基于非依賴數(shù)據(jù)采集的呼出氣冷凝液蛋白質(zhì)組加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析

馬 琳， 孫東曉， 鎮(zhèn)華君， 修光利

（1. 華東理工大學(xué)國家環(huán)境保護化工過程環(huán)境風(fēng)險評價與控制重點實驗室, 上海 200237；2. 賓夕法尼亞州立大學(xué)醫(yī)學(xué)院質(zhì)譜中心, 美國 PA 17033）

呼出氣冷凝液（Exhaled Breath Condensate，EBC）是一種來自于下呼吸道的襯液，常被用作肺部疾病研究的載體，尤其是EBC 的蛋白組學(xué)更是國內(nèi)外研究熱點[1]。EBC 的收集過程簡便、無創(chuàng)，攜帶著大量的生理信息，理想情況下可以通過研究EBC 的蛋白組成來探究肺癌等相關(guān)肺部疾病的內(nèi)在生物學(xué)特征，有利于提高對疾病的認知，并助益于疾病的診察[2-3]。

隨著質(zhì)譜儀器的更新發(fā)展，蛋白組學(xué)技術(shù)也相應(yīng)得到提高，進一步促進了蛋白質(zhì)組在生物標志物方面的應(yīng)用。以往研究中對EBC 蛋白組學(xué)的探索雖然從未間斷，成果卻十分有限，這主要是因為EBC 中極其微量的蛋白濃度無法使用一般的質(zhì)譜方法進行解析，尤其是對于大量低豐度蛋白，往往會因高豐度蛋白的掩蓋而被忽略，這嚴重限制了EBC 蛋白組學(xué)的發(fā)展[4]。絕大多數(shù)研究都是用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS）來進行EBC 蛋白組學(xué)研究，在LC-MS/MS 分析中，數(shù)據(jù)采集策略會對鑒定結(jié)果造成顯著的影響[3]。數(shù)據(jù)相關(guān)采集（Data-Dependent Acquisition，DDA）是常用的采集策略之一，但DDA的采集策略是有偏倚的，對前體信號強的碎片進行選擇性捕獲，對于信號較弱的離子捕獲性不強[4]。數(shù)據(jù)獨立采集（Data-Independent Acquisition，DIA）是一種最新發(fā)展的數(shù)據(jù)采集技術(shù)，不同于DDA 的信號捕集策略，DIA 會對所有的離子信號進行捕獲，在二級質(zhì)譜（MS2）掃描階段進行全窗口的掃描，對信號強度沒有依賴，這樣得到的信息避免了選擇性缺失，并高度可重復(fù)[5]。將DIA 方法運用到EBC 蛋白組學(xué)研究中，可以大大提高蛋白質(zhì)的鑒定水平，是研究EBC 蛋白組學(xué)的理想工具。

加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（Weighted Gene Coexpression Network Analysis，WGCNA），是在傳統(tǒng)生物信息學(xué)分析上衍生出的多維分析[6]。WGCNA 是一種全新的算法，其邏輯在于蛋白質(zhì)是無尺度分布的，不是單獨的個體，而是以組群的方式存在，根據(jù)不同的表達模式，劃分為不同的模塊（module）。在生物學(xué)分析的過程中，以模塊為單位進行聚類分析，將不同模塊之間的關(guān)系、不同性狀之間的關(guān)系連結(jié)起來，來篩選重要模塊蛋白，這些模塊蛋白往往具有最顯著的生物功能，在疾病研究中用來篩選生物標記物和治療靶點[7]。

目前，國內(nèi)外鮮見使用DIA 方法進行EBC 蛋白組學(xué)分析，并使用WGCNA 算法分析其生物功能的研究。本文使用DIA 分析EBC 蛋白組成分，在此基礎(chǔ) 上 結(jié) 合WGCNA 和Gene Ontology（GO）分 析、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析、Protein-Protein Interactions（PPIs），探討了WGCNA結(jié)合蛋白組學(xué)在實際應(yīng)用中的價值。

1 實驗部分

1.1 主要材料與試劑

胰蛋白酶（Trypsin）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide ，IAA）、尿素（Urea ，UA）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；iRT 標準肽段購自瑞士Biognosys 公司；甲酸購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；10 kDa 超濾膜購自默克密理博實驗室設(shè)備（上海）有限公司；RTube 購自美國Respiratory Research Inc 公司。

1.2 納入人群

本研究共納入30 名受試者，包括10 名肺癌患者（Lung Cancer，LC）、10 名 良 性 肺 部 疾 病 患 者（Pulmonary Nodules，PN）和10 名健康對照（Healthy Controls，H）。樣本于2018 年4 月至2018 年7 月在上海胸科醫(yī)院采集，所有EBC 樣本在上午8 點至9 點采集完畢，并立即存儲于超低溫冰箱，以備后用。呼出氣采集裝置為RTube，全程佩戴鼻夾。

1.3 樣品制備

使用胰蛋白酶進行蛋白酶解，結(jié)合超濾輔助的樣品制備方法（FASP）進行EBC 樣本的過濾和濃縮。每個樣品用10 kDa 濾膜濃縮，與100 μL UA 緩沖液（8 mol/L 尿素，150 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）和DTT混合至10 mmol/L 的最終濃度，然后與100 μL IAA（50 mmol/L IAA in UA）、100 μL NH4HCO3緩沖液（50 mmol/L）和40 μL NH4HCO3緩沖液（0.5 μg 胞內(nèi)蛋白酶Lys-C）混合。然后，向樣品中添加0.5 μg 胰蛋白酶進行過夜酶解，并與40 μL NH4HCO3緩沖液（50 mmol/L）混合。然后將樣品以14 000 倍重力加速度離心濃縮30 min，收集濾液并冷凍干燥。每個樣品用12 μL、φ=0.1% 甲酸（FA）復(fù)溶，280 nm 波長處吸收波段（OD280）用于測量肽濃度。然后，從每個樣品中提取5 μL 肽段（約0.5 μg），并混合2 μL iRT 標準肽段用于質(zhì)譜分析。

1.4 質(zhì)譜分析

質(zhì)譜分析分為兩個步驟，DDA 分析和DIA 分析。DDA 分析中，使用EASY nLC 1200 系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，CA）和C18 柱（75 μm×300 mm，3 μm）進行色譜分離。緩沖液A 為φ=0.1%甲酸水溶液，緩沖液B 為φ=0.1% 甲酸乙腈水溶液(乙腈體積分數(shù)為 84%)。使用2 h 線性梯度，流速為250 nL/min，以φ=95%緩沖液A 平衡：梯度8%～30% 持續(xù)97 min，30%～100%持續(xù)13 min，并保持10 min。分離后，通過Q-Extractive HF 質(zhì) 譜 儀（Thermo Fisher Scientific，CA）進 行DDA 分 析。掃 描 范 圍（m/z）：300～1 800；質(zhì) 譜 分 辨 率：60 000；AGC (Automatic gain control)：3×106；Maximum IT：50 ms。MS 掃 描 后 繼 續(xù) 進行20 個MS2 掃描，Isolation window:1.6 Th；質(zhì)譜分辨率：30 000；AGC ：3×106； Maximum IT： 120 ms；MS2 Activation Type：HCD；標準化碰撞能量：27。

DIA 分析與DDA 分析使用的系統(tǒng)相同。梯度分離條件為：梯度10%～30%持續(xù)97 min，30%～100%持續(xù)13 min，并保持在100% 直到120 min。DIA 掃描范圍（m/z）：350～1 650，分辨率：120 000，AGC：3×106，Maximum IT：50 ms。設(shè)置30 個DIA 窗口進行MS2 掃描。對于MS2 掃描，分辨率：30 000，AGC：3×106，Maximum IT “自動”，碰撞能量：25，光譜數(shù)據(jù)類型：“profile”。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Spectronaut pulsar X 軟件進行蛋白質(zhì)鑒定。WGCNA 分析使用R 軟件（Version 6.4）數(shù)據(jù)包完成。GO 分析使用Blast2GO 完成，KEGG 分析通過KAAS(KEGG Automatic Annotation Server)完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

所有酶解樣本的樣品經(jīng)DDA 和DIA 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集后，使用Spectronaut pulsar X 軟件構(gòu)建蛋白庫。蛋白庫由兩部分組成，一部分為DDA 定量數(shù)據(jù)，另一部分為DIA 數(shù)據(jù)在pulsar 中直接檢索后構(gòu)建的Library。共鑒定到蛋白質(zhì)2 052 個，其中肺癌組866 個，肺結(jié)節(jié)組1 129 個，健康對照組1 089 個。大部分蛋白質(zhì)沒有在此前的研究中報道過，是目前為止最全面的EBC 蛋白譜[8]。研究表明，基于DIA 的組學(xué)方法可以有效開發(fā)EBC 蛋白成分，提高了EBC蛋白質(zhì)組學(xué)的敏感性和特異性。

利用DIA 技術(shù)建立了EBC 的蛋白組學(xué)方法，克服了EBC 樣本蛋白濃度過低、常規(guī)方法無法完成蛋白組學(xué)研究的困難?；贒IA 的蛋白質(zhì)組方法，對EBC 中低豐度蛋白有很好的鑒定能力。使用超濾管酶解FASP 的樣本制備方法，不僅可以將樣本過濾濃縮，還可以去除高分子聚合物的影響，這些聚合物來自于EBC 收集管，不可避免地干擾到蛋白質(zhì)的鑒定。在以往的研究中，對EBC 的處理往往是簡單的冷凍濃縮，并沒有考慮到樣本污染問題，因此往往不能取得令人滿意的蛋白鑒定結(jié)果[9]。

此前，已有研究人員使用LC-MS/MS 方法對EBC 的蛋白組學(xué)進行探索，然而由于技術(shù)的限制，這些研究并沒有很好地挖掘出EBC 的蛋白成分，也不能進行更深入的生物信息學(xué)分析[10]。Muccilli 等[3]對9 例EBC 樣本進行分析，共鑒定167 個蛋白；Sun等[11]用TMTs (Tandem Mass Tags)方法對38例EBC 樣本進行了蛋白組學(xué)分析，鑒定到257 個蛋白，之后對兩組蛋白進行差異蛋白分析，共發(fā)現(xiàn)24 個顯著差異表達的蛋白，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，這些蛋白在COPD 疾病進展中起著至關(guān)重要的作用，表明EBC的蛋白質(zhì)組學(xué)分析可用于相關(guān)疾病生物標志物的鑒定。國內(nèi)外對EBC 蛋白組學(xué)的研究一直在持續(xù)探索，然而結(jié)果卻并不令人滿意，方法的靈敏度是限制EBC 蛋白組學(xué)研究的主要原因之一。DIA 方法對低濃度的樣本展現(xiàn)出了極高的靈敏度，已有研究[12]表明30 min 的DIA 分析相當(dāng)于120 min 的DDA 分析，能夠鑒定兩倍以上的肽段，蛋白質(zhì)鑒定也相對提高25%。

2.2 WGCNA 分析

WGCNA 是無尺度分布的拓撲網(wǎng)絡(luò)分析，這對研究蛋白質(zhì)的互作關(guān)系十分有利，據(jù)此可以構(gòu)建大型的蛋白網(wǎng)絡(luò)，以此來觀察蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，并篩選出表達模式相近的模塊蛋白[13]。WGCNA 在蛋白質(zhì)組中的分析步驟主要為蛋白表達、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、模塊分析和模塊-性狀分析和關(guān)鍵蛋白分析。網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的節(jié)點是蛋白表達，蛋白質(zhì)之間的相關(guān)性是模塊分析的依據(jù)。在進行WGCNA 分析時，需要選擇軟閾值，以此來確定網(wǎng)絡(luò)是否符合無尺度分布。軟閾值的選擇通常為相關(guān)系數(shù)R2>0.8，并保證一定的連續(xù)性[14]。本文使用Pick Soft Threshold 函數(shù)自動篩選軟閾值，如圖1 所示。

圖1 最佳軟閾值篩選：（a）基于R2=0.9 無尺度網(wǎng)絡(luò)的軟閾值篩選；（b）軟閾值為5 時網(wǎng)絡(luò)的連通性Fig.1 Screening of the best soft threshold: (a) Soft threshold of scale-free network based on R2=0.9; (b) Connectivity when the soft threshold was 5

以5 為軟閾值構(gòu)建蛋白模塊的聚類樹圖，如圖2所示。圖中每個顏色代表一個蛋白模塊，灰色代表無法被分類的蛋白，分枝的遠近代表蛋白的相似程度。通過蛋白聚類樹可以看出，本研究的蛋白有很強的模塊性。

圖2 EBC 蛋白共表達模塊劃分Fig.2 Cluster dendrogram and module overview for EBC proteome

利用Topological Overlap Matrix(TOM)對所有蛋白進行聚類熱圖分析，如圖3 所示。圖中表達模式相近的蛋白被分類到同一個分支中，熱圖顏色越深，代表蛋白之間的重疊程度越高，蛋白質(zhì)之間的功能越密切。

圖3 基于TOM 的拓撲網(wǎng)絡(luò)熱圖Fig.3 Heatmap of the topological network based on TOM

模塊與性狀之間通過相關(guān)系數(shù)表現(xiàn)其關(guān)聯(lián)，通過計算相關(guān)系數(shù)和p值，可以篩選出與表型性狀顯著關(guān)聯(lián)的共表達模塊。圖4 是模塊與表型性狀相關(guān)性熱圖，左側(cè)縱坐標代表不同的模塊類型，中間色塊代表蛋白模塊，根據(jù)色塊上的相關(guān)系數(shù)和括號中的p值可以篩選出最顯著的蛋白模塊，圖例代表相關(guān)系數(shù)R2的大小范圍為-1.0～1.0，其中紅色代表正相關(guān)，藍色代表負相關(guān)。

根據(jù)上述結(jié)果，將共表達模塊中的蛋白在所有樣本中的表達進行聚類熱圖分析，可以看出每個模塊在樣本中的特征值分布，如圖5 所示。圖的上半部分為蛋白在各個樣本中的表達模式熱圖，紅色代表上調(diào)表達，綠色代表下調(diào)表達。下半部分藍色模塊為特征值的分布，絕對值越大代表樣本整體表達變化量越大。

圖5 蛋白表達熱圖（a）及藍色模塊特征值分布圖（b）Fig.5 Heatmap of the eigenproteins expression (a) and module eigenvalue

通過觀察模塊特征值的聚類樹圖和聚類熱圖，可以篩選出與表達模式最相似的模塊。由圖4 可知，藍色模塊的相關(guān)性系數(shù)為 0.420，p值為 0.02，是4 個模塊中表達最為顯著的蛋白模塊，這表明該模塊中的蛋白可能共同參與了某些生物過程，協(xié)同發(fā)揮重要的生物功能，有挖掘生物標志物的潛力。以此分析蛋白重要性與模塊關(guān)系的關(guān)系，探究蛋白與模塊的相關(guān)性和蛋白與性狀的相關(guān)性是否有良好的一致性，篩選可能承擔(dān)最多生物功能的關(guān)鍵蛋白（Hub Protein），如圖6 所示。

圖4 模塊與表型性狀相關(guān)性熱圖Fig.4 Heatmap of the module-trait correlations

圖6 蛋白重要性與模塊關(guān)系的散點分布圖Fig.6 Scatter plot of protein significance and module membership

經(jīng)過上述分析，共有61 個蛋白被篩選為關(guān)鍵蛋白。對關(guān)鍵蛋白進行GO 和KEGG 分析，結(jié)果分別如圖7 和圖8 所示。GO 分析結(jié)果表明，EBC 關(guān)鍵模塊蛋白的生物過程主要集中在磷代謝相關(guān)過程和細胞活動；KEGG 分析結(jié)果表明，這些關(guān)鍵模塊的蛋白較多參與了人類疾病分類的代謝活動，在人體免疫活動和信號傳導(dǎo)過程中也十分活躍。

圖7 關(guān)鍵模塊蛋白的GO 分析： （a） GO term 分類；（b） GO 富集分析Fig.7 GO analysis of proteins extracted from the core module: (a) GO terms classification; (b) Enriched GO terms

圖8 關(guān)鍵模塊蛋白的KEGG 分析: （a） KEGG term 分類；（b） KEGG 富集分析Fig.8 KEGG analysis of proteins extracted from the core module: (a) KEGG terms classification; (b) Enriched KEGG terms

對一些關(guān)鍵蛋白的互作關(guān)系進行分析和可視化，結(jié)果如圖9 所示。在String 中導(dǎo)入61 個關(guān)鍵蛋白，將結(jié)果展示設(shè)置為最高置信度（0.900），隱藏不產(chǎn)生連結(jié)關(guān)系的蛋白。圖9 中的每一個節(jié)點都代表一個蛋白，蛋白與蛋白之間的連結(jié)線越多，說明蛋白之間的互作關(guān)系越大。結(jié)果表明，PPIs（Protein-Protein Interactions）網(wǎng)絡(luò)共52 個節(jié)點和43 條連結(jié)線，平均節(jié)點為0.453，p＜0.001。其中ACTB，HSPA8，TUBA4A，MDH2，HSP90AA1 等處于互作網(wǎng)絡(luò)的核心區(qū)域，有可能是承擔(dān)最多生物學(xué)功能的蛋白。

圖9 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析Fig.9 Protein-protein interactions analysis

2.3 討論

本文在EBC 蛋白組學(xué)方法建立的基礎(chǔ)上，對鑒定到的蛋白進行了多維的生物信息學(xué)分析，對肺癌、肺結(jié)節(jié)和健康人群的蛋白組的組成和生物學(xué)功能有了初步的了解。WGCNA 網(wǎng)絡(luò)對于處理無尺度分布的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)有天然的優(yōu)勢，本文依據(jù)蛋白間相互作用關(guān)系來挖掘蛋白內(nèi)在關(guān)系，進一步篩選具有相似生物學(xué)功能的關(guān)鍵模塊和關(guān)鍵蛋白。傳統(tǒng)的生物信息學(xué)分析雖然對高表達的蛋白和基因有很強的分析能力，但對于低表達的蛋白功能挖掘能力較弱。WGCNA 分析可以把表達模式相似的蛋白歸于同一個網(wǎng)絡(luò)，將復(fù)雜的蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為不同網(wǎng)絡(luò)和功能模塊，再進一步分析每一個模塊的功能，對處理大批量的蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)有很大的優(yōu)勢[15]。

本文利用DIA 技術(shù)建立了基于EBC 的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法。對30 例EBC 樣本的分析共鑒定出蛋白質(zhì) 2 052 個，其中肺癌組 866 個，肺結(jié)節(jié)組 1 129個，健康對照組1 089 個，表明基于DIA 的蛋白組學(xué)方法對低蛋白濃度的生物樣本有很強的分析能力。使用WGCNA 算法，對EBC 樣本的蛋白質(zhì)組進行了分析，篩選出EBC 中發(fā)揮重要生物功能的核心蛋白。通過GO 分析發(fā)現(xiàn)這些關(guān)鍵蛋白在細胞核和細胞質(zhì)中廣泛存在，在分子功能方面，大部分互作蛋白發(fā)揮了結(jié)合功能，包括蛋白質(zhì)結(jié)合、激酶結(jié)合和雜環(huán)化合物結(jié)合等。此外，這些蛋白質(zhì)在細胞過程調(diào)節(jié)、磷化合物代謝、細胞含氮化合物代謝和有絲分裂周期等生物活動中十分活躍。KEGG 分析則提示關(guān)鍵蛋白參與了與免疫相關(guān)的系統(tǒng)性疾病、病毒致癌、細胞凋亡、Rap1 信號通路等代謝活動，這表明關(guān)鍵蛋白不僅活躍參與了與人體疾病相關(guān)的代謝活動，還參與了細胞的生理過程和信號傳導(dǎo)，廣泛涉及系統(tǒng)性疾病、腫瘤、感染類疾病等通路。

以上研究表明，WGCNA 所篩選出的模塊蛋白具有生物學(xué)意義，能夠反映EBC 蛋白組的生物功能，結(jié)合DIA 蛋白組學(xué)方法，可以開展更大規(guī)模的研究，在未來對肺癌等肺部疾病的研究和探索有很強的實際應(yīng)用價值，可以助益生物標志物的探索和疾病診療。