石榴皮多酚+anti-miR-4316 組A549 細(xì)胞抑制率、miR-4316 表達(dá)水平較石榴皮多酚+anti-miR-NC組低(P<0.05),克隆形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)、MMP-2 蛋白水平、MMP-9 蛋白表達(dá)水平較石榴皮多酚+anti-miR-NC 組高(P<0.05)。

    圖4 下調(diào)miR-4316表達(dá)逆轉(zhuǎn)了石榴皮多酚對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

    表6 下調(diào)miR-4316表達(dá)逆轉(zhuǎn)了石榴皮多酚對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用()

    表6 下調(diào)miR-4316表達(dá)逆轉(zhuǎn)了石榴皮多酚對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用()

    注:①與石榴皮多酚+anti-miR-NC 組比較,P<0.05

    ?

    3 討論

    研究表明miR-4316 在乳腺癌組織表達(dá)降低,沉默環(huán)狀RNA 肌凝蛋白9B(circMYO9B)通過(guò)增加miR-4316 表達(dá)能夠延緩腫瘤生長(zhǎng),抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[10]。甲狀腺癌組織中miR-4316 水平表達(dá)低,有利于甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、周期進(jìn)展及侵襲[11]。在肝癌中miR-4316 低表達(dá)還參與細(xì)胞的增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移[12]。此外,結(jié)直腸癌患者外周血中miR-4316 表達(dá)升高可能是其早期診斷標(biāo)志物[13]。本研究檢測(cè)到肺癌組織中miR-4316 表達(dá)下調(diào),這暗示miR-4316 低表達(dá)可能參與肺癌進(jìn)展。功能測(cè)定顯示,過(guò)表達(dá)miR-4316 可降低肺癌細(xì)胞克隆形成能力,抑制細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。MMP-2 和MMP-9 是Ⅳ型膠原降解酶,其能破壞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲,MMP-2 和MMP-9 表達(dá)上調(diào)與肺癌等多種人類(lèi)癌癥的高轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)[14-15]。本研究中過(guò)表達(dá)miR-4316 顯著抑制MMP-2 和MMP-9 表達(dá),這與其抗轉(zhuǎn)移作用吻合,表明miR-4316 在肺癌中發(fā)揮抑癌功能。

    石榴皮多酚具有抗增殖、抗血管生成、抗炎、抗轉(zhuǎn)移等抑癌活性,研究報(bào)道從石榴中提取的多種多酚可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞毒性,抑制細(xì)胞侵襲和遷移能力[16]。石榴皮多酚通過(guò)調(diào)節(jié)雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/S6K 信號(hào)通路來(lái)抑制前列腺癌細(xì)胞遷移和集落形成[17]。石榴皮多酚還通過(guò)阻斷肝癌細(xì)胞周期進(jìn)展和誘導(dǎo)線粒體凋亡,抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[18]。此外,有報(bào)道稱(chēng)低劑量的石榴皮多酚對(duì)卵巢癌細(xì)胞亦具有較強(qiáng)抗增殖作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)石榴皮多酚以劑量依賴(lài)方式降低肺癌細(xì)胞克隆形成能力,抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,同時(shí)下調(diào)MMP-2 和MMP-9 表達(dá)水平,這提示石榴皮多酚具有抗肺癌功能。近年研究表明,miRNA 與中藥有效成分的抗腫瘤作用密切相關(guān)[20-21]。例如,氧化苦參通過(guò)促進(jìn)miR-367-3p 表達(dá)來(lái)抑制肺癌進(jìn)展[22]。黃芩苷通過(guò)影響miR-126 的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[23]。本研究發(fā)現(xiàn)石榴皮多酚處理后肺癌細(xì)胞miR-4316 表達(dá)顯著增加,提示miR-4316 可能是石榴皮多酚防治肺癌的新靶標(biāo)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),下調(diào)miR-4316 表達(dá)顯著減弱石榴皮多酚處理對(duì)肺癌細(xì)胞克隆形成、MMP-2 及MMP-9表達(dá),還可以抑制細(xì)胞的遷移、增殖及侵襲,說(shuō)明抑制肺癌的發(fā)展可以通過(guò)石榴皮多酚上調(diào)miR-4316表達(dá)來(lái)完成。但是否有其他miRNA 介導(dǎo)石榴皮多酚的抗癌作用仍需要不斷探索。

    綜上所述,石榴皮多酚通過(guò)上調(diào)miR-4316 表達(dá)來(lái)抑制肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為,這些發(fā)現(xiàn)確定了石榴皮多酚和miR-4316 之間的新關(guān)系,為石榴皮多酚在肺癌治療中的應(yīng)用提供重要依據(jù),也可能為抗肺癌藥物開(kāi)發(fā)提供新思路。

    猜你喜歡
    石榴皮湖州劃痕
    石榴皮可治腹瀉
    石榴皮可治腹瀉
    富馬酸盧帕他定治療皮膚劃痕癥的療效觀察
    冰上芭蕾等
    石榴皮驗(yàn)方四則
    湖州出土郡國(guó)五銖錢(qián)
    犀利的眼神
    湖州特色小鎮(zhèn)的“特”與“色”
    超聲波輔助提取干制石榴皮多酚工藝研究
    光滑表面淺劃痕對(duì)光反射特性
    婷婷成人精品国产| 久久久久久久久免费视频了| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产精品蜜桃在线观看| 99国产精品免费福利视频| 欧美在线一区亚洲| xxx大片免费视频| 99九九在线精品视频| 一级黄片播放器| 丁香六月天网| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久天堂一区二区三区四区| av网站在线播放免费| 日本av手机在线免费观看| 咕卡用的链子| 日本91视频免费播放| 久久天堂一区二区三区四区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 一级毛片电影观看| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美在线黄色| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲成国产人片在线观看| 99久久综合免费| 久久久久久久国产电影| 国产一区二区三区综合在线观看| 99热国产这里只有精品6| 青青草视频在线视频观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 一区二区日韩欧美中文字幕| 伊人亚洲综合成人网| 国产一区亚洲一区在线观看| av不卡在线播放| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲第一区二区三区不卡| 色婷婷av一区二区三区视频| 色播在线永久视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 老司机影院毛片| 免费在线观看黄色视频的| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美 日韩 精品 国产| 久久av网站| 一级片免费观看大全| 少妇的丰满在线观看| 精品国产国语对白av| 免费看av在线观看网站| 九草在线视频观看| 日韩制服骚丝袜av| 精品卡一卡二卡四卡免费| 妹子高潮喷水视频| 成年人免费黄色播放视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| www.精华液| 亚洲精品日本国产第一区| tube8黄色片| 亚洲成人av在线免费| 久久久久精品久久久久真实原创| 午夜日韩欧美国产| av在线老鸭窝| 国产成人精品久久久久久| 中国三级夫妇交换| 老司机影院成人| 在线观看人妻少妇| 精品国产乱码久久久久久男人| 日韩制服骚丝袜av| 欧美国产精品va在线观看不卡| 99久久人妻综合| 国产成人精品福利久久| 国产麻豆69| 久久97久久精品| 激情视频va一区二区三区| 国产精品国产av在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 丰满乱子伦码专区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 婷婷色av中文字幕| 久久久久久久国产电影| 久久人人97超碰香蕉20202| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 在线 av 中文字幕| 国产 精品1| 一级a爱视频在线免费观看| 美国免费a级毛片| 久久精品国产综合久久久| 一区二区三区乱码不卡18| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美人与性动交α欧美软件| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 中文字幕制服av| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲av在线观看美女高潮| 熟女av电影| 只有这里有精品99| 丁香六月欧美| 涩涩av久久男人的天堂| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久久精品94久久精品| 婷婷成人精品国产| 叶爱在线成人免费视频播放| 一边亲一边摸免费视频| 国产亚洲一区二区精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 精品午夜福利在线看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 欧美在线黄色| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲情色 制服丝袜| 天堂俺去俺来也www色官网| 尾随美女入室| 视频区图区小说| 精品卡一卡二卡四卡免费| 涩涩av久久男人的天堂| 国产精品 国内视频| 欧美国产精品一级二级三级| 韩国高清视频一区二区三区| 久久久久久久久久久免费av| 日韩av免费高清视频| a 毛片基地| 少妇被粗大的猛进出69影院| 波多野结衣一区麻豆| 一二三四中文在线观看免费高清| 日本欧美视频一区| 街头女战士在线观看网站| 一区二区三区四区激情视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久久久久久久免费视频了| 新久久久久国产一级毛片| 免费观看av网站的网址| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 免费黄色在线免费观看| 国产成人精品福利久久| 啦啦啦在线观看免费高清www| 9热在线视频观看99| av视频免费观看在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 看免费av毛片| 亚洲第一av免费看| 国产一区二区三区av在线| 大片免费播放器 马上看| 波多野结衣av一区二区av| 男女免费视频国产| 校园人妻丝袜中文字幕| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲人成电影观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产xxxxx性猛交| a级毛片在线看网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久99精品国语久久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产极品天堂在线| 好男人视频免费观看在线| 国产又爽黄色视频| 日本色播在线视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲熟女毛片儿| 看十八女毛片水多多多| 男女国产视频网站| videos熟女内射| 一级片免费观看大全| 日韩成人av中文字幕在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲情色 制服丝袜| 99久久人妻综合| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 少妇精品久久久久久久| 制服诱惑二区| 9热在线视频观看99| 国产探花极品一区二区| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲精品国产av蜜桃| 男女之事视频高清在线观看 | 亚洲精品av麻豆狂野| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产免费视频播放在线视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 99香蕉大伊视频| 日本vs欧美在线观看视频| xxxhd国产人妻xxx| 好男人视频免费观看在线| 晚上一个人看的免费电影| 尾随美女入室| 国产精品国产三级专区第一集| 一级毛片电影观看| 下体分泌物呈黄色| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 最新在线观看一区二区三区 | 婷婷色综合大香蕉| 久久综合国产亚洲精品| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产av码专区亚洲av| 99久久精品国产亚洲精品| 日日爽夜夜爽网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美日韩成人在线一区二区| 曰老女人黄片| 国产av精品麻豆| 久久ye,这里只有精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品国产国语对白av| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 啦啦啦在线观看免费高清www| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲视频免费观看视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲国产成人一精品久久久| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产 精品1| 久久精品国产a三级三级三级| 午夜福利网站1000一区二区三区| 男男h啪啪无遮挡| 欧美黑人精品巨大| 少妇的丰满在线观看| 丝袜在线中文字幕| 又大又爽又粗| 国产成人免费无遮挡视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 波多野结衣一区麻豆| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲中文av在线| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 男人操女人黄网站| 欧美精品亚洲一区二区| 最近中文字幕2019免费版| 男女国产视频网站| 中文字幕亚洲精品专区| 母亲3免费完整高清在线观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 人妻 亚洲 视频| e午夜精品久久久久久久| 亚洲精品在线美女| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久韩国三级中文字幕| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日本vs欧美在线观看视频| 性色av一级| 久久精品国产亚洲av高清一级| av国产精品久久久久影院| 午夜免费观看性视频| 亚洲av男天堂| av线在线观看网站| 99精品久久久久人妻精品| 97人妻天天添夜夜摸| 成人亚洲欧美一区二区av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲欧美色中文字幕在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 免费看av在线观看网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 丰满少妇做爰视频| 亚洲中文av在线| 国产一区二区 视频在线| 亚洲第一av免费看| 少妇的丰满在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| av在线观看视频网站免费| 不卡av一区二区三区| 精品酒店卫生间| 中文字幕最新亚洲高清| 9色porny在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 亚洲综合色网址| 国产爽快片一区二区三区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 五月天丁香电影| 黑丝袜美女国产一区| 人人澡人人妻人| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 大片电影免费在线观看免费| 欧美在线黄色| 国产男人的电影天堂91| 丁香六月天网| 七月丁香在线播放| av线在线观看网站| 精品国产一区二区久久| 中文字幕制服av| 久久性视频一级片| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲av欧美aⅴ国产| 无限看片的www在线观看| 国产免费现黄频在线看| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美人与善性xxx| 欧美国产精品一级二级三级| 久久久精品免费免费高清| 久久久久国产一级毛片高清牌| 韩国精品一区二区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 久久久精品区二区三区| 1024视频免费在线观看| 免费黄色在线免费观看| 亚洲av国产av综合av卡| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久久久精品人妻al黑| av国产精品久久久久影院| 午夜福利,免费看| 欧美另类一区| 人妻 亚洲 视频| 亚洲综合色网址| 一个人免费看片子| 久久久久国产一级毛片高清牌| 九九爱精品视频在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 丝袜脚勾引网站| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 三上悠亚av全集在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久青草综合色| 久久av网站| 久久午夜综合久久蜜桃| 深夜精品福利| 综合色丁香网| 黄色视频不卡| 91精品国产国语对白视频| 99国产精品免费福利视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产淫语在线视频| 免费av中文字幕在线| 在线观看免费视频网站a站| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产97色在线日韩免费| 亚洲欧美色中文字幕在线| 最近最新中文字幕免费大全7| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲国产av新网站| 国产乱人偷精品视频| 午夜老司机福利片| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 久久热在线av| 久久av网站| 两个人看的免费小视频| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产一卡二卡三卡精品 | 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 国产精品久久久av美女十八| 2018国产大陆天天弄谢| 午夜免费观看性视频| 国产精品三级大全| 亚洲精品一二三| av一本久久久久| 青春草视频在线免费观看| 一区二区av电影网| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产欧美亚洲国产| 欧美另类一区| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 免费黄网站久久成人精品| 在线观看免费日韩欧美大片| 在线 av 中文字幕| 欧美最新免费一区二区三区| 搡老乐熟女国产| 日韩电影二区| 日韩大片免费观看网站| 国产成人欧美| 黄频高清免费视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久毛片免费看一区二区三区| 精品国产一区二区久久| 少妇人妻精品综合一区二区| 久久女婷五月综合色啪小说| 日韩中文字幕视频在线看片| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产在线免费精品| av网站在线播放免费| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产熟女欧美一区二区| www.熟女人妻精品国产| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 丁香六月欧美| 青春草视频在线免费观看| 日韩伦理黄色片| 久久人人爽人人片av| 老司机影院毛片| 国精品久久久久久国模美| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 美女福利国产在线| 黄频高清免费视频| 国产精品免费视频内射| 人人澡人人妻人| 国产乱来视频区| 亚洲,欧美,日韩| 少妇的丰满在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 十分钟在线观看高清视频www| 青春草国产在线视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲精品,欧美精品| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 性高湖久久久久久久久免费观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 欧美 日韩 精品 国产| 中文天堂在线官网| 中文字幕高清在线视频| 亚洲视频免费观看视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 永久免费av网站大全| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 精品一品国产午夜福利视频| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 美女福利国产在线| 黑丝袜美女国产一区| 国产精品熟女久久久久浪| 久久久亚洲精品成人影院| 久久久精品区二区三区| 亚洲av成人精品一二三区| 久久久国产欧美日韩av| 国产精品免费大片| 91精品三级在线观看| 嫩草影院入口| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 激情视频va一区二区三区| 一区在线观看完整版| 三上悠亚av全集在线观看| 女人精品久久久久毛片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲 欧美一区二区三区| 天天添夜夜摸| 国产片特级美女逼逼视频| 午夜日本视频在线| 悠悠久久av| 少妇人妻久久综合中文| 秋霞伦理黄片| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲成人av在线免费| a级毛片黄视频| 大香蕉久久成人网| 韩国精品一区二区三区| 日韩av免费高清视频| 大陆偷拍与自拍| 丝袜美足系列| 国产福利在线免费观看视频| 美女国产高潮福利片在线看| 丝袜美腿诱惑在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 成年人免费黄色播放视频| 多毛熟女@视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 丝袜在线中文字幕| 国产极品天堂在线| 男男h啪啪无遮挡| 岛国毛片在线播放| 国产免费视频播放在线视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美日韩综合久久久久久| 青青草视频在线视频观看| 久热这里只有精品99| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 91aial.com中文字幕在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 男女下面插进去视频免费观看| 最近手机中文字幕大全| 黑丝袜美女国产一区| 丝袜美足系列| 国产一卡二卡三卡精品 | 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲第一区二区三区不卡| 一本久久精品| 欧美日韩综合久久久久久| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久久久久久久久久免费av| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲精品美女久久av网站| 久久久久久久精品精品| a级片在线免费高清观看视频| 一级毛片电影观看| 久久久欧美国产精品| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 狂野欧美激情性bbbbbb| 一区在线观看完整版| 丝袜喷水一区| 中文字幕最新亚洲高清| 老司机影院毛片| 久热爱精品视频在线9| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产淫语在线视频| 日日爽夜夜爽网站| 在线看a的网站| 热re99久久精品国产66热6| 精品久久久久久电影网| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 老鸭窝网址在线观看| 美女视频免费永久观看网站| xxx大片免费视频| 高清视频免费观看一区二区| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲av国产av综合av卡| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 一本久久精品| 黄片无遮挡物在线观看| 精品亚洲成国产av| 久久影院123| 国产精品av久久久久免费| 少妇 在线观看| 一区二区av电影网| 国产成人午夜福利电影在线观看| netflix在线观看网站| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲美女搞黄在线观看| svipshipincom国产片| 国产成人精品福利久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 精品一品国产午夜福利视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 日韩一本色道免费dvd| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 午夜久久久在线观看| videosex国产| 少妇人妻精品综合一区二区| e午夜精品久久久久久久| 亚洲第一青青草原| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| tube8黄色片| 久久久久久久精品精品| 欧美在线一区亚洲| 自线自在国产av| 一级毛片电影观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 丝袜脚勾引网站| 大香蕉久久成人网| 男人舔女人的私密视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 乱人伦中国视频| 操美女的视频在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 777米奇影视久久| 国产又色又爽无遮挡免| 国产99久久九九免费精品| 五月开心婷婷网| 中文字幕高清在线视频| av.在线天堂| 国产精品免费视频内射| 欧美精品一区二区免费开放| 国产精品一区二区精品视频观看| 午夜日本视频在线| 久久精品久久久久久久性| 亚洲熟女精品中文字幕| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 女人精品久久久久毛片| 久久婷婷青草| 两个人看的免费小视频| av有码第一页| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久免费观看电影| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产乱人偷精品视频| 亚洲综合色网址| 热99久久久久精品小说推荐| 看免费av毛片| 人体艺术视频欧美日本| 9热在线视频观看99| 久久精品亚洲av国产电影网| 午夜精品国产一区二区电影| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲国产欧美网| 国产福利在线免费观看视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 日本一区二区免费在线视频| 国产成人系列免费观看| 久久ye,这里只有精品| 啦啦啦 在线观看视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 91老司机精品| 午夜福利视频在线观看免费| 成人国产麻豆网| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产亚洲欧美精品永久| 国产毛片在线视频| 99久久综合免费| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产成人欧美| 国产熟女午夜一区二区三区|