茶樹(shù)4CL基因家族的全基因組鑒定及表達(dá)分析

任衛(wèi)威,高 婷,邵淑賢,侯炳豪,廖獻(xiàn)盛,葉乃興

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350002)

茶樹(shù)[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]是中國(guó)重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物[1],4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate coenzyme A ligase,4CL)是植物苯丙烷代謝途徑中,類(lèi)黃酮生物合成的第一步,同時(shí)也是木質(zhì)素生物合成特異途徑的關(guān)鍵酶[2]。pfam數(shù)據(jù)庫(kù)顯示,它有AMP結(jié)合酶(PF00501)和AMP結(jié)合酶C端結(jié)構(gòu)域(PF13193)2個(gè)保守域。此外,4CL還存在2個(gè)高度保守的序列,分別是BOX Ⅰ(SSGTTGLPKGV)和BOX Ⅱ(GEICIRG),負(fù)責(zé)識(shí)別、結(jié)合和催化反應(yīng)底物形成相應(yīng)的輔酶A[3]。對(duì)4CL的研究從20世紀(jì)70年代初開(kāi)始,近30年來(lái)植物4CL基因已經(jīng)被從水稻[4]、擬南芥[5]、煙草[6]、大豆[7]、楊樹(shù)[8]、覆盆子[9]、桑樹(shù)[10]、黑麥草[10]等40多種植物中相繼克隆出來(lái)[12]。有研究表明擬南芥中At4CL1、At4CL2、At4CL4參與了木質(zhì)素的合成[5],At4CL3和水稻中的Os4CL2參與了類(lèi)黃酮的生物合成。類(lèi)黃酮化合物是茶樹(shù)重要的次生代謝產(chǎn)物,與茶葉品質(zhì)形成密切相關(guān)[14]。朱晨[15]研究表明類(lèi)黃酮與烏龍茶滋味密切相關(guān),是茶葉苦澀味形成的主要原因;邵淑賢等[16]研究發(fā)現(xiàn)類(lèi)黃酮含量較低是黃觀音滋味醇和的重要原因;此外,類(lèi)黃酮對(duì)提高植物脅迫的抗性具有重要作用;在茶樹(shù)中,類(lèi)黃酮具有清除自由基[14]、逆境脅迫響應(yīng)[17]等作用。

茶樹(shù)品種‘黃棪’(C.sinensis‘Huangdan’)和‘鐵觀音’(C.sinensis‘Tie-guanyin’)原產(chǎn)于福建省安溪縣,是烏龍茶類(lèi)茶樹(shù)育種的核心種質(zhì)資源[18]。目前,烏龍茶品種‘黃棪’[19]和‘鐵觀音’[20]的單體型染色體級(jí)別基因組于2021年5月和7月相繼發(fā)布。前人已從福鼎大白茶[21]和舒茶早[22]茶樹(shù)品種中克隆出4CL基因,Rain等研究發(fā)現(xiàn)Cs4CL表達(dá)與類(lèi)黃酮含量呈正相關(guān)[23]。但目前對(duì)4CL基因參與茶樹(shù)非生物脅迫響應(yīng)的研究較少,因此本研究運(yùn)用生物信息學(xué),在全基因組水平上鑒定‘黃棪’和‘鐵觀音’茶樹(shù)4CL基因家族,系統(tǒng)分析茶樹(shù)4CL的基本結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及系統(tǒng)發(fā)育,并利用qRT-PCR技術(shù)研究茶樹(shù)4CL基因家族在GA、MeJA、ABA、低溫和干旱處理下的表達(dá)模式,以期對(duì)茶樹(shù)4CL基因家族參與非生物脅迫響應(yīng)的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料處理

試驗(yàn)材料來(lái)源于福建農(nóng)林大學(xué)教學(xué)茶場(chǎng),選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致盆栽‘黃棪’茶樹(shù)為試驗(yàn)材料。將環(huán)境溫度下的茶樹(shù)放入4 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行模擬低溫處理;將‘黃棪’茶樹(shù)從盆栽中拔出,根部洗凈后放入10% PEG-6000中模擬干旱處理。用配制好的100 μmol/L的GA、MeJA和ABA溶液進(jìn)行激素噴施處理。收集5 種處理的0(對(duì)照組,CK),3,6,12,24 h后的茶樹(shù)新稍頂芽下第二葉,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),用錫箔紙包裹放入液氮中固樣,放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 茶樹(shù)4CL基因家族鑒定

在pfam(http://pfam-legacy.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載PF00501和PF13193的隱馬可夫模型,分別從茶樹(shù)‘黃棪’和‘鐵觀音’基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載蛋白序列,利用HMMER軟件篩選出4CL基因家族的候選序列,去除結(jié)構(gòu)域不完整的基因序列,再利用SMARAT(http://smart.embl-heidelberg.de)和NCBI CCD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)網(wǎng)站進(jìn)行結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證,滿(mǎn)足2個(gè)網(wǎng)站驗(yàn)證的為‘鐵觀音’茶樹(shù)和‘黃棪’茶樹(shù)4CL基因家族成員。將得到的‘黃棪’和‘鐵觀音’4CL基因家族成員序列,分別用WOLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp)網(wǎng)站和ExPASy(http://www.expasy.org)網(wǎng)站進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.3 茶樹(shù)4CL家族成員染色體定位與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用TBtools軟件將基因文件中在染色體上的分布情況進(jìn)行可視化處理。從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)下載楊樹(shù)、擬南芥、大豆、水稻、川桑、覆盆子及黑麥草的蛋白序列,利用MEGA 7.0軟件,選擇鄰接法,校驗(yàn)值Bootstrap設(shè)置設(shè)為1 000重復(fù),構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),利用chiopt(https://www.chiplot.online)進(jìn)行美化。

1.4 茶樹(shù)4CL基因家族成員基因結(jié)構(gòu)、保守基序分析及蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

用 GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)網(wǎng)站分析茶樹(shù)4CL基因結(jié)構(gòu),將得到的茶樹(shù)4CL蛋白序列上傳到MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)預(yù)測(cè)其保守基序,利用DNAMAN軟件和WebLogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)網(wǎng)站進(jìn)行多序列比對(duì)分析。

1.5 茶樹(shù)4CL基因家族成員啟動(dòng)子順式元件分析及組織特異性表達(dá)

用TBtools提取茶樹(shù)HD-Cs4CL和TGY-Cs4CL基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp序列,將得到的序列文件上傳至PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)網(wǎng)站預(yù)測(cè)啟動(dòng)子順式元件。下載‘黃棪’和‘鐵觀音’的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),參照前人方法[24],使用TopHat2軟件將轉(zhuǎn)錄組所有可用讀數(shù)映射到茶樹(shù)基因組,然后通過(guò)HTseq軟件計(jì)算HD-Cs4CL和TGY-Cs4CL基因在芽、嫩葉、老葉、根和莖上的FPKM值,利用TBtools軟件繪制基因在茶樹(shù)不同組織上的特異表達(dá)熱圖。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

根據(jù)基因組織特異性表達(dá)分析結(jié)果,選取在芽和嫩葉中高表達(dá)的基因,利用primer3plus網(wǎng)站上進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1),內(nèi)參基因CsGAPDH登錄號(hào)為GE651107[25]。qRT-PCR反應(yīng)在CFX96 Touch熒光定量PCR儀上進(jìn)行,反應(yīng)體系參照Transstart?Tip green qPCR superMix試劑盒方法,反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s;40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[26],用prism軟件統(tǒng)計(jì)基因表達(dá)水平,用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)4CL家族成員鑒定與蛋白理化性質(zhì)分析

通過(guò)‘黃棪’和‘鐵觀音’基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的比較鑒定,分別得到8條和9條4CL基因家族成員,繪制其在15條染色體上的分布圖(圖1)。結(jié)果顯示,HD-Cs4CL在5條染色體上有分布,分別是Chr02、Chr04、Chr07、Chr13和Chr15,其中在Chr07和Chr15上分布有2條基因,其余均僅有1條基因分布。TGY-Cs4CL則分布在Chr02、Chr06、Chr07、Chr011、Chr12、Chr13、Chr15這7條染色體上,其中在Chr02和Chr07上分布有2條基因,其余均僅有1條基因分布。根據(jù)結(jié)果將上述基因命名為HD-Cs4CL1～8和TGY-Cs4CL1～9(表2)。

A.HD-Cs4CL染色體定位;B.TGY-Cs4CL染色體定位。

表2 茶樹(shù)4CL基因家族的序列特征

茶樹(shù)4CL家族的分子量在24.00～143.45 kD,等電點(diǎn)4.91～5.36,茶樹(shù)4CL蛋白的等電點(diǎn)小于7,表明該家族基因?yàn)樗嵝缘鞍?。茶?shù)4CL除HD-Cs4CL2外均為親水性蛋白。茶樹(shù)4CL編碼序列288～1 713 bp,編碼氨基酸數(shù)目為542～578。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),有12個(gè)茶樹(shù)4CL家族成員定位在質(zhì)膜上,3個(gè)成員定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,細(xì)胞核和線粒體上分別定位有1個(gè)成員?？梢钥闯?HD-Cs4CL基因定位于線粒體、質(zhì)膜和細(xì)胞核上,而TGY-Cs4CL基因僅定位質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。

2.2 茶樹(shù)4CL家族成員系統(tǒng)發(fā)育與分類(lèi)分析

為確定茶樹(shù)4CL與其他物種4CL基因之間的關(guān)系,選取擬南芥、水稻等植物構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。結(jié)果顯示,9種植物4CL基因被分為A和B兩組,A組中‘黃棪’茶樹(shù)有2個(gè)成員HD-Cs4CL3和HD-Cs4CL7、‘鐵觀音’茶樹(shù)僅有1個(gè)成員TGY-Cs4CL2和擬南芥At4CL1、At4CL2、At4CL4聚類(lèi),屬于第Ⅰ亞家族;2個(gè)家族成員HD-Cs4CL2和TGY-Cs4CL5與擬南芥At4CL3以及水稻Os4CL2聚類(lèi),屬于第Ⅱ亞家族;第Ⅲ亞家族只有單子葉植物水稻和黑麥草4CL聚類(lèi),無(wú)茶樹(shù)4CL家族成員聚類(lèi)。B組中其余茶樹(shù)4CL家族成員聚類(lèi)在一起。

At.擬南芥;Pto.楊樹(shù);Os.水稻;Gm.大豆;Nt.煙草;Mn.桑樹(shù);Ri.覆盆子;Lp.黑麥草。

2.3 茶樹(shù)4CL家族基因結(jié)構(gòu)、保守基序與蛋白保守結(jié)構(gòu)域比較

茶樹(shù)4CL基因結(jié)構(gòu)圖(圖3)顯示,除HD-Cs4CL2和HD-Cs4CL6外均含有內(nèi)含子,其中HD-Cs4CL1基因組序列最長(zhǎng),超過(guò)22 kb,HD-Cs4CL2和HD-Cs4CL6基因組序列較短,不足1 kb。除HD-Cs4CL2(2個(gè))、HD-Cs4CL6(1個(gè))、HD-Cs4CL1和TGY-Cs4CL4(4個(gè))、HD-Cs4CL5、HD-Cs4CL7和TGY-Cs4CL6(5個(gè))外,其余基因均有6個(gè)外顯子。

A.茶樹(shù)4CL家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù);B.茶樹(shù)4CL家族基因結(jié)構(gòu)。

茶樹(shù)4CL保守基序圖(圖4)顯示,HD-Cs4CL1～8和TGY-Cs4CL1～9均含有motif(1～13),BOX Ⅰ存在于motif3中,BOX Ⅱ存在于motif5中,所有基因均含有這2個(gè)基序,motif16和motif20僅存在于HD-Cs4CL2/3/7和TGY-Cs4CL2/5;HD-Cs4CL2/6和TGY-Cs4CL5/8含有motif14;motif16僅存在TGY-Cs4CL1/3/9和HD-Cs4CL4中;motif17僅存在于HD-Cs4CL3/7和TGY-Cs4CL2。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果,同一分支成員具有相似基序組成及排列順序,這和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一致。

A.茶樹(shù)4CL家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù);B.茶樹(shù)4CL蛋白保守基序。

茶樹(shù)4CL結(jié)構(gòu)域的多序列比對(duì)(圖5)顯示,HD-C4CL2、TGY-Cs4CL2、HD-Cs4CL3、TGYCs4CL5和HD-Cs4CL7這5條基因的蛋白包含保守結(jié)構(gòu)域BOX Ⅰ(SSGTTGLPKGV)和BOX Ⅱ (GEICIRG),其他基因在BOX Ⅰ和BOX Ⅱ上均存在2個(gè)氨基酸突變。

A.利用DNAMAN軟件對(duì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行對(duì)齊;B.序列保守性。

2.4 茶樹(shù)4CL家族基因啟動(dòng)子順式元件分析

對(duì)茶樹(shù)4CL基因家族啟動(dòng)子順式元件進(jìn)行分析,結(jié)果(圖6)顯示,參與光響應(yīng)的有Box4(89個(gè))、G-box(45個(gè))、GT1-motif(27個(gè))、GATA-motif(9個(gè))和MRE(6個(gè))等元件。脫落酸(ABRE,43個(gè))、生長(zhǎng)素(AuxRR-core,1個(gè);TGA-element,6個(gè))、茉莉酸甲酯(CGTCA-motif/TGACG-motif,16個(gè))、赤霉素(GARE-motif,4個(gè);as-1,16個(gè);TATC-box,7個(gè))和水楊酸(TCA-element,11個(gè))等激素響應(yīng)元件。此外,還發(fā)現(xiàn)厭氧誘導(dǎo)(ARE,37個(gè))、低溫應(yīng)答(LIR,5個(gè))、干旱誘導(dǎo)(MBS,5個(gè))、防御與應(yīng)激(TC-rich repeats,10個(gè))和機(jī)械損傷(WUN-motif,19個(gè))脅迫響應(yīng)元件,與植物生長(zhǎng)相關(guān)的元件有分生組織表達(dá)調(diào)控(CAT-box,5個(gè))、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)(O2-site,5個(gè))和胚乳表達(dá)調(diào)控(GCN4-motif,5個(gè))等。此外,4CL基因中還存在大量的MYB響應(yīng)元件。

圖6 茶樹(shù)4CL基因家族啟動(dòng)子順式元件分析

2.5 茶樹(shù)4CL家族基因組織特異性表達(dá)

為探究茶樹(shù)4CL基因各成員在茶樹(shù)不同組織中的作用,繪制出組織表達(dá)譜(圖7)。如圖7所示,HD-Cs4CL1、TGY-Cs4CL4和TGYCs4CL9在根中的表達(dá)量明顯高于其他組織;HD-Cs4CL3、HD-Cs4CL7、TGY-Cs4CL2和TGY-Cs4CL8主要在莖中表達(dá);HD-Cs4CL8、TGY-Cs4CL3和TGY-Cs4CL6主要在老葉中表達(dá);HD-Cs4CL2、HD-Cs4CL5和TGY-Cs4CL1主要在嫩葉中表達(dá);HD-Cs4CL7主要在芽中表達(dá);HD-Cs4CL6主要在老葉和嫩葉中表達(dá);HD-Cs4CL4和TGY-Cs4CL5主要在芽和嫩葉中表達(dá)。綜上,‘黃棪’和‘鐵觀音’茶樹(shù)4CL基因在不同組織中表達(dá)量存在差異。

圖7 HD-Cs4CL和TGY-Cs4CL基因在5個(gè)組織中的表達(dá)譜

2.6 茶樹(shù)4CL基因在不同激素和逆境下的表達(dá)模式

篩選出7個(gè)在芽和幼葉中表達(dá)量較高的茶樹(shù)4CL基因,并對(duì)其進(jìn)行GA、MeJA、ABA、低溫和干旱處理下的表達(dá)量進(jìn)行分析(圖8、圖9),進(jìn)而探究茶樹(shù)4CL基因家族在逆境下的作用。

2.6.1 茶樹(shù)4CL基因在GA、MeJA和ABA激素作用下的表達(dá)模式

在GA激素處理下,HD-Cs4CL6表達(dá)量顯著上升,在6 h表達(dá)量達(dá)到峰值,達(dá)到120.9倍;HD-Cs4CL8在12 h達(dá)到峰值,為140.8倍;HD-Cs4CL2、HD-Cs4CL4和HD-Cs4CL5表達(dá)量下降;HD-Cs4CL3表達(dá)量先下降后略有上調(diào);HD-Cs4CL7僅在3 h表達(dá)量降低。

在MeJA激素處理下,HD-Cs4CL6表達(dá)量在12 h達(dá)到最高峰,為91.9倍;HD-Cs4CL8表達(dá)量在6 h達(dá)到峰值,達(dá)到69.3倍;HD-Cs4CL2、HD-Cs4CL3、HD-Cs4CL4和HD-Cs4CL7表達(dá)量均表現(xiàn)為下調(diào)趨勢(shì);HD-Cs4CL5在0～6 h為下調(diào)趨勢(shì),6～12 h表達(dá)量為上調(diào)。在ABA激素處理下,HD-Cs4CL6和HD-Cs4CL8表達(dá)量在6 h時(shí)達(dá)到峰值,它們分別達(dá)到225.9,208.4倍;HD-Cs4CL2、HD-Cs4CL3和HD-Cs4CL7表達(dá)量均于6 h達(dá)到峰值,分別是1.9,3,1.7倍;HD-Cs4CL4和HD-Cs4CL5表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)。

2.6.2 茶樹(shù)4CL基因在低溫和干旱脅迫作用下的表達(dá)模式

在低溫處理下,HD-Cs4CL6表達(dá)量呈現(xiàn)先上調(diào)后下降的趨勢(shì),在3 h達(dá)到峰值,達(dá)到19.9倍;HD-Cs4CL7總體上呈現(xiàn)先下降后上調(diào)再下降的趨勢(shì),在6 h達(dá)到峰值達(dá)1.03倍;HD-Cs4CL8表達(dá)量持續(xù)上調(diào)在24 h達(dá)到峰值,達(dá)到61.9倍;HD-Cs4CL2、HD-Cs4CL3、HD-Cs4CL4和HD-Cs4CL5表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

在干旱處理下,HD-Cs4CL6和HD-Cs4CL8在3 h表達(dá)量顯著上調(diào),3～6 h顯著下降,6～24 h表達(dá)量持續(xù)上升,均在24 h達(dá)到峰值,分別達(dá)50倍和142.8倍;HD-Cs4CL2、HD-Cs4CL3和HD-Cs4CL4的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì),表達(dá)量總體上變化不明顯;HD-Cs4CL5和HD-Cs4CL7表達(dá)量均在24 h達(dá)到峰值,分別為1.7倍和1.6倍。

3 討 論

4CL基因家族已在40多種植物中被鑒定[12],其中番茄6個(gè)[27]、龍眼43個(gè)[28]、煙草20個(gè)[6]、辣椒8個(gè)[29]和桑樹(shù)4個(gè)成員[10],這表明不同物種間4CL家族成員數(shù)目有較大的差異。前人從福鼎大白茶和舒茶早中分別鑒定出1個(gè)和2個(gè)4CL家族成員[21-22],本研究從‘黃棪’和‘鐵觀音’基因組中分別篩選出8個(gè)和9個(gè)茶樹(shù)4CL基因。前人研究表明,在4CL蛋白序列中BOX Ⅰ絕對(duì)保守,BOX Ⅱ絕對(duì)保守[3],前人在福鼎大白茶和舒茶早中鑒定出的4CL蛋白序列也是絕對(duì)保守。茶樹(shù)4CL家族蛋白序列多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),HD-Cs4CL2、HD-Cs4CL3、HD-Cs4CL7、TGY-Cs4CL2和TGY-Cs4CL5具有共同的保守結(jié)構(gòu)域BOX Ⅰ和BOX Ⅱ。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析,保守結(jié)構(gòu)域中氨基酸突變的基因均屬于B組,而B(niǎo)組基因與現(xiàn)已知Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類(lèi)亞家族均有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系,進(jìn)而推測(cè)它們可能屬于4CL類(lèi)似蛋白,這和桑樹(shù)的研究[10]一致。本研究中B組4CL基因在BOX Ⅰ和BOX Ⅱ保守結(jié)構(gòu)域中均有2個(gè)氨基酸突變,推測(cè)它們可能在進(jìn)化進(jìn)程中功能發(fā)生了分化,會(huì)識(shí)別與結(jié)合其他不同的產(chǎn)物[30]。

茶樹(shù)在種植過(guò)程中可能會(huì)受到各種生物與干旱、低溫等非生物脅迫,會(huì)影響茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育,進(jìn)而影響茶葉的品質(zhì)與產(chǎn)量[31]。PEG模擬干旱、MeJA處理和ABA處理都會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞中ROS大量積累[32-33],ROS大量積累是導(dǎo)致植物非生物脅迫的重要原因[34],類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)ROS有很強(qiáng)的清除能力[35],木質(zhì)素是次生壁的主要成分之一,對(duì)植物的生物與非生物脅迫抵抗具有重要影響[29]。已有研究證實(shí)擬南芥At4CL3、桑樹(shù)Mn4CL3參與類(lèi)黃酮的生物合成。本研究中,HD-Cs4CL2和TGY-Cs4CL5與擬南芥At4CL3聚類(lèi)在一起,推測(cè)其可能參與茶樹(shù)類(lèi)黃酮的生物合成。擬南芥At4CL1/2/4、桑樹(shù)Mn4CL1/2/4參與木質(zhì)素生物合成[5,10]。HD-Cs4CL3、HD-Cs4CL7、TGY-Cs4CL2和擬南芥At4CL1、At4CL2及At4CL4聚類(lèi),推測(cè)其可能參與茶樹(shù)木質(zhì)素的生物合成。

研究發(fā)現(xiàn)在基因啟動(dòng)子順式元件分析中,存在許多抗逆、防御及應(yīng)激相關(guān)的順式作用元件,與植物抵抗非生物脅迫具有直接或間接的關(guān)系[34]。結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn),證實(shí)茶樹(shù)4CL基因參與了對(duì)多種非生物脅迫的響應(yīng)。Nie等[36]研究發(fā)現(xiàn)土豆St4CL6和St4CL8在MeJA、ABA和PEG脅迫中表達(dá)量上調(diào),Rain等[23]研究發(fā)現(xiàn)ABA處理Cs4CL表達(dá)量上調(diào),本研究中HD-Cs4CL6和HD-Cs4CL8表現(xiàn)與其一致,HD-Cs4CL3和HD-Cs4CL7在ABA處理和干旱處理下表達(dá)量上調(diào),而HD-Cs4CL2僅在ABA處理下表達(dá)量上調(diào)。焦健青[37]研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃Ac4CL3/4/5/7在低溫處理下基因表達(dá)量上調(diào),李小蘭等[38]研究發(fā)現(xiàn)桃中4CL基因也在低溫處理下表達(dá)量上調(diào),本研究中Cs4CL6和HD-Cs4CL8在低溫處理下基因表達(dá)量上調(diào)。由此可見(jiàn),4CL基因可能在茶樹(shù)響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)茶樹(shù)4CL基因家族進(jìn)行茶樹(shù)全基因組范圍內(nèi)的鑒定,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)將茶樹(shù)4CL分為2個(gè)組別,并將A組分為3個(gè)亞家族,分析其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)4CL基因與木質(zhì)素及類(lèi)黃酮物質(zhì)合成相關(guān);通過(guò)順式作用元件分析及實(shí)時(shí)熒光PCR分析發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)4CL基因家族與茶樹(shù)非生物脅迫響應(yīng)緊密相關(guān)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究4CL基因家族參與茶樹(shù)非生物脅迫的響應(yīng)提供參考依據(jù)。