mNGS 在發(fā)熱血液腫瘤患者血液病原體檢測中的應(yīng)用及細(xì)菌檢出陽性預(yù)測模型構(gòu)建

陳姝諭，雷坳錡，顏學(xué)兵

徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染性疾病與肝病科，江蘇徐州 221000

宏基因組二代測序技術(shù)（mNGS）作為一種新興的分子診斷技術(shù)，于2014 年首次用于感染性疾病的診斷，此后逐漸用于新發(fā)或罕見病原體的檢測、感染性疾病的監(jiān)測和預(yù)防、病原體耐藥基因突變，并逐漸在不同人群、部位及樣本類型的感染中展開探索。血液腫瘤患者是血流感染的高危人群，病死率高［1］。血液腫瘤患者最常見的臨床癥狀是發(fā)熱，其發(fā)熱原因主要有二種，一是感染性疾病導(dǎo)致的發(fā)熱，需早期診斷并準(zhǔn)確選擇抗菌藥物；二是腫瘤本身導(dǎo)致的發(fā)熱，需盡早抗腫瘤治療?？鼓[瘤治療后伴隨一定程度的免疫抑制，若此時合并感染，癥狀不典型且來勢兇猛。這就要求臨床醫(yī)師抗腫瘤治療前盡量識別并控制感染。血液腫瘤患者發(fā)熱原因往往難以第一時間鑒別［2］。感染指標(biāo)特異性不高［3］，傳統(tǒng)病原體檢測各有局限性。mNGS 不依賴培養(yǎng)，無偏好性，直接從樣品中提取全部微生物的核酸進(jìn)行鑒定，可作為免疫功能受損人群病原體檢測的選擇［4］。既往有研究納入血、肺泡灌洗液、痰、尿等不同標(biāo)本類型，泛標(biāo)本探討mNGS 在血液腫瘤中的應(yīng)用價值［5］。目前尚缺乏mNGS針對血液腫瘤患者血流感染的大型診斷效能研究。本研究觀察了外周血標(biāo)本mNGS與常規(guī)檢測技術(shù)病原體檢出率的差異，探討了發(fā)熱血液腫瘤患者mNGS 細(xì)菌檢出陽性的獨(dú)立影響因素，并進(jìn)一步構(gòu)建了mNGS 細(xì)菌檢出陽性預(yù)測模型，為mNGS檢測時機(jī)的選擇提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2020 年6 月1 日—2022 年10 月30日在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院住院治療的發(fā)熱血液腫瘤患者104 例，男64 例（61.5%）、女40 例，年齡51.50（35.00，62.00）歲，血液病類型：白血病55 例、多發(fā)性骨髓瘤25 例、淋巴瘤20 例、再生障礙性貧血3例、骨髓增生異常綜合征1例，合并癥：肺部感染80例（76.9%）、低蛋白血癥62 例（59.6%）、骨髓抑制85 例（81.7%），粒細(xì)胞缺乏癥81 例（77.9%）。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥14 歲；發(fā)熱≥38 ℃；臨床確診血液腫瘤［診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《血液病學(xué)診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》（第4版）］且未合并實(shí)體腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：血液標(biāo)本無法采集或采集量不能滿足檢測要求；臨床資料不全者；實(shí)體腫瘤；自身免疫性疾??；已明確的非感染性發(fā)熱。本臨床研究滿足赫爾基辛宣言的要求，經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并免除研究對象的知情同意審查（XYFY2023-KL013-01）。

1.2 病原體檢測方法 mNGS 檢測方法：取成人外周血5 mL，以cfDNA 管（游離核酸保存管）6～37 ℃保存，運(yùn)輸不超過5 d。使用去宿主試劑盒并使用二代微生物破壁儀進(jìn)行血液樣本預(yù)處理，應(yīng)用PCRfree技術(shù)無擴(kuò)增建庫，DNA/RNA 抽提建庫試劑盒匹配illumine NGS 高通量測序平臺進(jìn)行宏基因組文庫構(gòu)建（包含 DNA/RNA 提取、RNA 逆轉(zhuǎn)錄、DNA/cDNA 片段化、末端補(bǔ)平、末端加 A、連接測序接頭、文庫純化等步驟），然后應(yīng)用NGS 文庫定量試劑盒進(jìn)行定量測試。病原微生物基因數(shù)據(jù)分析軟件Gentellix 自動分析數(shù)據(jù)，去人源后通過人源指數(shù)識別真/假陰性結(jié)果并生成檢測報告［6-7］。數(shù)據(jù)庫覆蓋25 000 + 微生物、2 000 + 耐藥基因。血液樣本均由杰毅生物有限公司進(jìn)行DNA-mNGS 檢測及生物信息分析。mNGS 陽性標(biāo)準(zhǔn)：以報告中詳細(xì)結(jié)果列表為參考，若檢出微生物片段僅含疑似或人體共生微生物群，則判定 mNGS 結(jié)果為陰性［8］。根據(jù) mNGS是否檢出細(xì)菌分為 mNGS 細(xì)菌檢出組（n=40）和 mNGS細(xì)菌未檢出組（n=64）。

常規(guī)檢測技術(shù)方法：細(xì)菌常規(guī)檢測技術(shù)包括需氧及厭氧的血培養(yǎng)［9］；真菌常規(guī)檢測技術(shù)包括真菌培養(yǎng)、真菌/霉菌涂片、 G 試驗(yàn)、GM 試驗(yàn)［10-11］；病毒常規(guī)檢測技術(shù)包括實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）測定血漿中 EBV 和 CMV 的 DNA 水平［12］；其他常規(guī)檢測技術(shù)包括 PPD 試驗(yàn)、痰抗酸染色、血結(jié)核桿菌斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT）、γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRAs）［13］； 十三項(xiàng)病原菌檢測（具體包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、肺結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、肺炎支原體、肺炎衣原體）及十一項(xiàng)病原菌檢測（具體包括肺炎支原體抗體、柯薩奇B 組病毒IgM 抗體、人呼吸道合胞病毒IgM 抗體、腺病毒IgM 抗體、A 型流感病毒IgM 抗體、B 型流感病毒IgM 抗體、人副流感病毒IgM 抗體、?？刹《綢gM抗體、EB病毒IgM抗體、血清淀粉樣蛋白測定、結(jié)核分枝桿菌IgM 抗體、結(jié)核分枝桿菌IgG 抗體）等［14］。血液標(biāo)本均留取患者空腹?fàn)顟B(tài)下的靜脈血。以上實(shí)驗(yàn)室檢測由徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測人員嚴(yán)格按照質(zhì)控程序完成。

1.3 觀察指標(biāo)及收集方法 從住院病歷中收集mNGS 細(xì)菌檢出組、mNGS 細(xì)菌未檢出組臨床資料，包括血常規(guī)、感染指標(biāo)及合并的臨床事件（肺部感染、低蛋白血癥、骨髓抑制、粒細(xì)胞缺乏癥）。感染指標(biāo)包括超敏 C-反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、降鈣素原（PCT）、血清鐵蛋白（SF）、白介素-6（IL-6）、D-二聚體（D-Dimer）。肺部感染參照mNGS 檢測前最近一次胸部CT 影像學(xué)結(jié)果［15］。低蛋白血癥定義為血漿白蛋白< 30 g/L?？鼓[瘤藥物相關(guān)的骨髓抑制符合①同時符合②中任一條即可診斷：①有惡性腫瘤病史，近期進(jìn)行抗腫瘤治療，如化療、靶向治療等；②成人外周血白細(xì)胞< 4.0 ×109／L 為白細(xì)胞減少癥；中性粒細(xì)胞絕對值<2.0×109／L 為中性粒細(xì)胞減少癥；血紅蛋白濃度降低至正常水平以下為貧血；血小板計數(shù)< 100 ×109／L為血小板減少癥［16］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS24.0 統(tǒng)計軟件。計量資料經(jīng)S-W檢驗(yàn)正態(tài)性，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計量資料以 ［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用 Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計數(shù)資料用頻次（%）表示，兩組比較采用χ2檢驗(yàn)或校正χ2檢驗(yàn)或Fisher's確切概率法分析。采用二元 Logistic 回歸進(jìn)行單因素分析，將P<0.05的指標(biāo)及臨床事件納入 Logistic 多因素分析，尋找發(fā)熱血液腫瘤患者mNGS 細(xì)菌檢出陽性的獨(dú)立影響因素，并建立mNGS 細(xì)菌檢出陽性預(yù)測模型。采用ROC 分析mNGS 細(xì)菌檢出陽性預(yù)測模型的預(yù)測效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)熱腫瘤患者中，mNGS 檢測技術(shù)與常規(guī)檢測技術(shù)病原體檢出率比較 發(fā)熱腫瘤患者中，mNGS與常規(guī)檢測技術(shù)細(xì)菌檢出陽性分別為40（38.5%）、7例（6.7%），兩者細(xì)菌檢出陽性率比較，χ2=29.934，P<0.05；病 毒 檢 出 分 別 為55（52.9%）、15 例（14.4%），兩者病毒檢出率比較，χ2=34.451，P<0.05；發(fā)熱腫瘤患者中，mNGS 對分枝桿菌、支原體/衣原體/立克次體、真菌檢出的例數(shù)分別為12（11.5%）、4（3.8%）、1 例（1%），常規(guī)檢測技術(shù)分別為7（6.7%）、0、0例，兩者比較，P均>0.05。

2.2 發(fā)熱腫瘤患者中mNGS 細(xì)菌檢出陽性的影響因素 發(fā)熱腫瘤患者中mNGS 細(xì)菌檢出組WBC、NEU、LY、hs-CRP、PCT、SF、IL-6、D-Dimer 分別為0.50（0.10，2.90）×109/L、0.16（0.00，1.88）×109/L、0.20（0.00，0.60）×109/L、130.20（39.13，218.95）mg/L、0.46（0.17，2.57）ng/mL、1 981.50（1 230.50，3 143.00）ng/mL、94.94（41.36，188.00）pg/mL、1.09（0.57，2.14）μg/mL，合并肺部感染、低蛋白血癥、骨髓抑制、粒細(xì)胞缺乏癥分別為37（92.5%）、33（82.5%）、37（92.5%）、34例（85.0%）；mNGS細(xì)菌未檢出組WBC、NEU、LY、hs-CRP、PCT、SF、IL-6、D-Dimer分 別 為2.00（0.70，5.15）×109/L、0.82（0.09，2.81）×109/L、0.40（0.10，1.05）×109/L、43.40（9.20，92.70）mg/L、0.17（0.10，0.54）ng/mL、2 498.50（1 381.25，4 002.75）ng/mL、66.56（10.83，172.00）pg/mL、1.45（0.70，2.38）μg/mL，合并肺部感染、低蛋白血癥、骨髓抑制、粒細(xì)胞缺乏癥分別為43（67.2%）、29（45.3%）、48（75.0%）、47例（73.4%）。

以 mNGS 細(xì)菌檢出陽性為因變量，上述各指標(biāo)為自變量，行單因素 Logistic 回歸分析。結(jié)果顯示，hs-CRP 升高、合并肺部感染、合并低蛋白血癥、合并骨髓抑制是發(fā)熱腫瘤患者中mNGS細(xì)菌檢出陽性的影響因素，詳見表1。

表1 發(fā)熱腫瘤患者中mNGS 細(xì)菌檢出陽性率影響因素的單因素 Logistic 分析結(jié)果

采用逐步向后回歸法，引入標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，刪除標(biāo)準(zhǔn)為P>0.10，建立多因素Logistic 回歸模型。結(jié)果顯示， hs-CRP 高 、存在肺部感染、合并低蛋白血癥是 發(fā)熱腫瘤患者mNGS 細(xì)菌檢出陽性的獨(dú)立影響因素（P<0.05），結(jié)果見表2。

表2 發(fā)熱腫瘤患者中mNGS細(xì)菌檢出陽性率影響因素的多因素 Logistic 分析結(jié)果

2.3 mNGS細(xì)菌檢出陽性預(yù)測模型構(gòu)建及效能驗(yàn)證結(jié)果 依據(jù)獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)建立回歸方程，得出發(fā)熱腫瘤患者mNGS細(xì)菌檢出陽性預(yù)測模型（PRE）=-4.768+ 0.01×hs-CRP + 1.619×肺部感染 + 1.271×低蛋白血癥（合并肺部感染、合并低蛋白血癥為1） 。PRE預(yù)測發(fā)熱腫瘤患者mNGS 細(xì)菌檢出陽性的ROC（圖1）下面積AUC（95%CI）為 0.822（0.737～0.907）、Cut-off值0.415、約登指數(shù)0.551 靈敏度78.9%、特異度76.2%。hs-CRP預(yù)測發(fā)熱腫瘤患者mNGS 細(xì)菌檢出陽性的AUC（95%CI）為0.737（0.635～0.839）、Cut-off值147.400、約登指數(shù)0.395、靈敏度47.4%、特異度92.1%。合并肺部感染預(yù)測發(fā)熱腫瘤患者mNGS細(xì)菌檢出陽性的AUC（95%CI）為0.627（0.520～0.733）、Cutoff 值0.500、約登指數(shù) 0.253、靈敏度92.5%、特異度32.8%。合并低蛋白血癥預(yù)測發(fā)熱腫瘤患者mNGS 細(xì)菌檢出陽性的AUC（95%CI）為0.686（0.583～0.789）、Cut-off值0.500、約登指數(shù)0.372、靈敏度82.5%、特異度54.7%。

圖1 PRE及各獨(dú)立影響因素對發(fā)熱腫瘤患者mNGS細(xì)菌檢出陽性預(yù)測的ROC

3 討論

血液腫瘤患者是發(fā)生血流感染的高危人群，發(fā)熱常提示感染存在。然而血液腫瘤患者合并的發(fā)熱是感染性疾病導(dǎo)致，還是腫瘤自身導(dǎo)致，往往難以第一時間鑒別［2］。感染指標(biāo)，如CRP、PCT等，特異性不強(qiáng)［3］。傳統(tǒng)病原體檢測，如血培養(yǎng)、抗原抗體檢測、病毒定量檢測等，各有其局限性。mNGS可作為 發(fā)熱血液腫瘤患者尋找病原體的新選擇。既往喬薇等［17］研究表明，mNGS鑒定病原體的陽性率顯著高于血培養(yǎng)（47.9%比1.41%，P<0.05）。本研究發(fā)熱血液腫瘤患者 mNGS 細(xì)菌檢出陽性率顯著高于血培養(yǎng)（38.5%比6.7%）；mNGS 病毒檢出率顯著高于傳統(tǒng)病原學(xué)檢測（52.9%比14.4%）。說明mNGS 比常規(guī)檢測技術(shù)檢出細(xì)菌及病毒更高效。

發(fā)熱血液腫瘤患者由于治療常需經(jīng)驗(yàn)性應(yīng)用抗生素，導(dǎo)致血培養(yǎng)陽性率進(jìn)一步下降［18-19］。既往研究［20］收集免疫功能正常合并嚴(yán)重膿毒癥表現(xiàn)的成年人 325例，結(jié)果顯示抗菌治療 120 min后，血培養(yǎng)陽性率較抗菌治療前降低 12.0%。另一項(xiàng)研究［21］分析了 559 例膿毒癥患者，接受抗生素治療后血培養(yǎng)陽性率下降了22.9% 。GIRMENIA等［22］發(fā)現(xiàn)，革蘭陰性菌血流感染是造血干細(xì)胞移植患者 4 個月時死亡率增加的獨(dú)立影響因素。GILL等［23］研究顯示，細(xì)菌血流感染使異體造血干細(xì)胞移植患者 1年總生存期顯著下降 。既往研究［24］顯示，當(dāng)抗生素治療后血培養(yǎng)結(jié)果陰性時，mNGS仍能夠識別病原體。本研究104例 發(fā)熱血液腫瘤患者均行經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療，其常規(guī)檢測技術(shù)陽性率僅6.73%，而mNGS 的 細(xì)菌檢出陽性率38.5%，mNGS細(xì)菌血流感染檢出率高于常規(guī)檢測技術(shù)（血培養(yǎng)）。

血液腫瘤患者化療導(dǎo)致骨髓抑制，免疫功能下降，使得WBC、NEU、LY 水平低下，極易發(fā)生感染。一旦細(xì)菌感染，hs-CRP、PCT 反應(yīng)性升高［3］，而由于骨髓抑制等原因WBC、NEU 升高水平不理想。細(xì)菌感染，消耗血清中的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致白蛋白水平下降，甚至是低蛋白血癥。本研究顯示，hs-CRP 升高、合并肺部感染、合并低蛋白血癥、骨髓抑制是 mNGS細(xì)菌檢出陽性的影響因素。hs-CRP 升高、合并肺部感染、合并低蛋白血癥是 mNGS 細(xì)菌檢出陽性的獨(dú)立影響因素，并以此建立發(fā)熱血液腫瘤患者 mNGS細(xì)菌檢出陽性的預(yù)測模型，以選擇mNGS檢測時機(jī)，提高檢測效率。發(fā)熱血液腫瘤患者常已行病毒定量檢測，且經(jīng)驗(yàn)性抗病毒治療［19］。mNGS 擴(kuò)大病毒檢測范圍，對臨床病情和治療影響不太大，故本研究并未針對病毒建立預(yù)測模型。

總之，在發(fā)熱血液腫瘤患者中，mNGS 細(xì)菌及病毒檢出率高于常規(guī)檢測技術(shù)。綜合hs-CRP 升高、合并肺部感染、合并低蛋白血癥成功建立了mNGS 細(xì)菌檢出陽性預(yù)測模型。本研究尚存在以下局限性：單中心研究，納入樣本量相對有限，可能會影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；回顧性研究，樣本采集前大多數(shù)患者存在抗菌藥應(yīng)用史，可能存在滅活病原菌的DNA，影響檢測結(jié)果；本研究未進(jìn)行RNA病原體檢測。