不同濃度PM2.5 對(duì)小鼠肺泡II 型上皮細(xì)胞MLE-12 的損傷作用及SP-B表達(dá)影響

李本，彭倩，高永峰，肖瑤，陳紀(jì)濤，劉季芳

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 廣州市加速康復(fù)腹部外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510700

近年，隨著全球城市霧霾水平上升，空氣污染對(duì)人類健康的影響正引起全球關(guān)注［1］。PM2.5是空氣動(dòng)力學(xué)粒徑≤2.5 μm 的顆粒物［2］，成分復(fù)雜，其中包括多種致癌成分如重金屬、多環(huán)芳烴（PAHs）、未燃燒或未完全燃燒的燃料等［3-4］。PM2.5的危害存在于多方面，其中在呼吸系統(tǒng)上，長(zhǎng)期暴露于高濃度PM2.5環(huán)境的人群會(huì)增加5 至15 年內(nèi)慢性肺部疾病的發(fā)病率和死亡率［5-6］。有研究表明，PM2.5對(duì)肺泡上皮細(xì)胞有明顯毒性作用，能導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變、活性明顯下降［7］。25～100 μg/mL PM2.5暴露顯著增加了肺泡上皮細(xì)胞的ROS 水平，且呈劑量依賴性［8］。肺表面活性物質(zhì)（PS）是由肺泡II 型上皮細(xì)胞合成并分泌的一種脂蛋白復(fù)合物，包括二棕櫚酰卵磷脂（DPPC）和肺表面活性蛋白（SP）［9］。SP 包括SP-A、SP-B、SP-C 和SP-D，其中SP-B 主要功能為降低肺表面張力，從而防止肺泡坍塌［10］。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氣管內(nèi)滴注外源性SP-B 可改善內(nèi)毒素所誘導(dǎo)的急性肺損傷［11］。體外研究還發(fā)現(xiàn)，高濃度PM1可引起肺泡上皮細(xì)胞氧化損傷和自噬，并抑制SP-B 和SP-C 的表達(dá)［12］。然而，關(guān)于PM2.5對(duì)SP-B 表達(dá)的影響目前尚未見(jiàn)報(bào)道。2021 年9 月—2022 年5 月，本研究觀察了不同濃度PM2.5作用后正常小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞MLE-12 形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)和增殖能力變化及SP-B 水平的變化，為PM2.5致肺泡上皮細(xì)胞損傷的潛在作用機(jī)制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、PM2.5、試劑及儀器 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞MLE-12 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫(kù)。PM2.5購(gòu)自美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，SP-B 抗體購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ 公司，GAPDH 抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司，RNA 快速提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)ESscience 公司，qRT-PCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Takara公司，超聲波細(xì)胞破碎儀購(gòu)自寧波新芝生物科技公司，倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自美國(guó)OLYMPUS 公司，透射電子顯微鏡購(gòu)自日本HITACHI 公司，凝膠成像系統(tǒng)、分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 MLE-12 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及PM2.5混懸液加入將MLE-12 細(xì)胞接種至含10%胎牛血清、1%青—鏈霉素的DMEM 完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗2 遍加入胰酶消化至在顯微鏡下能觀察到大部分貼壁細(xì)胞變圓并脫落，接著加入培養(yǎng)基終止消化并傳代培養(yǎng)，取以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別用加入12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5混懸液的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，PM2.5劑量選擇的主要依據(jù)為課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果以及多徑顆粒劑量法（MPPD）模型軟件計(jì)算出的PM2.5環(huán)境暴露24 h后在氣管—支氣管上皮表面的沉積濃度［13-14］；對(duì)照組用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)觀察 將不同濃度PM2.5溶液處理的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；不同濃度PM2.5溶液處理的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)液，使用0.25%胰酶消化細(xì)胞2 min，接著加入培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管以1 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min。離心完畢后棄去培養(yǎng)液，沿離心管壁緩慢加滿電鏡固定液。在4 ℃下固定15 min 后制片，采用透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4 細(xì)胞增殖能力觀察 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞按1×104/mL 接種至16 孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，在室溫超凈臺(tái)內(nèi)放置30 min，然后放入預(yù)先擺放于培養(yǎng)箱中的RTCA 分析儀上，進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的細(xì)胞增殖檢測(cè)。次日棄掉原培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組依次加入含不同濃度PM2.5的DMEM 完全培養(yǎng)基，對(duì)照組僅加入DMEM 完全培養(yǎng)基，各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。利用RTCA 分析儀記錄細(xì)胞48 h 內(nèi)的增殖曲線。

1.5 細(xì)胞SP-B 蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。分別用加入0（對(duì)照）、12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5的培養(yǎng)基培養(yǎng)MLE-12細(xì)胞24 h，將細(xì)胞用蛋白酶和磷酸酶抑制劑在冷RIPA 緩沖液中裂解，用BCA 檢測(cè)試劑盒測(cè)蛋白濃度。蛋白質(zhì)樣品在99 ℃下進(jìn)行10 min 的變性，下一步在12% SDSPAGE 凝膠上對(duì)蛋白進(jìn)行分離，接著將其轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用50 mL 含5%脫脂奶粉的TBST 在室溫下進(jìn)行2 h 封閉，然后分別與GAPDH、SP-B 一抗（1∶1 000）4 ℃共同孵育過(guò)夜。用TBST 進(jìn)行3 次洗滌，每次洗滌10 min，將其放置于室溫下二抗孵育1 h 后，再次使用TBST 洗滌3 次，每次洗滌10 min，最后借助Image Lab 軟件進(jìn)行顯影曝光。曝光結(jié)果利用Image J 軟件分析條帶灰度值，以SP-B 條帶與GAPDH 條帶灰度比值作為SP-B 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞SP-B mRNA 檢測(cè) 采用qRT-PCR 法。課題組前期應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析了0、25、100 μg/mL PM2.5對(duì)細(xì)胞化學(xué)致癌通路的影響，發(fā)現(xiàn)100 μg/mL PM2.5能減弱谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的解毒功能 而 影 響 化 學(xué) 致 癌 通 路［13］。 因 此 用0、25、100 μg/mL PM2.5的培養(yǎng)基培養(yǎng)MLE-12細(xì)胞24 h，按照RNA 快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行RNA 的提取。依照PrimeScriptTMRT 試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。將引物稀釋后，混勻TB Green Premix Ex TaqⅡ、PCR Forward Primer、PCR Reverse Primer、ROX Reference Dye II 和cDNA 配 成PCR 反 應(yīng) 液，使 用qPCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增，在PCR 系統(tǒng)上設(shè)置組別，實(shí)驗(yàn)參數(shù)：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，循環(huán)40 次。儀器運(yùn)行結(jié)束后將結(jié)果以Excel 表格方式導(dǎo)出，以GAPDH 作為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt公式計(jì)算SP-B mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列：SFTPB上游為5'-CTATCACGTCGGCCTCATCC-3'，下游為3'-TGGCACAGGT-CATTAG-CTCC-5'；GAPDH 上游 為5'-GGTCCCAGCTTAGGTTCATCA-3'，下 游為3'-CCAATACGGCCAA-ATCCGTTC-5'。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。服從正態(tài)分布且方差齊性的計(jì)量資料以±s表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5作用后MLE-12 細(xì)胞的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)及增殖能力變化 ①各組MLE-12 細(xì)胞形態(tài)變化：對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；實(shí)驗(yàn)組中觀察到隨著PM2.5濃度的升高細(xì)胞逐漸變得皺縮呈扁圓型，部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、背景顏色加深，可見(jiàn)PM2.5顆粒和吸附了顆粒的細(xì)胞，見(jiàn)圖1。②各組MLE-12 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化：對(duì)照組細(xì)胞中觀察到了正常的超微結(jié)構(gòu)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了自噬溶酶體，出現(xiàn)板層小體損傷、線粒體腫脹、線粒體嵴斷裂甚至空泡化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等細(xì)胞器損傷現(xiàn)象，損傷的嚴(yán)重程度隨著PM2.5濃度的升高而增加，見(jiàn)圖2。③各組MLE-12細(xì)胞增殖能力變化：0、12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5作用24 h后細(xì)胞增 殖 指 數(shù) 分 別 為0.005 2、-0.022 9、-0.031 1、-0.042 0、-0.070 4、-0.106 5，呈明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系（R2= 0.936 4）；作用48 h 后細(xì)胞增殖指數(shù)分別為-0.028 6、-0.050 6、-0.066 9、-0.069 7、-0.108 6、-0.156 8，呈明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系（R2= 0.966 4）。其中200 μg/mL PM2.5作用后細(xì)胞抑制程度最顯著，其細(xì)胞增殖指數(shù)沒(méi)有上升期，一直呈下降趨勢(shì)。

圖1 光學(xué)顯微鏡下對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組MLE-12細(xì)胞形態(tài)

2.2 PM2.5作用后MLE-12 細(xì)胞SP-B 蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量 0、12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5作用后，細(xì)胞SP-B 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1、0.902 ± 0.136、0.819 ± 0.173、0.727 ± 0.191、0.602 ± 0.138、0.644 ± 0.112。與0 μg/mL PM2.5相比，12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5作用后細(xì)胞SP-B 蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，且具明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系（R2= 0.637 4），其中50、100、200 μg/mL PM2.5作用后細(xì)胞SP-B 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05）；0、25、100 μg/mL PM2.5作用后，細(xì) 胞SP-B mRNA 分 別 為1、0.623 ± 0.153、0.590 ± 0.087。 與0 μg/mL PM2.5相 比，25、100 μg/mL PM2.5作用后細(xì)胞SP-B mRNA 相對(duì)表達(dá)量均降低，且具明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系（R2= 0.553 2，P均< 0.05），以100 μg/mL PM2.5作用后降低更為顯著。

3 討論

PM，又稱為顆粒物，指空氣中分散的固體、液體懸浮物或固液混合微粒，根據(jù)其在肺中的沉積部位可分為粗顆粒物（PM10）和細(xì)顆粒物（PM2.5）［15］。最新發(fā)布的2022 年世衛(wèi)組織年度報(bào)告顯示，PM2.5暴露對(duì)人類健康構(gòu)成了巨大威脅［16-17］。據(jù)全球疾病負(fù)擔(dān)研究估計(jì)，環(huán)境PM2.5是全球第五大最重要的死亡危險(xiǎn)因素［18］，2017 年全球290 萬(wàn)人的死亡可歸因于室外PM2.5污染［19］。先前的流行病學(xué)研究表明，PM2.5暴露與多種呼吸道疾?。ㄈ缰夤芟⒙宰枞苑渭膊『头伟┲g的關(guān)系已得到證實(shí)［20］。PM2.5進(jìn)入呼吸道后，其有毒成分能夠引起肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，增加炎癥因子表達(dá)水平，誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡以及肺超微結(jié)構(gòu)改變［21-22］。因此，我們有必要進(jìn)一步探究PM2.5對(duì)機(jī)體的毒性作用。

肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的正常功能對(duì)維持肺泡結(jié)構(gòu)和功能及局部環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用，其功能狀態(tài)的改變被認(rèn)為與多種肺損傷及肺部疾病的發(fā)生有關(guān)［23］。本研究首次在12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5的染毒梯度下，采用光學(xué)顯微鏡觀察正常肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞MLE-12 形態(tài)，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，RTCA 儀檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)PM2.5可呈劑量依賴性損傷細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)、抑制其增殖，表明PM2.5對(duì)MLE-12細(xì)胞具有一定的毒性作用。我們課題組的前期研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)PM2.5可促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和激活化學(xué)致癌通路相關(guān)基因，提示PM2.5能促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，有潛在的致癌作用。然而，PM2.5致毒性的分子機(jī)制目前尚未完全闡明。

SP 在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中合成并轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體（GA），隨后被分泌到肺泡表面發(fā)揮免疫防御和呼吸調(diào)控等作用［24］。PM2.5通過(guò)呼吸道到達(dá)肺泡表面并沉積，影響SP 的表達(dá)進(jìn)而造成肺組織損傷， 引起呼吸系統(tǒng)疾?。?5］。已有研究［8］證明高濃度PM2.5暴露下，顯著降低了A549 細(xì)胞和Balb/c 小鼠SP-A 蛋白的表達(dá)。眾所周知的是，SP-B 和SP-A 具有協(xié)同作用，執(zhí)行宿主防御活動(dòng)并調(diào)節(jié)表面活性劑的生物物理性質(zhì)，二者的功能合作在維持正常肺功能方面起到重要的保護(hù)作用［10，26］。有研究［27］表明，敲除SP-B 基因的小鼠和SP-B 基因突變的新生兒生后均死于呼吸窘迫。另外，LIN 等［28］發(fā)現(xiàn)用SP-B 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的CD59 特異性shRNA 包裝的JC 多瘤病毒樣顆粒能抑制人肺腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本課題組前期通過(guò)Gepia Cancer 和Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)SP-B 在肺癌組織中表達(dá)更低，且低表達(dá)SP-B 的肺癌患者生存期明顯縮短，提示SP-B 的表達(dá)可能作為肺癌的一種腫瘤標(biāo)志物。值得注意的是，目前關(guān)于PM2.5對(duì)SP-B 表達(dá)的影響及意義尚未見(jiàn)報(bào)道，所以我們?cè)赑M2.5誘導(dǎo)MLE-12 細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Western blotting 和qRT-PCR 檢測(cè)SP-B 的表達(dá)，結(jié)果顯示PM2.5濃度越高，SP-B 蛋白及mRNA表達(dá)下降越明顯，推測(cè)PM2.5致MLE-12 細(xì)胞損傷可能與SP-B 表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，PM2.5可導(dǎo)致MLE-12 細(xì)胞發(fā)生損傷，可呈劑量依賴性損傷細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)、抑制細(xì)胞活性，且下調(diào)SP-B 的表達(dá)。然而，單純檢測(cè)MLE-12 細(xì)胞的SP-B 蛋白和mRNA 變化尚不能闡明PM2.5的毒性機(jī)制問(wèn)題，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)比如觀察PM2.5對(duì)過(guò)表達(dá)或敲低SP-B 的MLE-12 細(xì)胞的損傷作用，以探討PM2.5的致毒機(jī)制，為PM2.5致肺損傷的治療策略提供一定科學(xué)依據(jù)。