新麥草IPT基因亞細(xì)胞定位、過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

任曉敏,云 嵐,2*,艾 芊,李 珍,趙 喬,石鳳翎

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 草原與資源環(huán)境學(xué)院,呼和浩特 010018;2 草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特 010011;3 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院,深圳 518055)

IPT基因編碼的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(isopentenyl-transferases),是細(xì)胞分裂素(cytokinin,CK)合成過(guò)程中的第一限速酶[1],即使IPT基因表達(dá)很低也可以促進(jìn)細(xì)胞分裂素的增加,而CK具有促進(jìn)細(xì)胞分裂以及根部分化等作用[2],和植物產(chǎn)量密切相關(guān)。在油菜中,過(guò)表達(dá)SAG12-ipt基因的植株相比正常植株的分枝數(shù)明顯增加,在一定程度上為提高油菜單產(chǎn)提供了新的優(yōu)質(zhì)材料[3]。ipt基因與果蠅熱激蛋白hsp70啟動(dòng)子相結(jié)合轉(zhuǎn)化藍(lán)雪葉煙草,陽(yáng)性植株側(cè)芽明顯增多,植株相對(duì)矮小,其體內(nèi)的細(xì)胞分裂素含量增加了幾十倍到上百倍[4]。中間偃麥草是優(yōu)質(zhì)的禾本科牧草,有研究構(gòu)建ipt基因的雙元表達(dá)載體通過(guò)基因槍轟擊法獲得中間偃麥草的陽(yáng)性過(guò)表達(dá)植株,陽(yáng)性植株相比未轉(zhuǎn)化植株有明顯的叢生矮化現(xiàn)象,同時(shí)植株內(nèi)的細(xì)胞分裂素含量也相對(duì)增加[5]。中國(guó)牧草產(chǎn)業(yè)起步較晚,育種技術(shù)相對(duì)落后,導(dǎo)致突破性品種少,優(yōu)質(zhì)本土牧草的推廣范圍小,牧草種子很大程度上仍需靠進(jìn)口補(bǔ)給[6]。

新麥草[Psathyrostachysjuncea(Fisch.) Nevski]又名俄羅斯野黑麥(Russian wildrye),是一種適應(yīng)半干旱氣候的冷季型牧草,是新麥草屬中唯一的刈割放牧兼用型草種[7],也是禾谷類作物改良的潛在種質(zhì)資源[8],在中國(guó)主要分布在內(nèi)蒙古和新疆等地,具有抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐牧、返青早等優(yōu)良特性,在北方寒旱區(qū)生態(tài)治理方面具有重要價(jià)值[9]。隨著中國(guó)畜牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展和生態(tài)治理的逐步推進(jìn),對(duì)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)草種的需求不斷增加,提高草產(chǎn)量成為當(dāng)下草育種需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

前期研究發(fā)現(xiàn)并篩選了和新麥草分蘗相關(guān)的基因,其中IPT在新麥草中與調(diào)控分蘗形成有關(guān)[10],而分蘗數(shù)是影響新麥草飼草和種子產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一。目前新麥草中的IPT基因功能尚未被驗(yàn)證,相關(guān)試驗(yàn)分析也鮮見(jiàn)報(bào)道。因此,本試驗(yàn)通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)對(duì)IPT基因在新麥草少分蘗(ST)和多分蘗(DT)材料中的表達(dá)量進(jìn)行了分析,并從新麥草中克隆出該基因,利用同源性比較及生物信息學(xué)分析其蛋白結(jié)構(gòu)和特性;構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體并通過(guò)煙草的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染鑒定該基因的表達(dá)性并分析其在煙草中的亞細(xì)胞定位情況;通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)該基因在蛋白水平的表達(dá),為深入了解IPT基因在多年生禾本科牧草生長(zhǎng)發(fā)育中的作用機(jī)制及新麥草IPT基因功能驗(yàn)證提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

研究以種植于內(nèi)蒙古呼和浩特市牧草資源圃的30株ST型和30株DT型的新麥草為材料,取分蘗節(jié)提取總RNA,進(jìn)行RNA-seq測(cè)序。另取相同生育期的DT型新麥草材料的分蘗節(jié)提取總RNA,進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,以種植1個(gè)月左右的煙草為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染材料。植物過(guò)表達(dá)載體為1300-cYFP,轉(zhuǎn)化用的菌株為DH5α感受態(tài),侵染煙草用的農(nóng)桿菌菌株為GV3101感受態(tài),卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)均由中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成所實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方 法

1.2.1IPT基因的表達(dá)量分析

通過(guò)3種內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)估軟件Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,篩選出表達(dá)穩(wěn)定的IPT基因,通過(guò)軟件IBM SPSS Statistics 23和在線網(wǎng)站(http://www.geneontology.org/)分別進(jìn)行IPT基因在DT及ST中的表達(dá)量和基因本體(GO)分析。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1),以新麥草分蘗節(jié)為材料用天根試劑盒提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA,以4個(gè)質(zhì)量濃度梯度的1 μL cDNA為模板,上下游引物各0.6 μL,2×Talent qPCR Pre Mix 10 μL,RNase-free ddH2O 7.8 μL,總體系20 μL,進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,通過(guò)qRT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)估IPT的擴(kuò)增效率,用2-ΔΔCT法計(jì)算IPT分別在DT和ST種的表達(dá)量,并用微生信(http:// www.bioinformatics.com.cn)平臺(tái)進(jìn)行作圖分析。

表1 新麥草IPT基因引物

1.2.2IPT基因克隆及過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

提取DT型新麥草材料分蘗節(jié)的總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過(guò)SnapGene 6.0.2軟件設(shè)計(jì)PCR及1300連接引物(表1),以2 μL的cDNA為模板,2×Phanta Max Master Mix 25 μL,上下游引物各2 μL,ddH2O補(bǔ)足到50 μL進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 3 min 1個(gè)循環(huán),95 ℃ 15 s、56 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min 30 s共35個(gè)循環(huán),72 ℃ 5 min 1個(gè)循環(huán),4 ℃∞,反應(yīng)結(jié)束后加10 μL 6×Loading buffer進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,按照天根膠回收試劑盒的方法對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收,并用全式金的Blunt基因克隆試劑盒將膠回收產(chǎn)物與Blunt進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化,挑取單菌落于10 μL ddH2O中,以M13F和M13R為引物進(jìn)行菌液PCR,反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 5 min 1個(gè)循環(huán),94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 30 s共30個(gè)循環(huán),72 ℃ 5 min 1個(gè)循環(huán),4 ℃ ∞,選取陽(yáng)性菌液加到1×LB 5 mL+50 mg/mL卡那霉素5 μL的搖菌管中過(guò)夜搖菌,按照天根試劑盒質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,并測(cè)序。取測(cè)序正確的克隆質(zhì)粒為模板加0.5 μL,上下游引物為1300連接引物各2 μL,其余同PCR反應(yīng),總體系50 μL,電泳后膠回收,用SpeI酶1.5 μL和Cut Smart 5 μL,37 ℃水浴鍋中單酶切20 μL 1300-cYFP載體質(zhì)粒2 h,總體系50 μL,加10 μL 6×Loading buffer進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)束后膠回收,將上述2個(gè)膠回收產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化,2 μL 5×CEⅡ buffer,1 μL E×naseⅡ,膠回收產(chǎn)物共7 μL,總體系10 μL,37 ℃反應(yīng)30 min,菌液PCR引物為實(shí)驗(yàn)室保存的1300上下游引物,轉(zhuǎn)化及提質(zhì)粒測(cè)序同克隆過(guò)程。

1.2.3 1300-cYFP-IPT過(guò)表達(dá)載體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

取出保存在-80 ℃冰箱中的GV3101感受態(tài)菌株于冰上融化,分裝后將連接產(chǎn)物加入混勻,冰上靜置20 min,液氮冰浴1 min,37 ℃熱擊5 min,冰浴2 min,在超凈臺(tái)中加入1 mL 1×LB,30 ℃復(fù)蘇2 h,4 000 r/min離心3 min,留少許上清重懸菌體,涂在含Kan和Rif的抗性版上,30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d,將菌落挑到含Kan和Rif抗生素的5 mL 1×LB中,30 ℃過(guò)夜小搖,吸取1 mL小搖后的菌液于20 mL 1×LB(含Kan和Rif)中,30 ℃ 200 r/min大搖12 h,落地離心機(jī)4 000 r/min離心30 min,倒干凈上清后加入2 mL侵染液重懸,4 000 r/min離心10 min,侵染液為1 mol/L MgCl2500 μL,1 mol/L MES 500 μL,200 mmol/LAS 50 μL,超純水定容到50 mL,倒掉離心后的上清,加2 mL侵染液重懸后作為母液,另取新的50 mL離心管倒入15 mL侵染液,加入適當(dāng)母液,以侵染液為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)菌液的OD600,OD600值在0.5～0.6為宜。

1.2.4 煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及亞細(xì)胞定位

取上述配好的菌液,用1 mL的注射器吸取菌液注射煙草葉片背面,注射2株煙草,共6片葉子,短日照培養(yǎng)2 d,取葉片組織于尼康共聚焦AX顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳及Western blot

將上述注射過(guò)菌液的煙草葉片于液氮中研磨,研磨后置于1.5 mL離心管中,加入等量的2×SDS loading buffer,渦旋混勻,沸水浴加熱10 min,12 000 r/min離心2～5 min,取上清即為蛋白上樣液。取12孔的預(yù)制膠,安裝在電泳槽中,倒入1×SDS-PAGE電泳緩沖液,向膠孔中點(diǎn)入蛋白上樣液和混入二倍體積2×SDS loading buffer的全新預(yù)染彩色蛋白Marker,電壓120 V電泳1～1.5 h。待電泳快結(jié)束前,用甲醇浸泡PVDF膜,然后放入電轉(zhuǎn)液中,同時(shí)將濾紙也放入電轉(zhuǎn)液中,電轉(zhuǎn)液由5.8 g Tris、2.9 g甘氨酸、0.37 g SDS和200 mL甲醇配制而成,并由ddH2O定容至1 L,電泳結(jié)束后,將凝膠置于1層海綿和3層濾紙之上,覆蓋1層PVDF膜、3層濾紙和1層海綿于電泳槽中4℃恒壓100 V轉(zhuǎn)膜60～90 min。轉(zhuǎn)膜完成后,取出PVDF膜于孵育盒中,加入封閉液,室溫40 r/min搖1 h,封閉液是含5%脫脂奶粉的1×TBST(20×TBST、Tween-20和ddH2O組成),結(jié)束后倒掉封閉液,加入含GFP抗性的封閉液室溫低速搖1 h,倒掉上述封閉液,加入1×TBST低速搖床洗滌10 min,共3次,倒掉1×TBST,加入含標(biāo)記山羊抗小鼠的封閉液,室溫40 r/min搖1 h,倒掉封閉液,1×TBST低速搖床洗滌5 min,共2次,向PVDF膜滴加ECL工作液(等量的BeyoECL Moon A液和B液混合),于WB曝光儀成像拍照。

1.2.6IPT基因生物信息學(xué)分析

以克隆出的新麥草IPT基因氨基酸序列為模板,通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源序列比對(duì),獲得小麥(Triticumaestivum)等9個(gè)物種的氨基酸序列信息(表2),利用DNAMAN軟件對(duì)以上10個(gè)物種進(jìn)行序列比對(duì),通過(guò)NCBI中的Structure(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)新麥草IPT編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,利用PRABI中的SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進(jìn)行新麥草IPT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),并通過(guò)在線軟件NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對(duì)新麥草IPT蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表2 近緣物種IPT氨基酸序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 新麥草IPT基因GO分析

通過(guò)對(duì)新麥草IPT基因進(jìn)行GO富集分析(表3)顯示,IPT在細(xì)胞組分中主要與線粒體和質(zhì)體相關(guān),并參與tRNA修飾的生物學(xué)過(guò)程,同時(shí)與tRNA二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān),在新麥草多分蘗型材料中起到上調(diào)的作用。

表3 IPT基因GO分析

2.2 新麥草IPT基因表達(dá)量分析

通過(guò)對(duì)RNA-seq的數(shù)據(jù)分析(圖1)顯示,IPT在多分蘗的新麥草中表達(dá)量遠(yuǎn)高于少分蘗中的表達(dá)量,qRT-PCR試驗(yàn)結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致,在ST和DT中IPT基因表達(dá)差異顯著,說(shuō)明IPT在新麥草分蘗過(guò)程中起到一定的調(diào)控作用,且在該過(guò)程中上調(diào)新麥草分蘗數(shù)。

圖1 新麥草IPT基因表達(dá)量分析

2.3 新麥草IPT基因克隆及過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

以DT型新麥草為材料,提取分蘗節(jié)總RNA,以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,進(jìn)行PCR反應(yīng)并克隆IPT基因,結(jié)果顯示在目的片段位置成功克隆出了新麥草IPT基因,該基因片段大小為1 362 bp(圖2,A),以克隆質(zhì)粒為模板,成功構(gòu)建了1300-cYFP-IPT過(guò)表達(dá)載體,其菌液PCR顯示均為目的片段大小(圖2,B)。

圖2 新麥草IPT基因克隆及1300-cYFP-IPT載體菌液PCR

2.4 1300-cYFP-IPT過(guò)表達(dá)載體亞細(xì)胞定位

為了研究新麥草IPT蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)狀態(tài)及定位情況,將構(gòu)建成功的1300-cYFP-IPT過(guò)表達(dá)載體和1300-cYFP載體轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌,注射到煙草的葉片中,在共聚焦顯微鏡下觀察,結(jié)果(圖3)顯示,空載1300-cYFP可以正常表達(dá),新麥草IPT蛋白定位于葉綠體中,且能夠在植株中正常表達(dá)。

2.5 Western blot分析

通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法分析目的蛋白IPT的表達(dá)情況,結(jié)果(圖4)顯示,連接1300-cYFP載體的IPT能夠正常表達(dá),位置大小在76.8 kD,說(shuō)明1300-cYFP-IPT過(guò)表達(dá)載體可以轉(zhuǎn)入到目的植物中表達(dá)。

圖4 新麥草IPT蛋白印跡

2.6 近緣物種多序列比對(duì)及分析

新麥草與其近緣物種的IPT氨基酸序列比對(duì)圖中不同顏色代表氨基酸序列的保守程度(圖5),其中黑色代表序列的高度保守性,結(jié)果顯示,新麥草與9個(gè)近緣物種的氨基酸序列相似度較高,尤其同二粒小麥(Triticumdicoccoides)、小麥(Triticumaestivum)及硬粒小麥(Triticumturgidumsubsp.durum)的氨基酸序列相似度最高,說(shuō)明IPT基因在新麥草及麥類作物中可能具有相似的功能。

2.7 新麥草IPT保守結(jié)構(gòu)域及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

新麥草IPT保守結(jié)構(gòu)域分析(圖6)顯示,該蛋白存在PLN02840結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域是tRNA二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶家族保守結(jié)構(gòu)域,其范圍是從第58位氨基酸開(kāi)始,到第453位氨基酸結(jié)束。通過(guò)SOPMA對(duì)IPT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析(圖7)發(fā)現(xiàn),該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲組成,其中α-螺旋有211個(gè)氨基酸,占46.58%;延伸鏈有49個(gè)氨基酸,占10.28%;β-轉(zhuǎn)角有24個(gè)氨基酸,占5.3%;不規(guī)則卷曲有169個(gè)氨基酸,占37.31%。

圖6 新麥草IPT保守結(jié)構(gòu)域

圖7 新麥草IPT蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.8 新麥草IPT編碼蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果(圖8)顯示,IPT蛋白共有55個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中絲氨酸有38個(gè),蘇氨酸有11個(gè),酪氨酸有6個(gè)。絲氨酸的磷酸化位點(diǎn)最有可能是潛在的磷酸化位點(diǎn),它們的值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于臨界值0.5,表明該蛋白可能通過(guò)調(diào)控相應(yīng)的磷酸化位點(diǎn)發(fā)揮功能。

圖8 新麥草IPT蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

3 討 論

異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(isopentenyl-transferases,IPT)是細(xì)胞分裂素(CK)合成過(guò)程中的重要限速酶[1],主要由植物和細(xì)菌產(chǎn)生,包括植物促生細(xì)菌(PGPB)和植物病原細(xì)菌,其中與PGPB相關(guān)的IPT主要傾向于和其他參與細(xì)胞分裂素代謝及降解的基因共發(fā)生[11],而CK是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要激素,在植物細(xì)胞分裂、分枝數(shù)目及形成愈傷組織等方面起調(diào)控作用,具有提高植物產(chǎn)量的巨大潛力[12],推測(cè)新麥草IPT主要是與植物促生細(xì)菌相關(guān)的酶,進(jìn)而調(diào)控植株分蘗數(shù),影響新麥草產(chǎn)量。

IPT基因表達(dá)量分析顯示,在新麥草分蘗數(shù)較多的材料類型中,IPT基因顯著上調(diào),這與中間偃麥草的IPT基因研究結(jié)果相同,其陽(yáng)性過(guò)表達(dá)植株中的細(xì)胞分裂素含量明顯增加,植株也出現(xiàn)了明顯的叢生矮化現(xiàn)象[5],北沙參異戊烯基轉(zhuǎn)移酶GlIPT1基因在北沙參香豆素合成途徑中表達(dá)量上調(diào),為后續(xù)北沙參高產(chǎn)植株的研究奠定了基礎(chǔ)[13],與SSU(磷酸核酮糖羧化酶小亞基啟動(dòng)子)融合的IPT基因在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)后,煙草的細(xì)胞分裂素水平明顯提高,相比正常煙草約增加了10倍,其形態(tài)上也表現(xiàn)出枝葉生長(zhǎng)茂盛等典型的細(xì)胞分裂素作用反應(yīng)[14],油菜中過(guò)表達(dá)SAG12-ipt基因的植株分枝數(shù)明顯增加,一定程度上可以提高油菜的產(chǎn)量[3],結(jié)合前期研究,推測(cè)新麥草IPT基因也是通過(guò)提高內(nèi)源細(xì)胞分裂素含量來(lái)調(diào)控植株分蘗數(shù)量的。

通過(guò)PCR法從新麥草中成功克隆了IPT基因的全長(zhǎng)并構(gòu)建了1300-cYFP-IPT過(guò)表達(dá)載體,對(duì)其全長(zhǎng)的氨基酸序列進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析,多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)小麥類禾本科植物的IPT基因與新麥草的相似度最高,親緣關(guān)系最近,說(shuō)明新麥草IPT蛋白和小麥類的IPT蛋白有功能相似的部分,新麥草IPT存在tRNA二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶家族保守結(jié)構(gòu)域,說(shuō)明該蛋白為tRNA型IPT[12],該類型的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶可以催化生成順式玉米素(cis-zeatincZ),從而影響細(xì)胞分裂素的合成[15],過(guò)表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞分裂素水平明顯提高,導(dǎo)致植株頂端優(yōu)勢(shì)消失,促進(jìn)側(cè)芽生長(zhǎng)[16]。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)骨架中的原子之間通過(guò)相互作用進(jìn)而形成多肽并決定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),從而影響蛋白的生化功能[17],新麥草IPT蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲組成,探究其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)有助于揭示該蛋白的功能。磷酸化是生物體內(nèi)的一種翻譯后修飾,可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活力及功能,絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸是常見(jiàn)的可磷酸化修飾的氨基酸,新麥草中IPT的磷酸化修飾位點(diǎn)主要是絲氨酸磷酸化位點(diǎn),而磷酸化可以激活或失活蛋白質(zhì),從而調(diào)控細(xì)胞分裂素的合成,調(diào)控新麥草的分蘗數(shù)[18],以進(jìn)一步改善新麥草的產(chǎn)量。

蛋白的亞細(xì)胞定位與其生物學(xué)功能有很強(qiáng)的相關(guān)性,擬南芥中個(gè)分支的AGO分別定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及核質(zhì)-細(xì)胞質(zhì)雙重亞細(xì)胞定位,定位于核質(zhì)-細(xì)胞質(zhì)中的蛋白功能更加豐富[19],因此研究新麥草IPT蛋白的亞細(xì)胞定位有助于其功能的進(jìn)一步解析,新麥草IPT蛋白定位于葉綠體中,與藜麥的CqIPT蛋白研究結(jié)果相符,CqIPT蛋白均能定位到葉綠體中[1],苦參8-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因的蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示也定位于葉綠體中[20],以上結(jié)果均與新麥草的IPT蛋白定位相同,說(shuō)明葉綠體是新麥草IPT蛋白發(fā)揮功能的主要場(chǎng)所,且蛋白均能正常表達(dá),Western blot的結(jié)果也同樣證實(shí)了新麥草IPT蛋白可在目標(biāo)植物中正常表達(dá)。煙草的瞬時(shí)表達(dá)可以為后續(xù)IPT在目標(biāo)植物中表達(dá)提供可行性依據(jù),瞬時(shí)表達(dá)是以非整合的方式將外源基因?qū)氲侥繕?biāo)物種的細(xì)胞中,在短時(shí)間內(nèi)驗(yàn)證目的基因表達(dá)情況的技術(shù)[21-22],水母雪蓮[23]和二穗短柄草[24]的相關(guān)基因研究均以該方式對(duì)蛋白定位及表達(dá)進(jìn)行了探討。利用煙草的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及Western blot鑒定新麥草IPT基因在植物中的表達(dá)情況,可為后續(xù)新麥草的功能驗(yàn)證提供理論與技術(shù)基礎(chǔ)。

本研究克隆得到了新麥草IPT基因,并構(gòu)建了1300-cYFP-IPT過(guò)表達(dá)載體,IPT基因的cDNA全長(zhǎng)序列為1 362 bp;通過(guò)生物信息學(xué)分析及試驗(yàn)驗(yàn)證等方式分析了新麥草IPT基因的表達(dá)情況及其蛋白的功能,顯示IPT基因在密集分蘗型新麥草中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于稀疏分蘗型當(dāng)中的表達(dá)量,說(shuō)明IPT是調(diào)控新麥草分蘗的上調(diào)基因,蛋白質(zhì)印跡法和煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化顯示IPT蛋白均可以正常表達(dá),其亞細(xì)胞定位于葉綠體中,推測(cè)在新麥草中該基因會(huì)正常表達(dá);新麥草IPT主要與二粒小麥、小麥及硬粒小麥親緣關(guān)系較近,推測(cè)新麥草IPT與小麥類的IPT具有相似的功能,但I(xiàn)PT相關(guān)功能還需要進(jìn)一步驗(yàn)證,本研究將為后續(xù)IPT基因在新麥草分蘗過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。