沙地云杉 LBD 基因家族鑒定及鹽脅迫響應分析

王亞萍, 隋明明,白玉娥

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 林學院,呼和浩特 010019)

沙地云杉(Piceamongolica)為松科(Pinaceae)云杉屬(Picea)常綠喬木,是中國珍稀瀕危樹種,也是北方地區(qū)防風固沙的優(yōu)良樹種,其自然分布在內(nèi)蒙古渾善達克沙地,具有耐旱、耐寒、耐沙埋的優(yōu)良抗性。因此吸引很多學者研究其分布、栽培、育苗和生理生化、體細胞胚胎發(fā)生等[1],但其分子生物學相關(guān)研究極少,特別是抗性基因挖掘研究有限,限制了其分子育種及抗性改良研究進程。

轉(zhuǎn)錄因子(TFs)通過調(diào)控基因表達來參與植物許多重要的植物發(fā)育過程,如細胞形態(tài)發(fā)生、信號轉(zhuǎn)導和環(huán)境脅迫反應[2]。其中,LBD基因家族是高等植物一大類轉(zhuǎn)錄因子之一,具有高度保守的側(cè)器官邊界(LOB)結(jié)構(gòu)域。LOB結(jié)構(gòu)域長度約為100個氨基酸,包含3個特定的保守結(jié)構(gòu)域,從N端到C端,分別是C結(jié)構(gòu)域(C-block)、Gly-Ala-Ser區(qū)域(GAS-block)和類亮氨酸拉鏈(LX6LX3LX6L)。C結(jié)構(gòu)域是DNA結(jié)合所需的,由高度保守的CX2CX6CX3C半胱氨酸基序組成;類亮氨酸拉鏈(LX6LX3LX6L)主要負責蛋白質(zhì)二聚化過程;GAS基序由49個氨基酸殘基組成,影響蛋白生物功能[3-4]。根據(jù)LOB結(jié)構(gòu)域不同,LBD蛋白可分為ClassⅠ類和ClassⅡ類。Ⅰ類LBD蛋白都含有C結(jié)構(gòu)域,GAS區(qū)域與亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu);而Ⅱ類蛋白只包含1個不完整的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu),不能形成螺旋結(jié)構(gòu)[5-7],然而,進一步將Ⅰ類細分為Ⅰa～Ⅰe 5個亞類,Ⅱ類分為Ⅱa和Ⅱb 2個亞類[8-9]。首個被發(fā)現(xiàn)的LBD基因是擬南芥中的AtLOB,該基因的表達存在組織特異性,只在側(cè)生器官的近軸端及側(cè)根基部表達[5-6]。近年來,隨著植物基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的不斷公布,分別在擬南芥[10]、煙草[11]、玉米[12]、水稻[6]、楊樹[13]、葡萄[14]、番茄[15]及大豆[16]中鑒定到43,98,44,35,57,30,46,46個LBD基因。目前的研究表明,LBD基因家族在植物葉、根和花發(fā)育、組織再生及脅迫響應過程起重要調(diào)控作用。如擬南芥LOB及LBD6參與調(diào)控葉片發(fā)育[3],LBD16和LBD29參與調(diào)控擬南芥?zhèn)雀鹗糩17],LBD15通過調(diào)控WUS基因參與頂端分生組織分化[18],LBD16、LBD17、LBD18及LBD19促進愈傷組織形成[19];水稻IG1基因調(diào)控水稻穎殼、花及雌配子體發(fā)育[20];大豆LBD12響應非生物脅迫(干旱、鹽、冷)和IAA、ABA及SA激素處理進程[16];番茄LBD40介導茉莉酸途徑負調(diào)控其抗旱性[21];香蕉LBD5參與茉莉酸信號轉(zhuǎn)導提高其耐寒性[22];擬南芥LBD37、LBD38和LBD39通過抑制花青素的生物合成來響應氮脅迫[23]。盡管LBD基因家族目前已在多個物種中被鑒定和研究,但在沙地云杉中的鑒定和研究還鮮見報道。

本研究以白音敖包自然保護區(qū)生長的沙地云杉為材料,通過參考挪威云杉基因組及前期沙地云杉轉(zhuǎn)錄組相關(guān)數(shù)據(jù),篩選并鑒定出30條沙地云杉LBD基因序列,利用生物信息學軟件分析所有LBD的理化性質(zhì);并運用多重序列比對對其進行結(jié)構(gòu)和保守性研究;構(gòu)建沙地云杉、擬南芥及楊樹LBD蛋白系統(tǒng)進化樹,分析其進化關(guān)系;利用qRT-PCR檢測LBD在沙地云杉不同組織及鹽脅迫下的表達水平,以期為進一步探究沙地云杉LBD基因家族非生物脅迫功能及分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

采取內(nèi)蒙古赤峰市白音敖包自然保護區(qū)沙地云杉同一母樹的成熟種子,將其播種于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學試驗田,培養(yǎng)條件為25 ℃,16 h光照/8 h黑暗條件,生長1年的幼苗分成葉片、莖、莖尖、主根、側(cè)根(3次生物學重復),所有樣品經(jīng)液氮速凍置于-80 ℃冰箱保存。將生長1年的沙地云杉幼苗進行200 mmol/L鹽脅迫處理,分別在處理0,6,12,24 h后采取整株樣本,液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 沙地云杉LBD基因篩選及理化性質(zhì)分析

為識別沙地云杉中的LBD蛋白,將從模式物種擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/)獲得43個LBD基因的氨基酸序列作為探針,利用BioEdit 7.2.0軟件[24]通過BLASTP比對和HMM比對2種方法對前期沙地云杉葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了局部BlastP搜索,使用默認參數(shù)和E值小于0.001,初步鑒定LBD轉(zhuǎn)錄因子候選基因,然后用SMART在線軟件對候選LBD蛋白序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析,保留具有完整LBD保守結(jié)構(gòu)域的序列,從挪威云杉基因組(https://plantgenie.org/)中進行比較,最終獲得沙地云杉云杉LBD基因成員,并根據(jù)它們的基因編號進行命名。使用在線軟件ProtParam(http://web. Expasy.org/protparam/)對沙地云杉LBD基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進行分析。利用ExPASy(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)計算LBD蛋白氨基酸殘基數(shù)、等電點(pI)、分子量(MV),利用CELLO v.2.5在線軟件預測LBD蛋白的亞細胞定位。

1.3 沙地云杉 LBD 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

從Phytozome13數(shù)據(jù)庫(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)獲取57個楊樹LBDs的蛋白序列,利用MEGA11軟件對43個擬南芥LBDs、57個楊樹LBDs及30個沙地云杉LBDs蛋白進行多重序列比對,再將多序列比對結(jié)果利用 MEGA11軟件采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建LBD系統(tǒng)進化樹,校驗參數(shù)設置成1 000次。系統(tǒng)進化樹使用Evolgenius在線軟件(http://www.evolgenius.info/evolview)及Adobe Illustrator 2022進行美化。

1.4 沙地云杉LBD保守結(jié)構(gòu)域分析

采用DNAMAN軟件沙地云杉30個LBDs序列進行保守域分析。為分析沙地云杉LBDs蛋白的保守Motif,通過MEME(http://meme-suite.org/)在線軟件對沙地云杉LBD進行保守Motif分析,將Motif數(shù)目設置為10,其他參數(shù)都被設置為默認值。

1.5 沙地云杉LBD的表達水平分析

使用TAKARA植物總RNA提取試劑盒分別從沙地云杉不同組織及鹽脅迫處理樣本提取總RNA,通過1.0%瓊脂凝膠電泳及Nanodrop2000測定其RNA完整性和濃度。逆轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物在-20 ℃中保存,將cDNA稀釋5倍后作為模板使用。使用Primer3設計qRT-PCR引物(表1)。采用羅氏實時熒光定量PCR儀進行擴增,以EF1α(MA_505653g0010)作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCT法計算各基因的相對表達量,并使用SPSS軟件進行顯著性差異分析。用TBtools和GraphPadPrism8軟件分別制作熱圖和柱狀圖。每個處理3個生物重復,每個樣本3個技術(shù)重復。

表1 PmLBD 基因家族表達分析的實時熒光定量引物

2 結(jié)果與分析

2.1 LBD 基因鑒定與蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

在沙地云杉中共鑒定到30個LBD基因,并根據(jù)基因在挪威云杉數(shù)據(jù)庫的編號進行命名為PmLBD1～PmLBD30。沙地云杉LBD基因的CDS長度從360(PmLBD3)～930 bp(PmLBD3);蛋白序列長度為119(PmLBD3)～309 aa(PmLBD15);分子量為10 545.15(PmLBD22)～33 359.17 D(PmLBD15);等電點為5.15(PmLBD7,PmLBD12)～9.26(PmLBD9);亞細胞定位結(jié)果顯示,30個沙地云杉LBD蛋白都位于細胞核內(nèi),見表2。

表2 沙地云杉 LBD 基因家族基本信息

2.2 沙地云杉LBD蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

對30個PmLBD蛋白進行了多序列比對,所有PmLBD家族成員在N端都有1個高度保守的LOB區(qū)域,由約100個氨基酸組成(圖1)。多序列比較表明,30個PmLBD均具有1個保守的c基序(CX2CX6CX3C)、GAS-block和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(LX6LX3LX6L)。說明PmLBD家族序列保守性較高,在沙地云杉內(nèi)可能行使相似的生物學功能。為了進一步研究30個PmLBD結(jié)構(gòu)的多樣性,筆者利用MEME在線工具預測PmLBD蛋白的保守基序組成(圖2)。結(jié)果表明,PmLBDs的序列特征識別出了10個基序,所有LBDs都包含motif1、motif2和motif3,構(gòu)成了LOB結(jié)構(gòu)域中高度保守的部分。除了PmLBD3/7/18外,其余27個PmLBD都具有motif4?；蛟诖蠖鄶?shù)序列中的相對位置相似,但不同PmLBD也有一定差異性。其中,motif5分布于PmLBD16/17/26/29中;motif6分布于PmLBD1/25中;motif7分布于PmLBD15/27中;motif8分布于PmLBD10/15/28中;motif9分布于PmLBD4/21中;motif10分布于PmLBD1/2/5中。

圖1 PmLBD蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列比對

不同顏色的方塊代表不同的基序(1-10)。

10個motif的氨基酸序列如圖3,motif1為GAS保守結(jié)構(gòu)域,motif2 為CX2CX6CX3C基序,motif3為LX6LX3LX6L。以上結(jié)果說明PmLBD具有多種生物學功能。

2.3 沙地云杉LBDs蛋白系統(tǒng)進化分析

為了深入了解沙地云杉PmLBD家族蛋白之間的進化關(guān)系,通過MEGA11將沙地云杉(30個)、楊樹(57個)及擬南芥(43個)的130個氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。根據(jù)模式植物擬南芥和楊樹蛋白家族分類,將130個LBDs蛋白分為Class Ⅰ和Class Ⅱ,共7個保守的進化枝。其中,Ⅰ類有111個成員:楊樹(41%)、擬南芥(32%)和沙地云杉(27%),分別為46,36,30個。Ⅱ類有19個成員:楊樹(63%)和擬南芥(37%),分別為11,7個。進一步將Ⅰ類可以細分為5個子類:Class Ⅰa(14%),Class Ⅰb(27%),Class Ⅰc(23%),Class Ⅰd(24%),Class Ⅰe(12%);ClassⅡ可以細分為Ⅱa(58%)和Ⅱb(42%)。

紅色圓圈、綠色三角形和紅色五角星分別代表沙地云杉、楊樹及擬南芥。

其中,LBDs數(shù)量最多的是Class Ⅰb,分別包含12個PtLBDs,7個AtLBDs和11個PmLBDs;Class Ⅱb所含LBDs最少,僅有 3 個 AtLBDs 和5個PtLBDs;沙地云杉LBDs在Class Ⅰb中最多,有7個蛋白,但Class Ⅱ中無沙地云杉LBDs 蛋白,這可能與PmLBDs在3個物種中數(shù)量最少有關(guān)。

系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系結(jié)果表明,沙地云杉的LBD蛋白與楊樹的同源性高于擬南芥。

2.4 沙地云杉PmLBDs的組織特異性表達分析

為了進一步了解LBD基因在沙地云杉生長發(fā)育中的潛在功能,對LBDs在沙地云杉不同組織(莖尖、主根、側(cè)根、莖和葉)中的表達水平進行分析。如熱圖(圖5)所示,30個PmLBDs均被檢測到,大部分LBDs在根和葉中具有較高的轉(zhuǎn)錄水平,而在莖尖中表達水平較低,表明它們在根和葉的發(fā)育中具有重要功能。此外,4個基因(PmLBD2/5/18/19)在莖中高表達,Class I b中的PmLBD9/20/23基因在側(cè)根中強烈表達。以上結(jié)果表明,不同PmLBD在楊樹各組織器官中功能具有差異。

2.5 沙地云杉PmLBDs在鹽脅迫下的表達模式分析

為探究沙地云杉在鹽脅迫條件下潛在的生物學功能,利用RT-PCR技術(shù)對沙地云杉30個LBD基因在鹽脅迫處理下的表達情況進行了分析。結(jié)果(圖6)表明在鹽脅迫處理后,除了PmLBD3及PmLBD27基因外,28個沙地云杉LBD基因表達量均發(fā)生顯著的變化,且同源性越近的PmLBD表達情況越相似。

* P <0.05, ** P <0.01。

其中,17個PmLBD基因在鹽處理后上調(diào)表達,不同的PmLBD基因在不同鹽處理時間達到峰值,包括PmLBD8/18/19/29/30在6 h達到峰值及PmLBD2/16/22在12 h達到峰值,其余PmLBD基因在24 h達到峰值,特別是PmLBD10、PmLBD23及PmLBD28在鹽處理24 h時上調(diào)10倍以上;而6個PmLBD基因在鹽處理后下調(diào)表達,尤其是PmLBD9在12 h時下調(diào)表達10倍多。以上結(jié)果說明沙地云杉PmLBD基因家族成員在耐鹽進程中可能發(fā)揮不同作用。

3 討 論

LBD基因是1個植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族,已被證明在植物葉、根和花發(fā)育、組織再生及脅迫響應過程起重要調(diào)控作用;然而,目前尚未對沙地云杉進行LBD基因的系統(tǒng)研究。2013年,“云杉基因組項目”聯(lián)合課題組在Nature上發(fā)表挪威云杉基因組草圖,基因組大小為20 Gb,共注釋約28 354個基因[25]。本研究通過參考挪威云杉基因組及前期沙地云杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選并鑒定了30條沙地云杉LBD基因序列(表2)。沙地云杉的基因組龐大,是擬南芥的100多倍,但在家族成員數(shù)量上,PmLBDs小于AtLBDs,這表明沙地云杉在進化過程中丟失了一小部分的LBD基因。多序列比較表明,30個PmLBD均具有1個保守的c基序(CX2CX6CX3C)、GAS-block和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(LX6LX3LX6L)(圖1)。基因結(jié)構(gòu)分析表明,不同LBD成員既有相似性也存在一定結(jié)構(gòu)差異(圖2)。這種差異可能是因為不同亞類的成員在進化過程中經(jīng)歷了基因片段的剪接或插入[26-27]。LBD亞類中相似的保守序列和基因結(jié)構(gòu)通常意味著這些基因具有相似的生物學功能,這表明LBD家族的基序在整個進化過程中都很保守。

本研究構(gòu)建了擬南芥、楊樹和沙地云杉的LBD蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹,130個LBDs蛋白共分為Class Ⅰ和Class Ⅱ(圖4)。以往的研究表明,擬南芥中86%的AtLBD基因、大豆中82%的GmLBD基因和玉米中84%的ZmLBD基因?qū)儆冖耦怺5,12,16]。同樣,在本研究中,沙地云杉30個LBD均屬于Ⅰ類。此外,Ⅰ類基因進一步被分為5個亞類。從分布看,Class Ⅰ a、Class Ⅰ b、Class Ⅰ c、Class Ⅰ d和 Class Ⅰ e中每個植物都存在LBD基因,且Class I b中的所有LBD基因共享1支較長的分支,說明這些LBD基因已發(fā)生了較大的變異,可能已經(jīng)分化出新的功能。此外,同源PmLBD基因?qū)υ谙嗤M織或相同脅迫下的表達豐度相似(圖5和圖6),表明沙地云杉中的PmLBD基因的重復可能導致了功能的冗余。

多項研究表明LBD蛋白參與調(diào)節(jié)植物分枝發(fā)育和花、莖、葉和根的形成[28-33]?；虻慕M織特異性表達可以為深入了解其在生長發(fā)育中的功能提供見解[34]。在本研究中,分析了PmLBDs在沙地云杉不同組織(莖尖、主根、側(cè)根、莖和葉)中的表達水平模式,許多PmLBDs在特定組織中表現(xiàn)出較高的表達水平(圖5)。例如,屬于Class I b分支的PmLBD9、PmLBD20和PmLBD23在側(cè)根中高表達,其在擬南芥中同源基因是AT2G30340(AtLBD13),研究表明AtLBD13、AtLBD16、AtLBD18和AtLBD29在調(diào)節(jié)擬南芥?zhèn)雀l(fā)育中發(fā)揮重要作用[35-37],故推測其功能可能與AtLBD13相似,可作為調(diào)控沙地云杉側(cè)根發(fā)育的候選基因。另外,筆者發(fā)現(xiàn)有4個基因(PmLBD2、PmLBD5、PmLBD18和PmLBD19)在沙地云杉莖組織中強烈表達,表明其在沙地云杉莖發(fā)育中起著重要作用?；谶@些結(jié)果,推測沙地云杉PmLBD基因在其生長發(fā)育進程中起著關(guān)鍵作用,但具體的生物學功能其調(diào)控分子機制需要進一步驗證。

據(jù)報道,MYB、WRKY、NAC等轉(zhuǎn)錄因子參與了抵抗非生物脅迫,幫助植物抵抗或適應環(huán)境的變化[38-40]。到目前為止,已有多項研究表明LBD基因在非生物脅迫反應中也發(fā)揮著重要作用[41-43]。在本研究中,qRT-PCR結(jié)果表明大部分沙地云杉LBD基因響應鹽脅迫,其中57%的基因隨處理時間表達上調(diào),20%的基因表達下調(diào)(圖6)。這些結(jié)果表明,PmLBD基因廣泛參與沙地云杉的各種非生物脅迫反應。此外,眾所周知,根系是響應干旱和鹽脅迫的主要器官[44]。在本研究中,PmLBD10、PmLBD23及PmLBD28在根中強烈表達且在鹽處理24 h時上調(diào)10倍以上,表明這些基因是調(diào)控沙地云杉鹽脅迫的候選基因。以往的研究也表明,LBD基因在不同的非生物脅迫下顯著上調(diào)表達。例如,馬鈴薯StLBD2-6和StLBD3-5是在干旱脅迫下顯著上調(diào)[9];小麥Ta-6B-LBD81、Ta-4B-LBD51和Ta-U-LBD90在鹽脅迫下表達上調(diào),Ta-4A-LBD40和Ta-4D-LBD62在冷脅迫下表達上調(diào),而Ta-2A-LBD13、Ta-2B-LBD15和Ta-2D-LBD18在干旱脅迫下表達上調(diào)[43]。值得注意的是在沙地云杉側(cè)根中高表達的PmLBD9在12 h時下調(diào)表達10倍多,推測其可能是沙地云杉鹽脅迫的負調(diào)控基因。在大豆中的研究也發(fā)現(xiàn)36個PvLBDs在鹽及重金屬脅迫處理中下調(diào)表達[45]。綜上所述,PmLBD基因?qū)}脅迫表現(xiàn)出不同程度的反應,雖然其參與非生物脅迫反應的分子機制尚不清楚,但為開展沙地云杉進一步的抗性研究提供了候選基因。

4 結(jié) 論

沙地云杉 PmLBD蛋白家族包含30個成員,理化性質(zhì)分析顯示:蛋白序列長度在119～309 aa之間,分子量為10.5～33.4 kD,等電點為5.15～9.26,Cell-PLoc亞細胞定位顯示均位于細胞核中。按照蛋白結(jié)構(gòu)和聚類分析可以分為5個亞家族,Class I b與Class I e亞家族包含大部分成員。RT-PCR結(jié)果表明,沙地云杉PmLBD9、PmLBD20和PmLBD23也可能在側(cè)根發(fā)生過程中發(fā)揮作用。另外發(fā)現(xiàn)大部分沙地云杉PmLBD基因響應鹽脅迫,特別是PmLBD10、PmLBD23及PmLBD28在鹽處理24 h時上調(diào)10倍以上,可作為調(diào)控沙地云杉鹽脅迫的候選基因,但PmLBD9在鹽脅迫中起相反作用。本研究初步揭示了大部分PmLBDs在植物生長發(fā)育及鹽脅迫中發(fā)揮的作用,為沙地云杉PmLBDs基因功能進一步研究奠定了基礎(chǔ)。