枇杷成花相關(guān)基因EjWRKY12序列特性及表達(dá)分析

張葦胤,王素琴,馬崇堅(jiān),原 遠(yuǎn),楊曉燕,蔣園園*

(1 韶關(guān)學(xué)院 生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院,廣東韶關(guān) 512005;2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,廣州 510642)

枇杷(EriobotryajaponicaLindl.)原產(chǎn)于我國(guó)[1],屬薔薇科枇杷屬常綠果樹,主要分布于福建、江蘇、四川、浙江、陜西等省區(qū)。枇杷營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,市場(chǎng)前景廣闊,有“早熟第一果”的美譽(yù)。薔薇科植物的成花轉(zhuǎn)變時(shí)間和開花時(shí)間通常不在同一年內(nèi)發(fā)生,這種現(xiàn)象在蘋果、梨、草莓等植物中都會(huì)出現(xiàn),它們?cè)谙那锛竟?jié)花芽的分化,花芽在經(jīng)過(guò)休眠后第2年春季開花[2]。雖然枇杷花芽分化的起始時(shí)間與蘋果和梨相同,均發(fā)生在6月至7月,但是枇杷花芽的發(fā)育是連續(xù)的,不經(jīng)歷休眠,于秋冬開花[3]。枇杷這種特殊的開花習(xí)性,暗示其在進(jìn)化過(guò)程中可能產(chǎn)生了不同于其他木本植物的成花調(diào)控機(jī)制。

植物可以準(zhǔn)確地感知周圍環(huán)境的光周期變化并調(diào)節(jié)開花時(shí)間[4];此外,溫度、植物年齡和赤霉素(GA)信號(hào)也會(huì)影響植物開花[5]。這些信號(hào)之間不是獨(dú)立的,它們由許多成花整合因子整合,如FLOWERINGLOCUST(FT)和SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1(SOC1)、WRKY12。WRKY12是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子,可以通過(guò)整合光信號(hào)、赤霉素信號(hào)、年齡信號(hào)調(diào)控植物成花[6-7]。WRKY12是典型的WRKY家族成員,其N端含有保守的WRKYGQK功能域,C端含有1個(gè)C2H2結(jié)構(gòu)域[8-10]。WRKY基因家族僅在植物中被發(fā)現(xiàn),是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,在擬南芥中約有74個(gè)成員,水稻中則有100多個(gè)成員[11]。

在光周期途徑中,AtWRKY12參與擬南芥的開花調(diào)控,可以在短日照條件下促進(jìn)開花[7];在赤霉素途徑中,AtWRKY12與RGA-LIKE1(RGL1)和GA INSENSITIVE(GAI)互作并作用于FUL(FRUITFULL)啟動(dòng)子區(qū)域的W-box,促進(jìn)FUL表達(dá)并誘導(dǎo)植物開花[7]。SQUAMOSAPROMOTERBINDING-LIKE10(SPL10)可通過(guò)GTAC-motif與WRKY12的2個(gè)啟動(dòng)子片段結(jié)合并誘導(dǎo)其表達(dá)[6];同時(shí),WRKY12和WRKY13都可以與SPL10發(fā)生相互作用,WRKY12和WRKY13拮抗作用于SPL10,進(jìn)而調(diào)控miR172b的表達(dá),控制短日照條件下的開花[6]。另外,研究發(fā)現(xiàn)芒屬植物南荻中MlWRKY12基因在轉(zhuǎn)入擬南芥中后可以促進(jìn)擬南芥的開花[12]。這些結(jié)果表明,WRKY12基因能通過(guò)響應(yīng)不同的信號(hào)調(diào)控植物成花。

枇杷的開花習(xí)性明顯區(qū)別于薔薇科其他植物,但關(guān)于它的報(bào)道很少。迄今,已從栽培的枇杷中克隆了幾種花相關(guān)基因,如EjAP1[13]、EjFT[14]、EjLFY[15]、EjTFL1[16]、EjRAV1/2[17]、EjWUSa[18]、EjbHLH79[19]、EjAGL6[20]、EjFRI[21]、EjAGL17[22]、EjSPLs[23-24]、EjSOC1[25]和EjSVP[26]等。在野生臺(tái)灣枇杷恒春變型(E.deflexaNakai f.koshunensis)中也克隆得到了EdCO、EdGI、EdFT和EdFD[27-28]。在這些研究中枇杷中的同源基因功能相對(duì)保守,但是尚未見枇杷中的WRKY12同源基因相關(guān)報(bào)道,EjWRKY12基因是否參與枇杷成花還不清楚。本研究擬通過(guò)生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)分析和鑒定EjWRKY12的功能,為深入解析EjWRKY12調(diào)控枇杷成花的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),也為進(jìn)一步揭示枇杷成花的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試芽和葉均采自韶關(guān)學(xué)院生態(tài)園中正常生長(zhǎng)的枇杷品種‘解放鐘’成年樹。

RNA提取試劑盒EASY spin Plus植物RNA快速提取試劑盒購(gòu)于北京艾德萊生物科技有限公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Polymerase購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司,熒光定量試劑盒iTaqTMuniversal SYBR?Green Supermix試劑盒購(gòu)于Bio-Rad公司。

1.2 方 法

1.2.1EjWRKY12基因cDNA序列的克隆

根據(jù)EASY spin Plus植物RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書,從‘解放鐘’枇杷的芽及葉中提取RNA。在對(duì)RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)以確保其完整性,并使用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和質(zhì)量后,用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Polymerase進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA第一鏈。

根據(jù)擬南芥tair(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取AtWRKY12(AT2G44745)序列信息,然后使用TB-tools工具[29],比對(duì)到已發(fā)表枇杷基因組[30],得到AtWRKY12的同源基因EjWRKY12,設(shè)計(jì)特異克隆引物見表1,利用 Prime-STAR?Max DNA Polymerase(Takara)以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶正確后使用凝膠DNA微量回收試劑盒(Magen)進(jìn)行回收,回收產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體(Promega)連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(cè),選取含目的條帶菌液送至生工生物公司測(cè)序,得到EjWRKY12基因序列信息。

表1 EjWRKY12 克隆和載體構(gòu)建所用引物序列

1.2.2EjWRKY12基因生物信息學(xué)分析

利用ExPASy Translate tool(https://web.expasy.org/translate/)對(duì)EjWRKY12基因進(jìn)行翻譯,并利用ExPASy ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)分析該氨基酸序列的等電點(diǎn)(pI)、分子量(MW)、蛋白不穩(wěn)定性指數(shù)等。用在線網(wǎng)站https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,使用 https://swissmodel.expasy.org/預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型,利用軟件Chimera分析獲得該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找與EjWRKY12蛋白有較高同源性的氨基酸,并將EjWRKY12氨基酸序列與同源蛋白進(jìn)行比對(duì),利用MEGA7軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.3EjWRKY12基因啟動(dòng)子區(qū)分析

利用TB-tools軟件[29],從枇杷基因組中獲取EjWRKY12起始密碼子上游2 000 bp啟動(dòng)子區(qū)域,利用在線網(wǎng)站PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/)預(yù)測(cè)該基因啟動(dòng)子序列的保守順式元件基序以進(jìn)一步分析。

1.2.4 EjWRKY12亞細(xì)胞定位分析

Cell-PLoc 2.0在線網(wǎng)站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),將不含終止密碼子的EjWRKY12編碼區(qū)克隆到35S-GFP載體中,將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒通過(guò)農(nóng)桿菌侵染法將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到煙草葉片中(載體構(gòu)建引物見表1)。

1.2.5EjWRKY12基因表達(dá)分析

利用已發(fā)表的枇杷成花過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[31],對(duì)EjWAKY12基因在外源 GA3處理后于枇杷芽、葉中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)樣品獲取方法:樹木噴灑含有0.1%(V/V)磷酸、0.025%(V/V)曲拉通X-100(表面活性劑)以及300 mg/L GA3的水溶液。對(duì)照組植株則噴灑含有0.1%(V/V)磷酸和0.025%(V/V)曲拉通X-100的溶液,每2周噴灑1次(2019年5月18日至8月10日),對(duì)所有葉片和頂部芽進(jìn)行噴灑(整株噴施,所有葉片開始滴水)。枇杷花芽的分化開端發(fā)生在6月底至7月初[3]。因此,GA3處理組和對(duì)照組的取樣時(shí)間為5月25日、6月29日和8月17日。

2 結(jié)果與分析

2.1 EjWRKY12基因克隆

以‘解放鐘’枇杷為材料,取頂芽及葉片提取總RNA,以反轉(zhuǎn)錄合成得到的cDNA為模板,利用PCR擴(kuò)增EjWRKY12的CDS全長(zhǎng)序列。經(jīng)凝膠電泳檢測(cè),PCR產(chǎn)物條帶大小與基因組組裝該基因的長(zhǎng)度一致(圖1,A)。連接pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5α),測(cè)序獲得EjWRKY12CDS全長(zhǎng)序列,結(jié)果顯示EjWRKY12基因CDS區(qū)長(zhǎng)度為711 bp,編碼236個(gè)氨基酸(圖1,B)。

A.克隆得到EjWRKY12的電泳圖;B. EjWRKY12的CDS序列及其翻譯的氨基酸序列。

2.2 EjWRKY12進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步探究EjWRKY12結(jié)構(gòu)和功能的特性,將EjWRKY12與已經(jīng)報(bào)道的同源蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析,結(jié)果顯示,推導(dǎo)的EjWRKY12氨基酸序列與來(lái)自蘋果梨、煙草、大豆及擬南芥等其他WRKY12直系同源物結(jié)構(gòu)相對(duì)保守,都具有高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域(圖2,A)。結(jié)果顯示,EjWRKY12蛋白與蘋果、梨等蘋果亞科聚在同一小支,且其與大多數(shù)薔薇科植物如桃、薔薇等聚在同一大支,說(shuō)明親緣關(guān)系最為接近,亦印證枇杷屬薔薇科蘋果亞科的植物學(xué)分類。

A.幾種植物EjWRKY12蛋白的氨基酸序列比對(duì),紅色線條標(biāo)注的是WRKY結(jié)構(gòu)域;B.來(lái)自不同物種的EjWRKY12同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析。

此外,比對(duì)得到的同源基因大多與成花相關(guān),暗示EjWRKY12蛋白可能功能保守,推測(cè)其參與枇杷成花過(guò)程。

2.3 EjWRKY12基因生物信息學(xué)分析

2.3.1EjWRKY12基因理化性質(zhì)分析

利用ExPASy ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)網(wǎng)站對(duì)EjWRKY12編碼的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,EjWRKY12蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為26.8 kD,等電點(diǎn)為8.17,負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)為25,正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為27。其原子總數(shù)為3 629,分子式為C1138H1749N357O373S12,估算半衰期為30 h,不穩(wěn)定系數(shù)[instability index(II)]為48.78,表明該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。

脂溶系數(shù)(aliphatic index)為43.73, 總平均親水性(grand average of hydropathy,GRAVY)評(píng)估值為-1.022,表明EjWRKY12蛋白為親水蛋白。通過(guò)ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)在線網(wǎng)站對(duì)該蛋白疏水性進(jìn)行分析,其親水部分大于疏水部分(圖3,A),同時(shí)驗(yàn)證了ExPASy ProtParam tool的分析結(jié)果。

2.3.2 EjWRKY12蛋白結(jié)構(gòu)分析

對(duì)EjWRKY12蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析可知,該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲組成(圖3,B)。EjWRKY12蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)最多的結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)則卷曲,占60.59%;其次為β-折疊,占28.39%;另外,α-螺旋則較少,占比11.02%。對(duì)EjWRKY12的氨基酸序列進(jìn)行建模(圖3,C)后,再利用軟件Chimera分析獲得該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)表面結(jié)構(gòu)(圖3,D),其表面結(jié)構(gòu)的藍(lán)色表示親水氨基酸,白色表示疏水氨基酸。

通過(guò)對(duì)EjWRKY12的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析,可以預(yù)測(cè)蛋白的功能位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)氨基酸理化性質(zhì)分析,預(yù)測(cè)該蛋白是親水蛋白,但白色的疏水氨基酸位點(diǎn)可能會(huì)進(jìn)一步形成疏水空間,有可能與其他生物分子結(jié)合從而發(fā)揮其功能。

2.3.3EjWRKY12基因啟動(dòng)子區(qū)分析

使用TB-tools軟件[29]從枇杷基因組序列中獲取EjWRKY12起始密碼子ATG上游2 000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域,序列信息見NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),序列ID為OR476020。經(jīng)PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)該基因啟動(dòng)子序列的保守順式元件基序。EjWRKY12基因的啟動(dòng)子序列包含125個(gè)保守的順式結(jié)構(gòu)元件,其中包括33個(gè)與轉(zhuǎn)錄起始頻率相關(guān)的CAAT-box,以及23個(gè)真核生物RNA聚合酶II識(shí)別位點(diǎn)TATA-box啟動(dòng)子核心元件。見表2。此外,其含有TCT-motif、GATA-motif、I-box、Box 4、AE-box等12個(gè)光響應(yīng)元件,8個(gè)茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)誘導(dǎo)元件TGACG-motif(4個(gè))和CGTCA-motif(4個(gè)),以及MYB結(jié)合位點(diǎn)和識(shí)別位點(diǎn)、參與生長(zhǎng)素反應(yīng)的順式作用調(diào)節(jié)元件AuxRR-core等。該預(yù)測(cè)結(jié)果暗示EjWRKY12基因可能受到光、MeJA、生長(zhǎng)素等內(nèi)外因素的調(diào)控。

表2 EjWRKY12啟動(dòng)子上的順式作用元件

2.4 EjWRKY12蛋白亞細(xì)胞定位分析

EjWRKY12的氨基酸序列在在線網(wǎng)站Cell-PLoc 2.0進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),結(jié)果顯示EjWRKY12定位在細(xì)胞核,符合一般轉(zhuǎn)錄因子特征。為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果,筆者構(gòu)建了35S:EjWRKY12-GFP載體,將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒通過(guò)農(nóng)桿菌侵染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到煙草葉片中。在熒光顯微鏡下,可以看到,35S:GFP空載(對(duì)照)綠色熒光信號(hào)定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,而35S:EjWRKY12-GFP融合蛋白定位在細(xì)胞核(圖4),與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。結(jié)果表明,EjWRKY12基因在細(xì)胞核表達(dá),起轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。

圖4 EjWRKY12蛋白亞細(xì)胞定位圖

2.5 EjWRKY12基因表達(dá)分析

枇杷在6月底啟動(dòng)花芽分化,經(jīng)外源GA3處理枇杷植株后,枇杷成花受到抑制[3,16]。本研究,調(diào)取EjWRKY12在枇杷成花過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),結(jié)果表明,EjWRKY12在對(duì)照組的枇杷頂芽中,成花的關(guān)鍵時(shí)期的EjWRKY12基因表達(dá)量最低,但在GA3處理期間,該基因表達(dá)量隨著處理時(shí)間推移一直上升(圖5,A);在GA3處理組和對(duì)照組葉片中的EjWRKY12表達(dá)量及表達(dá)趨勢(shì)變化不大(圖5,B)。而在Jiang等人的研究中顯示GA3處理后枇杷處于旺盛的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng),不能成花[3,16]。暗示EjWRKY12基因可能抑制枇杷成花,可能具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的作用。

A.在頂芽中的表達(dá)量;B.在葉片中的表達(dá)量。

3 討 論

WRKY家族中各成員功能各異,它們廣泛參與植物對(duì)逆境的抗性反應(yīng),同時(shí)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[9],在這項(xiàng)研究中,筆者從枇杷的芽和葉片中克隆了枇杷EjWRKY12基因,該基因的CDS區(qū)長(zhǎng)度為711個(gè)堿基對(duì),編碼236個(gè)氨基酸,具有典型的WRKY家族結(jié)構(gòu)特征[8-9],包含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域,屬于WRKY家族成員之一。

將EjWRKY12的氨基酸序列在NCBI與已經(jīng)發(fā)表或登錄的同源基因進(jìn)行比對(duì),構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,在進(jìn)化樹中處于同一分支的氨基酸具有較高同源性,可推測(cè)枇杷中該基因的功能。本研究中克隆獲得的EjWRKY12基因與山梨、白梨、蘋果等同源性較高。為明確EjWRKY12基因的表達(dá)模式,前期研究中利用外源GA3對(duì)‘解放鐘’枇杷植株進(jìn)行處理,并成功抑制開花[3]?；虮磉_(dá)結(jié)果顯示,EjWRKY12基因表達(dá)量隨GA3處理時(shí)間的延長(zhǎng)而上升,故推測(cè)其可能是具有抑制成花功能的轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)該基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)含有參與生長(zhǎng)素反應(yīng)的順式作用調(diào)節(jié)元件AuxRR-core,內(nèi)源激素中多種激素能相互影響并發(fā)揮作用,如赤霉素與生長(zhǎng)素互為協(xié)同作用,共同調(diào)控花芽分化[32],故可做進(jìn)一步推測(cè)EjWRKY12響應(yīng)GA3信號(hào),并介導(dǎo)生長(zhǎng)素信號(hào),對(duì)枇杷成花發(fā)揮抑制作用,但是其響應(yīng)機(jī)制還需更進(jìn)一步研究證明。

半衰期可用于衡量目標(biāo)蛋白在體內(nèi)的穩(wěn)定性,而不穩(wěn)定系數(shù)則可用于衡量其在體外的穩(wěn)定性[33]。這些指標(biāo)對(duì)于深入探究EjWRKY12蛋白的功能結(jié)果非常有參考價(jià)值。在后續(xù)的蛋白驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中,由于EjWRKY12蛋白不穩(wěn)定,需要盡快完成體外實(shí)驗(yàn),以避免降解對(duì)結(jié)果的影響。此外,通過(guò)預(yù)測(cè)蛋白的親疏水性,可以推測(cè)跨膜區(qū)域[34],由于跨膜區(qū)通常較為疏水,因此可以推測(cè)EjWRKY12蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)。

利用外源GA3處理后,發(fā)現(xiàn)EjWRKY12的表達(dá)差異主要發(fā)生在芽中,在葉片中表達(dá)差異不大,說(shuō)明其主要在芽中起調(diào)節(jié)成花的作用。本研究克隆了枇杷EjWRKY12基因,并對(duì)其結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子區(qū)域及基因表達(dá)模式進(jìn)行了初步分析,但是EjWRKY12基因的具體功能仍需進(jìn)一步驗(yàn)證;同時(shí),依據(jù)預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子區(qū)域保守順式結(jié)構(gòu)元件,可在今后的研究中深入探究EjWRKY12在不同環(huán)境條件因素處理下的表達(dá)量變化及其作用機(jī)制,以進(jìn)一步完善其功能。