基于體外消化篩選黃芩抗氧化成分的提取工藝研究

葉敬榕， 林 彥， 段涵怡， 楊 雪， 任曉嵐， 張鳳英

（1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

黃芩，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，氣微、味苦，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效（中國藥典，2020）。 現(xiàn)代藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，黃芩的藥理活性是多方面的，其在抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等諸多方面均有作用（羅勇，2022；李化，2020；Singh，2020；Li，2020）。 研究表明，黃芩提取液中含有大量的黃酮類、多糖類及多酚類化合物， 這些化合物均可清除體內(nèi)多余自由基，從而達(dá)到強(qiáng)抗氧化效果（Hui，2022；Woniak，2015；趙二勞，2012）。

自由基是具有未成對電子的原子、 原子團(tuán)或分子，人體主要含有氧自由基（活性氧）和氮自由基（活性氮）兩大類。當(dāng)活性氧、活性氮與機(jī)體的抗氧化防御機(jī)制平衡被打破時(shí)， 就會引發(fā)線粒體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)（Pandya，2021），導(dǎo)致肝炎、癌癥、糖尿病、心臟病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎以及神經(jīng)退化性疾病，如帕金森病、阿爾茲海默癥等（朱燁，2022；Jabeen，2021；Legiawati，2021；Zhu，2021）。有研究表明， 黃芩提取液可作為天然的抗氧化劑使用，能夠有效抑制自由基的產(chǎn)生，減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)對機(jī)體的損傷， 降低重大疾病發(fā)病率（高可新，2021；Wang，2021）。 因此，研究黃芩抗氧化活性物質(zhì)的提取具有重要意義。

目前， 對于黃芩活性物質(zhì)的提取主要有水提法、有機(jī)溶劑提取法、酶解法、超聲等物理手段輔助提取法（金堯，2021；辛瑩娟，2021；葉潤，2019）。不同的提取方式會使得黃芩提取液中活性成分不同，進(jìn)而造成黃芩提取物的抗氧化活性存在差異，但黃芩提取物經(jīng)過胃腸消化后產(chǎn)物的抗氧化活性是否會發(fā)生變化（升高/降低）鮮見報(bào)道。 本試驗(yàn)對比兩種常見的提取方式：水提和醇提。 并以最佳溶劑為基礎(chǔ)，采用單因素試驗(yàn)和析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以胃腸模擬消化產(chǎn)物抗氧化活性指標(biāo)的秩和比為依據(jù)，優(yōu)化相應(yīng)的提取工藝參數(shù)，旨為篩選出最佳的提取工藝，并獲得具有高抗氧化活性的黃芩提取物。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 2500 大型粉碎機(jī)， 購于運(yùn)邦公司；C 21-SDHCB 39 電磁爐， 購于浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司；N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購于上海愛朗儀器有限公司；30ND 中式真空冷凍干燥機(jī)，購于寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-501 超級恒溫水浴箱， 購于常州澳華儀器有限公司；ZD-85A 氣浴恒溫振蕩器， 購于常州榮華儀器制造有限公司；1510 酶標(biāo)儀， 購于賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific） 公司；OHAUS AR 224CN 分析天平， 購于奧豪斯儀器上海有限公司；Velocity 18R臺式冷凍高速離心機(jī)，購于Dynamica 公司。

1.2 試劑 黃芩，產(chǎn)地西安；胃蛋白酶、胰酶、豬膽粉均購自上海源葉生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH，AR）購自上海吉至生化有限公司；無水乙醇、硫酸亞鐵七水合物、水楊酸、雙氧水、pH 7.60 磷酸鹽緩沖液、鐵氰化鉀、三氯乙酸、 無水三氯化鐵、 焦性沒食子酸、 過硫酸鉀、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）等試劑均購自阿拉丁試劑有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 黃芩抗氧化成分的提取溶劑篩選

2.1.1 水提黃芩抗氧化成分 參照翟陽等（2020）的方法略有修改，取干燥黃芩藥材，粉碎過20 目篩，得到黃芩根粉，取黃芩根粉50 g 包煎，第1 次加1583 mL 純水，用電磁爐先大火煎煮，水開后轉(zhuǎn)小火繼續(xù)煮， 共煮75 min。 第2 次加1267 mL純水，水煎煮過程同上，共煮60 min。 合并2 次提取液，12000 r/min 離心10 min 后， 再用抽濾漏斗抽濾， 濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮至200 mL 左右，取出后凍干，收集凍干粉，備用。

2.1.2 醇提黃芩抗氧化成分 參照叢日琳等（2019）的方法略有修改，取黃芩根粉50 g，以70%乙醇為溶劑加熱回流提取，水浴鍋設(shè)置80 ℃，每次加入乙醇量為400 mL，共三次，每次提取2 h。合并3 次提取液，12000 r/min 離心10 min 后，再用抽濾漏斗抽濾， 濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮至200 mL左右，取出后凍干，收集凍干粉，備用。

2.1.3 復(fù)溶凍干粉 按上述的操作步驟制得兩種黃芩提取物凍干粉，各稱取1 g，再用20 mL 原溶劑復(fù)溶制樣，在攪拌混勻狀態(tài)下吸取1200 μL 于離心管中，分別命名為水提水溶和醇提醇溶。但考慮到人體實(shí)際情況， 多數(shù)是以水作為溶劑而無法產(chǎn)生大量乙醇，故追加一組醇提水溶。三組樣品制樣結(jié)束后12000 r/min 離心10 min， 分裝上清液，用于體外胃腸模擬消化。

2.2 體外胃腸模擬消化參照Ketnawa 等（2016）和陳希苗等（2019）的方法略有修改，胃消化組：調(diào)節(jié)黃芩提取液的pH 至2.0 左右，加入2%（E/S）的胃蛋白酶，于37 ℃氣浴搖床中反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后，取出于金屬浴95 ℃條件下滅酶10 min，冷卻后再調(diào)節(jié)pH 至8.0 左右， 于12000 r/min 離心10 min 取上清液，待測。胃腸消化組：以同樣的方法模擬胃消化， 結(jié)束后迅速調(diào)節(jié)其溶液pH 調(diào)節(jié)至8.0 左右，加入2%（E/S）的胰酶與12.5%的豬膽粉，于37 ℃氣浴搖床中反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后于金屬浴95 ℃滅酶10 min，于12000 r/min 離心10 min 取上清液，待測。

2.3 黃芩抗氧化成分的水提工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn) 根據(jù)前期的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)水提優(yōu)于醇提，故持續(xù)優(yōu)化黃芩的水提工藝，并按照表1 中設(shè)定的因素和水平進(jìn)行單因素試驗(yàn)。（其中篩選液料比單因素時(shí)，采用固定黃芩用量，改變純水用量，并將最后總體積調(diào)成一致）。

表1 單因素試驗(yàn)因素與水平

2.3.2 析因試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果， 固定溫度單因素（保持微沸），對時(shí)間單因素和液料比單因素進(jìn)行兩兩組合的析因試驗(yàn)，組合結(jié)果見表2。

表2 析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)組合詳情

2.4 體外抗氧化指標(biāo)的測定

2.4.1 DPPH 自由基清除率的測定 參照王美英等（2021）的方法略有修改，為了使DPPH 自由基清除率結(jié)果在線性范圍之內(nèi)，將水提水溶、醇提醇溶、醇提水溶樣品稀釋至30 倍，單因素試驗(yàn)樣品稀釋至10 倍，析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)樣品稀釋至10 倍。

取100 μL 樣品溶液加入100 μL DPPH（0.1 mol/L，溶于乙醇）。 然后將混合物37 ℃下保持在避光條件下反應(yīng)30 min， 并在517 nm 處測定吸光度。樣品對DPPH 自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：A0為乙醇代替樣品的吸光度，A1為樣品的吸光度，A2為乙醇代替DPPH 的吸光度。

2.4.2 總抗氧化能力的測定 參照王美英等（2021） 的方法略有修改， 將7 mmol/L ABTS 與2.45 mmol/L 過硫酸鉀等體積混合靜置過夜12 h，制成ABTS 母液。用無水乙醇將母液稀釋，使其在波長734 nm 處吸光度為（0.20±0.02），制得ABTS工作液。

將水提水溶、醇提醇溶、醇提水溶樣品稀釋至1500 倍，單因素試驗(yàn)樣品稀釋至100 倍，析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)樣品稀釋至300 倍。

取100 μL 樣品溶液于96 孔板中，加入100 μL的ABTS 工作液，避光反應(yīng)6 min 后，于波長734 nm處測得吸光度。 樣品的總抗氧化能力計(jì)算公式如下：

式中：A3為以蒸餾水代替樣品吸光度，A4為樣品吸光度，A5為蒸餾水替代ABTS 工作液的吸光度。

2.4.3 ·OH 自由基清除率的測定 參照陳建雙等（2021）的方法略有修改，將水提水溶、醇提醇溶、醇提水溶樣品稀釋至10 倍，單因素試驗(yàn)樣品不進(jìn)行稀釋，析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)樣品稀釋至3 倍。

取200 μL 樣品溶液于離心管，對應(yīng)加入Fe-SO4溶液（9 mmol/L）、水楊酸溶液（9 mmol/L，溶于乙醇）和H2O2溶液（8.8 mmol/L）均200 μL 搖勻，于37 ℃氣浴20 min，冷卻后離心，取上清200 μL，放入96 孔板，于波長510 nm 處測定吸光度。 樣品對·OH 自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：A6為以蒸餾水代替樣品吸光度，A7為樣品吸光度，A8為蒸餾水替代H2O2溶液的吸光度。

2.4.4 總還原能力測定 參照范琳等（2021）的方法略有修改，將水提水溶、醇提醇溶、醇提水溶樣品稀釋至30 倍， 單因素試驗(yàn)樣品稀釋至2 倍，析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)樣品稀釋至30 倍。

取不同樣品溶液100 μL 于試管中， 分別加入100 μL 0.2 mol/L PBS 緩沖液和100 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% K3Fe（CN）6溶液，于50 ℃下水浴反應(yīng)20 min，冷卻后，加入100 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸，離心，取上清100 μL，放入96 孔板，加入100 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% FeCl3溶液，搖勻，靜置，在波長700 nm 處測定吸光度。 樣品的總還原能力計(jì)算公式如下：

總還原能力=A9-A10；

式中：A9為樣品吸光度，A10為蒸餾水代替K3Fe（CN）6溶液測定吸光度，以蒸餾水作為空白調(diào)零，結(jié)果數(shù)值越大說明其總還原能力越好。

2.4.5 超氧陰離子清除率測定 參照范琳等（2021）的方法略有修改，采用鄰苯三酚自氧化法測定對超氧陰離子的作用。 將水提水溶、 醇提醇溶、醇提水溶樣品稀釋至30 倍，單因素試驗(yàn)樣品不進(jìn)行稀釋，析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)樣品稀釋至10 倍。

取Tris-HCl 溶液125 μL 和樣品液75 μL 混勻，25 ℃條件下放置4 min，加入鄰苯三酚75 μL，5 min 后于波長325 nm 處測定。 樣品對超氧陰離子清除率計(jì)算公式如下：

式中：A11為以蒸餾水代替樣品吸光度，A12為樣品吸光度，A13為蒸餾水替代鄰苯三酚溶液的吸光度。

2.5 數(shù)據(jù)分析與制圖 數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 23.0軟件（IBM 公司，NY,USA）進(jìn)行單因素方差分析。圖表采用WPS office （北京金山辦公軟件股份有限公司）繪制，表中不同的字母表示不同處理方法在相同階段下的顯著性（P ＜0.05，n=3）。

3 結(jié)果

3.1 黃芩抗氧化成分提取溶劑的選擇 水提水溶、醇提醇溶、醇提水溶三組經(jīng)過復(fù)溶、離心后，其析出的沉淀量不同。對沉淀進(jìn)行烘干稱重，水提水溶組析出最少，為0.0030 g；醇提水溶組其次，為0.0056 g；醇提醇溶組最多，為0.0518 g。三組復(fù)溶溶液及其胃腸模擬消化產(chǎn)物的五種抗氧化活性指標(biāo)結(jié)果見表3。 由表3 可知，不同的復(fù)溶方式對黃芩提取物的抗氧化活性具有顯著影響（P ＜0.05）。且經(jīng)過胃腸模擬消化后， 五種指標(biāo)呈現(xiàn)出不同的趨勢。但總體而言，水提水溶組和醇提水溶組會優(yōu)于醇提醇溶組。 對比胃腸模擬消化后產(chǎn)物的抗氧化活性，可以發(fā)現(xiàn)DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率、·OH 自由基清除率是水提水溶組最高，分別為42.54%、55.41%、59.36%。 而總還原能力、超氧陰離子清除率卻是醇提水溶組較高，分別為1.52、67.95%。

表3 3 種復(fù)溶溶液及其胃腸模擬消化后產(chǎn)物的抗氧化活性及秩和處理結(jié)果

對這五種抗氧化指標(biāo)進(jìn)行秩和處理， 并對秩和比（RSR 值）進(jìn)行排序，RSR 值越大排序越高，相應(yīng)的綜合抗氧化活性也高。 通過表中數(shù)值可以發(fā)現(xiàn)， 醇提水溶組在經(jīng)過胃腸模擬消化后，其RSR 值排序情況是逐步不如水提水溶組，由提取物的排序1 降至胃消化的排序1.5，再到最終胃腸消化結(jié)束后的排序2。 其原因可能是醇提水溶溶液中的有效成分逐步被胃腸消化液中的酶所破壞而喪失其抗氧化活性。而水提水溶組，在經(jīng)過胃腸模擬消化后， 其抗氧化活性較原提取物顯著提高（P ＜0.05），這可能與黃芩中的主要成分黃芩苷易溶于熱水（孟倩，2007），再經(jīng)過消化后被水解成更多的黃芩苷元，而發(fā)揮抗氧化作用有關(guān)。

3.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化黃芩水提工藝結(jié)果

3.2.1 提取溫度對黃芩提取物抗氧化活性的影響根據(jù)上述的試驗(yàn)結(jié)果可知水提水溶組經(jīng)過胃腸模擬消化后的抗氧化活性最高， 故現(xiàn)采用單因素試驗(yàn)的方法優(yōu)化黃芩水提工藝。由表4 可以發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的逐步升高， 各指標(biāo)的抗氧化活性也在顯著增加（P ＜0.05）。對比胃腸模擬消化后產(chǎn)物的抗氧化活性， 可以發(fā)現(xiàn)五種指標(biāo)均是保持微沸的最大，分別為DPPH 自由基清除率44.09%、ABTS+自由基清除率77.41%、·OH 自由基清除率85.19%、總還原能力3.02、超氧陰離子清除率97.73%。 而通過秩和處理后證實(shí)了溫度對黃芩提取物的抗氧化活性具有非常大的影響， 且傳統(tǒng)的保持微沸可以使其抗氧化活性最大化。

表4 溫度對黃芩提取液及其胃腸模擬消化后產(chǎn)物的抗氧化活性及秩和處理結(jié)果

對比100 ℃水煮與保持微沸的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，兩者無論是原提取物還是胃腸消化后的產(chǎn)物，其抗氧化活性都存在著較明顯的區(qū)別（P ＜0.05）?？赡苁怯捎?00 ℃水煮只是單純保持溫度在100 ℃左右，而保持微沸的溶液其溫度不僅是在100 ℃，而且溶液本身始終處于沸騰翻滾狀態(tài)， 同樣加速了溶液中的分子運(yùn)動， 增大了黃芩粉末與水之間的接觸機(jī)會，故而增加提取率。

3.2.2 提取時(shí)間對黃芩提取物抗氧化活性的影響由表5 可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過胃腸模擬消化后，不同時(shí)間對于DPPH 自由基清除率無顯著影響（P ＞0.05）?？偪寡趸芰?、總還原能力、超氧陰離子清除率均是提取時(shí)間120 min 為最高， 但·OH 自由基清除率120 min 以35.36%居于第三，80 min 與60 min分別以36.60%、36.16%居于第一、第二，該指標(biāo)較其他四個(gè)指標(biāo)趨勢并不一致， 故需要進(jìn)行綜合性分析才可得出相關(guān)結(jié)論。

表5 時(shí)間對黃芩提取液及其胃腸模擬消化后產(chǎn)物的抗氧化活性及秩和處理結(jié)果

將數(shù)據(jù)進(jìn)行秩和處理后， 通過胃腸模擬消化產(chǎn)物的RSR 值分析可以確定， 提取時(shí)間為120 min 的提取液經(jīng)過消化后綜合抗氧化活性最高，140 min 次之。 故可以確定時(shí)間單因素試驗(yàn)中黃芩最佳提取時(shí)間為120 min。 隨著提取時(shí)間的增加， 黃芩提取物抗氧化活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這可能是因?yàn)楫?dāng)提取時(shí)間較短時(shí)，提取效率高且有效物質(zhì)未被破壞。但隨著提取時(shí)間的延長，在60 ℃條件下提取溶液中含有的某些活性成分遭到破壞而失活，故其抗氧化活性呈現(xiàn)下降趨勢。

3.2.3 液料比對黃芩提取物抗氧化活性的影響由表6 可以發(fā)現(xiàn)， 液料比單因素試驗(yàn)的顯著性并不強(qiáng)，多數(shù)指標(biāo)差異不顯著（P ＞0.05）。 以胃腸模擬消化最終產(chǎn)物的抗氧化活性數(shù)據(jù)為主， 與不同的提取時(shí)間結(jié)果一樣， 不同的液料比對于DPPH自由基清除率也無顯著影響（P ＞0.05）。 但其余的四個(gè)指標(biāo)中，均是以液料比50：1（mL/g）為最高， 分別是ABTS+自由基清除率38.47%、·OH 自由基清除率37.34%、總還原能力0.66、超氧陰離子清除率38.93%。

表6 液料比對黃芩提取液及其胃腸模擬消化后產(chǎn)物的抗氧化活性及秩和處理結(jié)果

通過秩和處理后，由表6 可知，通過胃腸模擬消化產(chǎn)物的RSR 值分析可以確定，經(jīng)過消化后液料比為50：1（mL/g）的綜合抗氧化活性最高。 故可以確定液料比單因素試驗(yàn)中黃芩最佳提取液料比為50：1（mL/g）。 對比試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，提取液料比并不是越大越好。 從液料比50：1（mL/g）到液料比60：1（mL/g）其抗氧化活性反而出現(xiàn)下降趨勢， 出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是提取液中發(fā)生了產(chǎn)物抑制， 當(dāng)提取液中的活性物質(zhì)趨近飽和或者過飽和狀態(tài)時(shí)， 就會反向抑制更多有效物質(zhì)的溶出， 并且此類抑制作用是無法通過增加底物濃度來解除的。

3.3 析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化黃芩水提工藝結(jié)果 為了進(jìn)一步提高黃芩提取物及其胃腸模擬消化后產(chǎn)物的抗氧化活性，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，固定黃芩的提取溫度即保持微沸， 對剩下的兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行兩兩組合的析因設(shè)計(jì)，其結(jié)果如表7 所示。由表7 可知，不同的指標(biāo)均呈現(xiàn)出相似的趨勢，即從組合1 開始各指標(biāo)數(shù)值均逐步攀升至組合4 時(shí)達(dá)到頂峰，再下降至組合6，然后繼續(xù)攀升至組合9。 對各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合的秩和處理后可以發(fā)現(xiàn)，組合4 為最佳的搭配組合：即提取溫度保持微沸，提取時(shí)間120 min，液料比60：1（mL/g）。其經(jīng)過消化后DPPH 自由基清除率為39.48%、ABTS+自由基清除率為58.85%、·OH 自由基清除率為48.63%、總還原能力為0.49、超氧陰離子清除率為28.87%。

對比前后單因素試驗(yàn)和析因試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，液料比有所出入。 單因素中為50：1（mL/g），而析因試驗(yàn)中為60：1（mL/g）。 其原因可能是，液料比單因素試驗(yàn)所采用的溫度為60 ℃， 而析因試驗(yàn)采用的是保持微沸， 其水分蒸發(fā)量會多于單因素試驗(yàn)。 對比兩者煮后的最終量可以發(fā)現(xiàn)，其兩者均是（50±0.25）：1（mL/g），兩者最終結(jié)果基本一致。

4 討論

通過對比黃芩提取方式及凍干粉復(fù)溶后的抗氧化活性， 結(jié)果可知黃芩醇提物無論是醇提醇溶還是醇提水溶在經(jīng)過體外胃腸模擬消化后， 其抗氧化活性均低于黃芩水提水溶。其原因可能是，黃芩的四種主要黃酮類成分黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素具有醇溶性，隨著乙醇濃度的提高，其溶解度也會相應(yīng)提高， 同時(shí)醇提可以抑制水提樣品中像鞣質(zhì)、蛋白、黏液等高分子雜質(zhì)的溶解。但這些高分子雜質(zhì)經(jīng)過消化酶的作用， 可以被分解成小分子成分， 如蛋白被酶解成多肽從而獲得相應(yīng)的抗氧化活性（崔巍，2019）。故經(jīng)過胃腸模擬消化后水提水溶的抗氧化活性會高于另外兩組。

有研究證明， 黃芩的抗氧化活性主要是與其所含有的黃芩素和漢黃芩素有關(guān)， 通過加熱或酶解作用均可以使黃芩中的黃芩苷和漢黃芩苷分解成苷元（高可新，2021），從而提高黃芩素和漢黃芩素含量。因此隨著提取溫度的升高，溶液的抗氧化活性也顯著上升。另外黃芩苷存在著較強(qiáng)的極性，不易被人體腸道所吸收。 但黃芩苷容易被消化酶所水解，形成黃芩素，同時(shí)膽汁排泄在調(diào)節(jié)黃芩苷藥代動力學(xué)中也起著關(guān)鍵作用（Zhang，2017；Kalapos，2015）。 所以在經(jīng)過胃腸模擬消化后，黃芩溶液的整體抗氧化活性會普遍提升。

結(jié)合黃芩提取的單因素試驗(yàn)與析因試驗(yàn)，可以確定黃芩最佳提取工藝為水提法，優(yōu)化后的提取參數(shù)為：保持微沸，提取時(shí)間120 min，液料比60：1（mL/g）。該提取工藝參數(shù)與利用響應(yīng)面優(yōu)化黃芩苷的水提工藝參數(shù)相近，說明黃芩的抗氧化活性仍與其所含的黃酮含量密切相關(guān)，其他大成分或許可以在消化酶的作用下水解成小分子而產(chǎn)生抗氧化活性，但不如黃芩本身所含的黃酮作用強(qiáng)。

為了使五種指標(biāo)的結(jié)果在線性范圍之內(nèi)，本試驗(yàn)將不同的樣品按不同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋，可以發(fā)現(xiàn)其稀釋倍數(shù)由大到小均為：黃芩凍干粉復(fù)溶溶液、黃芩析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)溶液、單因素試驗(yàn)溶液。其中黃芩析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)溶液稀釋倍數(shù)大于單因素試驗(yàn)溶液，可以說明其抗氧化活性在顯著提升。 而黃芩凍干粉復(fù)溶溶液大于黃芩析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)溶液的原因可能包括兩方面： 一是制樣原料加工方式不同，黃芩復(fù)溶溶液采用的是凍干粉，其是經(jīng)過精制加工后才能獲得，而單因素實(shí)驗(yàn)和析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)僅僅采用黃芩水煮；二是活性物質(zhì)含量不同，對比水提水溶組去除沉淀后和析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)的組合4 溶液去除水分后， 其活性物質(zhì)含量分別為0.0475 g/mL 和0.0071 g/mL，對比數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)溶液的抗氧化活性高于水提水溶組。

5 結(jié)論

黃芩兩種凍干粉在復(fù)溶、離心后，析出的沉淀量存在著明顯差異。 對沉淀進(jìn)行烘干去除水后稱重，可以發(fā)現(xiàn)其析出的沉淀量多少為：水提水溶＜醇提水溶＜醇提醇溶；對這三組復(fù)溶溶液進(jìn)行抗氧化指標(biāo)測定，通過RSR 值的結(jié)果表明，其抗氧化活性大小為：水提水溶＞醇提水溶＞醇提醇溶。

在單因素試驗(yàn)中，相對于時(shí)間和液料比而言，溫度對于提取過程的影響十分顯著， 隨著溫度的升高，提取液的抗氧化活性也在升高。 通過RSR 值確定提取工藝為：溫度保持微沸，提取時(shí)間120 min，液料比50：1（mL/g）。

通過析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)分析各試驗(yàn)因素之間的交互作用，通過RSR 值確定析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)的最佳提取工藝為：溫度保持微沸，提取時(shí)間120 min，液料比60：1（mL/g）。

通過上述試驗(yàn)，可以得到具有高抗氧化活性的黃芩提取物， 其DPPH 自由基清除率為39.48%、ABTS+自由基清除率為58.85%、·OH 自由基清除率為48.63%、總還原能力為0.49、超氧陰離子清除率為28.87%。 本試驗(yàn)可為有效提取黃芩抗氧化活性成分及其在氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用提供參考依據(jù)。