全自動(dòng)QuEChERS結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中16種磺胺類殘留量

耿春輝，張嘉楠，王愛卿

（1.衡水市綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北 衡水 053000；2.秦皇島市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心，河北 秦皇島 066000；3.滄州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，河北 滄州 061000）

磺胺類抗生素（SAs）是一種人工合成的抗菌藥，是對(duì)具有氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱［1］，常作為飼料添加劑預(yù)防動(dòng)物疾病，但其進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的抗生素不能完全代謝，大部分以原型或代謝產(chǎn)物的形式隨動(dòng)物糞尿排出體外［2］，在環(huán)境中持續(xù)積累，形成了假性POPs 現(xiàn)象［3］。

畜禽糞便作為有機(jī)肥廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中［4］，使抗生素在植物內(nèi)大量積累，并通過(guò)食物鏈對(duì)動(dòng)物和人體產(chǎn)生毒害風(fēng)險(xiǎn)。由此可見，長(zhǎng)期大量施用高抗生素殘留的畜禽糞便已成為蔬菜生產(chǎn)中的不安全因素，研究蔬菜中抗生素殘留的健康風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題刻不容緩。

自動(dòng)QuEChERS 前處理設(shè)備是一款由自動(dòng)程序控制分析樣品制備的設(shè)備，將立體8 字震蕩和離心有機(jī)融為一體，通過(guò)配套試管的聯(lián)合使用有效實(shí)現(xiàn)了樣品中待測(cè)成分的提取、分離和轉(zhuǎn)移，提高了樣品的前處理效率。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于磺胺類抗生素殘留量的分析方法主要針對(duì)于動(dòng)物產(chǎn)品以及環(huán)境介質(zhì)，關(guān)于蔬菜中磺胺類藥物殘留量的檢測(cè)方法僅有少量文獻(xiàn)研究報(bào)道。

本研究針對(duì)畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中常用的磺胺類藥物，利用全自動(dòng)QuEChERS 技術(shù)結(jié)合LC-MS/MS 法檢測(cè)蔬菜中16 種磺胺類藥物殘留量。該方法自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好，能夠有效滿足蔬菜中磺胺類抗生素殘留量的快速篩查和定量工作需求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：SCIEX TripleQuad 5500 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)SCIEX 公司）以及MultiQuant 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，SiO-6512 自動(dòng)樣品制備系統(tǒng)（北京本立科技公司）。

試劑：乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)默克公司），甲酸、冰乙酸（色譜純，美國(guó)默克公司），分散固相萃取整合套管（北京本立科技公司），16 種磺胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（天津阿爾塔科技有限公司），成分明細(xì)見表1。

表1 16種磺胺的保留時(shí)間、質(zhì)譜參數(shù)、相關(guān)系數(shù)、平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

1.2 色譜條件

流動(dòng)相A：0.1%甲酸水。流動(dòng)相B：甲醇。梯度洗脫程序：0～0.5 min，2%B；0.5～1.5 min，2%～15%B；1.5～2.5 min，15%～40%B；2.5～8.0 min，40%～70%B；8.0～11.0 min，70%～98%B；11.0～13.0 min，98%B；13.1～15.0 min，2%B。色譜柱：ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl（2.1 mm×100 mm，1.7μm）。流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積2μL。

1.3 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源，正離子掃描模式。檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，離子源溫度550 ℃，噴霧電壓5 500 V，氣簾氣壓力206.8 kPa，霧化氣壓力413.7 kPa，輔助霧化氣壓力482.6 kPa，監(jiān)測(cè)離子對(duì)及其質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.4 樣品前處理

將粉碎后的新鮮蔬菜經(jīng)低溫冷凍干燥后過(guò)篩備用。準(zhǔn)確稱取2.0 g 蔬菜凍干粉于套管的外管中，加2%乙酸水5 mL 浸潤(rùn)30 min 后加入20 mL 乙腈、一包氧化鋯珠、鹽包（內(nèi)含5.5 g 無(wú)水硫酸鎂、1.5 g 氯化鈉、0.5 g 檸檬酸氫二鈉、1.0 g 檸檬酸鈉），將凈化內(nèi)管（100 mg PSA、30 mg GCB、600 mg MgSO4）插入外管中，旋渦混勻后放入全自動(dòng)樣品制備系統(tǒng)中處理。

處理完成后，從內(nèi)管中取清液2 mL，在40 ℃氮?dú)庀麓抵两桑褂?0%乙腈水1 mL 復(fù)溶，過(guò)0.22 μm 濾膜后供LC-MS/MS 測(cè)定。

2 結(jié)果分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用針泵注射直接進(jìn)樣的方式對(duì)16 種磺胺進(jìn)行優(yōu)化。參考?xì)W盟指令2002/657/EC，每個(gè)化合物選擇1 個(gè)母離子、2 個(gè)子離子作為定量與定性離子對(duì)，詳細(xì)質(zhì)譜參數(shù)見表1。本試驗(yàn)采用scheduled MRM 掃描方式，使每個(gè)色譜峰能夠采集15 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，確保定量的重復(fù)性和靈敏度。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)研究的16 種磺胺類抗生素中有5 種同分異構(gòu)體，因此色譜柱的選擇和色譜條件的優(yōu)化極為重要。嘗試使用沃特世的C18、T3 以及Fluoro-Phenyl 共3 種色譜柱對(duì)16 種磺胺進(jìn)行分離。結(jié)果顯示，C18、T3 和Fluoro-Phenyl 柱對(duì)其中的14 種磺胺類藥物均能實(shí)現(xiàn)良好的分離。在C18 和T3 柱上磺胺對(duì)甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶的色譜峰重合，嘗試調(diào)整液相色譜條件，均不能實(shí)現(xiàn)基線分離，而Fluoro-Phenyl 柱能夠較好地分離這2 種同分異構(gòu)體（見圖1）。本試驗(yàn)最終選擇Fluoro-Phenyl 柱。

圖1 磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺甲氧噠嗪在3種色譜柱上的色譜圖

為獲得最佳的分離效果和靈敏度，比較了0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇和0.2%甲酸水-甲醇3 組流動(dòng)相。結(jié)果表明，在0.1%甲酸水-甲醇組成的流動(dòng)相中，16 種磺胺類藥物具有較好的峰形和較高的響應(yīng)值，因此本試驗(yàn)最終選擇了0.1%甲酸水-甲醇作為流動(dòng)相。

2.2 樣品狀態(tài)對(duì)結(jié)果的影響

磺胺類藥物是兩性化合物，提取時(shí)可通過(guò)控制樣品提取液pH 值為2～3，使其氨基質(zhì)子化。測(cè)定新鮮蔬菜樣品時(shí)，提取溶液的pH 值會(huì)因樣品基質(zhì)種類的不同而產(chǎn)生較大波動(dòng)，導(dǎo)致回收率為31.7%～62.8%。使用蔬菜凍干粉，加入乙酸水水化，結(jié)合鹽包中的緩沖鹽，可形成緩沖溶液，抑制樣品基質(zhì)對(duì)提取液pH 值的影響，有效提高提取效率，回收率能達(dá)到62.3%～88.7%。

2.3 加水體積優(yōu)化

由于蔬菜凍干粉含水量低，直接用有機(jī)溶劑難以將目標(biāo)物全部提取出來(lái)，必須加入一定量的水。稱取2 g 凍干粉，分別加入2、5、10 mL 的2%乙酸水溶液，震蕩浸泡30 min。結(jié)果顯示，使用2 mL 乙酸水浸泡時(shí)，不能將樣品完全溶解，仍有蔬菜粉浮在表面，經(jīng)乙腈提取后，其測(cè)定結(jié)果較5 mL 時(shí)平均低了12.6%～35.6%；使用15 mL 乙酸水時(shí)，20 mL 乙腈不能完全將其提取出來(lái)，需要用乙腈重復(fù)提取才能達(dá)到效果。因此，最終確定樣品量為2 g 時(shí)，加水體積為5 mL。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

QuEChERS 方法中常用的吸附劑有PSA、C18及GCB 等。試驗(yàn)以芹菜為基質(zhì)，在20 μg/kg 的水平下考察不同量的吸附劑對(duì)回收率的影響。結(jié)果表明，PSA 的加入量在50～200 mg 時(shí)，回收率無(wú)明顯變化；C18使用量的變化對(duì)16 種磺胺無(wú)明顯影響，對(duì)基質(zhì)效應(yīng)也沒有明顯影響。隨著GCB 使用量的增加，16 種磺胺的回收率減少了1.84%～24.50%，但考慮到色素對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響，最終確定了GCB的使用量為30 mg。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性關(guān)系與定量限

配制5～100 μg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析測(cè)定，以各組分的峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。16 種磺胺具有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均≥0.998（見表1）?？紤]到磺胺類藥物在動(dòng)物性食品中最低的殘留限量為25 μg/kg 和方法稀釋倍數(shù)，最終確定了16 種磺胺類藥物的方法定量限（LOQ）為5 μg/kg。

2.5.2 回收率與精密度

取結(jié)球甘藍(lán)、芹菜、番茄、馬鈴薯4 種樣品，在5、10 和100 μg/kg 的水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平平行測(cè)定6 次。16 種藥物的平均加標(biāo)回收率62.3%～88.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.58%～11.26%。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

選擇結(jié)球甘藍(lán)、芹菜、番茄、馬鈴薯用于評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。將空白樣品按照一定的方法處理，分別用基質(zhì)空白液作為溶劑，配制質(zhì)量濃度為10μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其峰面積A；以10%乙腈水溶液作為溶劑，配制質(zhì)量濃度為10μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其峰面積B，公式如下。

根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱，將其分為3 類，即ME（%）值低于-20%為基質(zhì)抑制，-20%～20%為弱基質(zhì)效應(yīng)，大于20%為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。

由圖2 可知，16 種農(nóng)藥在甘藍(lán)、芹菜、番茄和馬鈴薯中多數(shù)呈現(xiàn)弱基質(zhì)抑制效應(yīng)。

圖2 16種磺胺類藥物在4種蔬菜基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

2.7 實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)采集的106 批蔬菜樣品進(jìn)行檢測(cè)，有7 批樣品中共檢出3 種磺胺類藥物，分別為磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺嘧啶，平均含量為16.7、11.8、4.8 ug/kg。長(zhǎng)期大量施用高抗生素殘留的畜禽糞便已成為蔬菜生產(chǎn)中的不安全因素。

3 討論

文章采用全自動(dòng)QuEChERS 前處理設(shè)備對(duì)蔬菜樣品進(jìn)行提取和凈化，建立了檢測(cè)蔬菜中16 種磺胺類藥物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。本方法自動(dòng)化程度高，批量處理樣品耗時(shí)短，相對(duì)于傳統(tǒng)的QuEChERS 方法具有更高的批間精密度，操作簡(jiǎn)便，大大降低了檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量對(duì)操作人員技術(shù)水平的依賴，提高了工作效率，為快速測(cè)定蔬菜中磺胺類藥物殘留提供了技術(shù)手段。