鹵水中耐酸耐鹽產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選

孫 昊， 唐海峰， 劉 歡， 崔子杭， 盤賽昆， 侯曉月， 楊 杰

（江蘇海洋大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，江蘇連云港 222005）

乳酸菌具有良好發(fā)酵特性。 乳酸菌（LAB）是能夠發(fā)酵糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為大量乳酸的一類物質(zhì)，呈球狀或桿狀、 不產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌的統(tǒng)稱 （Bao 等，2012）。 能產(chǎn)多種具有抑菌活性的物質(zhì)，例如：乳酸、乙酸、過氧化氫、細(xì)菌素等（Pradhan 等，2021）， 可通過競爭性排斥來抑制病原體（Ayala 等，2019）。 乳酸菌主要包括乳球菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬及腸球菌屬等。

植物乳桿菌屬于乳桿菌屬，因多數(shù)從植物中分離而得名（趙小茜等，2017；胡愛華等，2015；李利等，2015），主要來源有天然原料奶、水果、肉、蔬菜和地方特色發(fā)酵食品等 （Reuben 等，2020；Handa等，2016），此外，也存在人體的胃腸、口腔（Thompson 等，2020）。 植物乳桿菌 （Lactobacillus plantarum）作為人體和禽畜腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌之一，研究表明，其具有維持腸道健康、提高免疫力、調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡、拮抗致病菌感染、抗氧化性等多種功效（La Fata 等，2018；Rinaldi 等，2018）， 在食品、醫(yī)療保健、飼料等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，國內(nèi)外學(xué)者對其益生功能和臨床研究越來越深入。

細(xì)菌素是由乳酸菌核糖體合成的一類抗菌肽，屬于胞外產(chǎn)物，具有抑菌效率高、不易殘留、耐高溫、無毒害、不產(chǎn)生抗性（Perez 等，2014）等優(yōu)點。細(xì)菌素主要由多肽或者抗菌蛋白組成，是天然的防腐劑（鄭文雄等，2021；曹碩等，2019）。 細(xì)菌素因其安全性、穩(wěn)定性等作為生物防腐劑替代化學(xué)防腐劑是必然趨勢（Seyed 等，2018），具有廣闊應(yīng)用前景。

抗生素作為最常用的藥物之一， 能殺滅或抑制微生物（王潤玲等，2014）?？股仫暳衔桂B(yǎng)畜禽短時間可以促進動物生長、 預(yù)防或者治療動物感染等，但是長期使用會導(dǎo)致畜禽腸道菌群紊亂，生物富集層層積累到人體內(nèi)， 甚至促進超級耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生和擴散（王何中等，2019），導(dǎo)致產(chǎn)生生物安全、食品安全和環(huán)境污染等問題。 因此，自2020年7 月，我國飼料全面“禁抗”。 乳酸菌飼料制劑以其維持腸道菌群平衡、促進動物健康生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率等優(yōu)點逐漸成為抗生素的替代品（劉震坤等，2022）。本試驗從農(nóng)家生產(chǎn)發(fā)酵的鹵水中分離篩選出一株植物乳桿菌，對其生長曲線、產(chǎn)酸能力、耐酸能力、耐鹽能力和所產(chǎn)抑菌物質(zhì)進行了研究和分析，為開發(fā)優(yōu)良的乳酸菌飼料制劑提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品 試驗采用的乳酸菌篩自貴州省黔東南苗族侗族自治州農(nóng)家生產(chǎn)鹵水。

1.1.2 指示菌 金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑 MRS 肉湯、MRS 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、鹽酸、氫氧化鈉、過氧化氫酶、胃蛋白酶3000 U/g、胰蛋白酶250 U/mg、蛋白酶K 30 U/mg，革蘭氏染色試劑盒，杭州百思生物科技有限公司；乳酸菌生化鑒定試劑盒，海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備 YXQ-LS-50SI 立式壓力蒸汽滅菌器， 上海訊博實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋， 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；DHG-9240A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；DNP-9126 型電熱恒溫培養(yǎng)箱， 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；PHS-3CW Microprocessor pH/mV Merer， 上海理大智能電子有限公司； D-37520 高速冷凍離心機美國賽默飛世爾科技有限公司；3730XL 測序儀，美國ABI；SH2-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，上海越眾儀器設(shè)備有限公司；RE52-AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀， 上海亞榮生化儀器廠； BCD-537WLDPC 冰箱海爾智家股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化 取適量樣品梯度稀釋10-4～10-7后， 用涂布法接種到固體MRS 培養(yǎng)基中，每個梯度稀釋液涂布三塊平板于37 ℃倒置培養(yǎng)48 h。 根據(jù)形態(tài)特征挑選典型菌落，反復(fù)劃線獲得純菌株后進行甘油保存?zhèn)溆茫?進行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 生長曲線的測定 將活化的菌株， 按1%的接種量接種到MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，每隔2 h 取樣，在600 nm 波長處測定樣品的光密度（OD）值，繪制不同菌株的生長曲線圖。

1.2.3 產(chǎn)酸能力的測定 將活化的菌株， 按1%的接種量接種到MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，每隔2 h 取樣，測pH，繪制不同菌株的pH 曲線圖。

1.2.4 耐酸性試驗 將活化的菌株， 按1%的接種量接種到pH 分別為6.0、5.0、4.0、3.0、2.0 的MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h， 每隔2 h 取樣，在600 nm 波長處測定樣品的OD 值，每個菌株至少做3 個平行， 對菌株在不同pH 下的生長情況進行研究。

1.2.5 耐鹽性試驗 將活化的菌株， 按1%接種量接種到含NaCl 濃度分別為0、4%、8%、12%、16%的MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，在4、8、12、24、36、48 h 無菌環(huán)境下取樣，在600 nm波長處測定其OD 值。

1.3 乳酸菌發(fā)酵上清液的制備 取在甘油管中保藏的MMB-09 菌株， 以1%的接種量接到MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h 后， 再按1%接種量接種到2 L 新鮮MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。發(fā)酵結(jié)束后4 ℃、8000 g 離心20 min，棄沉淀取發(fā)酵上清液，將其在45 ℃條件下旋蒸至原始體積的1/10，放置于4 ℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 指示菌菌懸液的制備 指示細(xì)菌培養(yǎng)于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，將大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）CICC 23656、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus.Frankland），按照1%的接種量分別接種于50 mL 瓊脂培養(yǎng)基中，采用37 ℃培養(yǎng)12 h。

1.5 抑菌活性的測定 以大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CICC 23656、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus.Frankland）和腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）為指示菌，LB 作為培養(yǎng)基，采用打孔法，每個孔中加入80 μL 的乳酸菌上清液，37 ℃培養(yǎng)12 h， 通過十字交叉法測量抑菌圈直徑的大小， 測定乳酸菌的抑菌活性。

1.6 乳酸菌的鑒定

1.6.1 乳酸菌的形態(tài)特征 將分離菌株接種到MRS 固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察單菌落的形態(tài)特征。 然后挑取單菌落接種于50 mL 的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，取適量發(fā)酵液進行革蘭氏染色，鏡檢觀察菌落形態(tài)與顯微形態(tài)。

1.6.2 生理生化鑒定 根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》 和乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗方法對具有透明抑菌圈的菌株進行形態(tài)觀察和生理生化試驗。 使用乳酸菌鑒定條、 明膠生化管和其他糖類試劑盒進行乳酸菌檢驗。

1.6.3 16S rDNA 鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹 將篩選的得到的菌株按照1% 的接種量接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h 后，按照細(xì)菌基因組快速提取試劑盒的要求提取目標(biāo)菌株的基因組。PCR 擴增引物選擇細(xì)菌通用引物：27F 和1492R。PCR 反應(yīng)的總體積為50 μL：ddH2O 17 μL， 通用引物各2 μL，Mg2+3 μL，DNA 模板1 μL，PCR Mix 25 μL。 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。 經(jīng)過PCR 擴增得到的目的基因片段送至上海生工生物公司測序。 所得到的序列提交GenBank 比對， 用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的確定

1.7.1 排酸試驗 使用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 溶液調(diào)整發(fā)酵上清液的pH 至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，37 ℃孵育30 min，然后將pH 調(diào)節(jié)回原pH=4，；選擇同時配制的MRS 培養(yǎng)基，并使用乳酸溶液調(diào)MRS 培養(yǎng)基至相同的pH 作為空白對照，其余操作相同。以蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌作為指示菌做抑菌試驗驗證相同pH 下的抑菌活性。 篩選出發(fā)酵過程中可產(chǎn)除了乳酸之外的抑菌物質(zhì)的菌株。

1.7.2 過氧化氫酶試驗 調(diào)整濃縮后的上清液pH 至過氧化氫酶的最適pH 7.0，加入4000 U/mL的過氧化氫酶， 振蕩混勻后，37 ℃水浴保溫2 h。對照選擇同樣加酶處理的MRS 培養(yǎng)基。結(jié)束后以蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌作指示菌做抑菌試驗驗證發(fā)酵上清液的抑菌活性， 判定抑菌物質(zhì)是否為過氧化氫。

1.7.3 蛋白酶敏感試驗 調(diào)整濃縮后的上清液pH 至胃蛋白酶最適pH 1.7， 添加胃蛋白酶量為4000 U/mL； 調(diào)整上清液pH 至胰蛋白酶最適pH 8.1，添加胰蛋白酶量為2500 U/mL；充分振蕩混勻后，37 ℃水浴保溫4 h； 調(diào)整上清液pH 至蛋白酶K 最適pH 8.0，添加蛋白酶K 量為2500 U/mL；充分振蕩混勻后，37 ℃水浴保溫4 h。對照選擇同樣處理的MRS 培養(yǎng)基。抑菌試驗驗證發(fā)酵上清液的抑菌活性，判定抑菌物質(zhì)是否為細(xì)菌素。

1.8 數(shù)據(jù)處理 所有試驗均以相同的方法重復(fù)三次，所有樣品均進行三次平行分析。試驗所得數(shù)據(jù)利用Excel 軟件計算得出各組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差；采用SPSS 統(tǒng)計學(xué)20（IBM 公司，NY，USA）進行顯著性分析，并以P ＜0.05 值評估顯著性分析。繪圖采用Origin 2021，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳酸菌的篩選 采用瓊脂孔擴散法，以蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和腐敗希瓦氏菌為指標(biāo)菌， 根據(jù)抑菌圈直徑的大小， 初篩出的155 株菌中， 選取C8、L13、L14、X5、LS4、G16、S32、MMB-09 作為復(fù)篩的研究對象，結(jié)果如表1 所示。

表1 不同菌株的抑菌圈直徑

2.2 乳酸菌的生長及代謝特性研究

2.2.1 乳酸菌菌株的生長曲線 由圖1 可知，8 株菌株中的大部分在4 ～8 h 處于對數(shù)生長期，此時，8 株菌生長速率快， 符合工業(yè)化菌株的基本要求，菌株L13、L14、C8、MMB-09 在8 h 時OD600達(dá)到2.0 以上；12 ～36 h 進入穩(wěn)定期，活菌數(shù)變化不大，此時L13、L14、MMB-09 的生物量多于其他菌株；菌株MMB-09 在36 h 后進入衰亡期。

圖1 8 株乳酸菌的生長曲線

2.2.2 乳酸菌菌株的產(chǎn)酸能力測定結(jié)果 乳酸菌的活力良好的特征之一便是產(chǎn)酸能力， 由圖2 可知，L13、LS4 和MMB-09 在較短時間內(nèi)產(chǎn)生大量有機酸， 使其pH 在8 h 后迅速降到4.2 左右，除了X5、G16 和S32 這三株菌， 其余菌株均在12 h時發(fā)酵產(chǎn)酸使pH 降低至4 左右， 而這三株菌也在20 h 左右pH 達(dá)到4 附近， 這與杜賀超等（2021） 的菌株P(guān)C4-5 產(chǎn)酸情況類似。 C8、L13、L14、LS4、MMB-09、X5、G16 以及S32 均展示了較好的產(chǎn)酸能力。

圖2 8 株乳酸菌的產(chǎn)酸能力

2.2.3 耐酸性試驗結(jié)果 乳酸菌在到達(dá)腸道定植發(fā)揮其益生作用前會經(jīng)過胃部環(huán)境消化2 ～3 h，人和動物的胃液環(huán)境pH 一般保持在3.0 左右，因此篩選作乳酸菌制劑的菌株需要良好的耐酸能力（JunLi 等，2021）。 圖3 中，當(dāng)pH 為2.0 時，8 個菌株的生長均受到嚴(yán)重抑制；當(dāng)pH 為3.0 時，菌株L13、LS4 和MMB-09 有所生長，其中LS4 生長最好，OD600值最高達(dá)到0.5， 其余菌株C8、L14、X5、G16 以及S32 的生長仍然受到嚴(yán)重抑制； 當(dāng)pH為4.0 時，8 株菌的生長曲線均呈上升趨勢，OD600最高能達(dá)到2.1，大部分集中在1.5 ～2.0。 這與趙鑫等 （2022） 在傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中篩選出的Z5 在pH=4.0 時OD600的值相似。 綜上所述，L13、LS4 和MMB-09 表現(xiàn)出較強的耐酸能力。

圖3 乳酸菌菌株耐酸能力的測定結(jié)果

2.2.4 耐鹽性試驗結(jié)果 由圖4 可知， 在不同鹽濃度下均有一定的生長，OD600的值隨著NaCl 含量的增加而降低， 且在各個濃度均呈現(xiàn)先上升后穩(wěn)定的趨勢。 在NaCl 含量增加到80 g/L 時，與其余濃度相比，菌株前期的生長較為緩慢，但仍能生長。 這與Hiroshi 等（2003）的菌株在0% ～15%濃度下可以生長的研究一致。 綜上所述，C8、L13、L14、LS4、MMB-09、X5、G16 以及S32 均呈現(xiàn)出較好的耐鹽能力。

圖4 乳酸菌菌株耐鹽能力的測定結(jié)果

結(jié)合抑菌能力、生長曲線、產(chǎn)酸能力、耐酸能力和耐鹽能力， 最終決定選取MMB-09 做進一步試驗。

2.2.5 乳酸菌形態(tài)特征的鑒定 菌株MMB-09在MRS 固體培養(yǎng)基上生長良好， 培養(yǎng)24 h 后形成乳白色小菌落。 菌落凸起，表面光滑圓潤，邊緣整齊，屬典型的乳酸菌菌落特征。 在MRS 液體培養(yǎng)基中30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，菌液渾濁，生長狀態(tài)良好。 革蘭氏染色后（圖5），鏡檢為藍(lán)紫色，顯示為革蘭氏陽性短桿菌，無芽孢。

圖5 菌株MMB-09 的形態(tài)特征

2.2.6 生理生化 菌株MMB-09 發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)生氣體；明膠液化呈陰性；精氨酸水解呈陰性；能夠發(fā)酵利用海藻糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、甘露糖、蜜二糖、水楊苷（表2）。 參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，表明該菌株為植物乳桿菌。

表2 菌株MMB-09 的生理生化鑒定結(jié)果

2.2.7 16S rDNA 基因序列分析 使用試劑盒提取MMB-09 的DNA 為模板進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物送去上海生工生物公司測序， 測序結(jié)果經(jīng)過同源性比較發(fā)現(xiàn)， 其與植物乳桿菌的相似度達(dá)95%，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定和16S rDNA 分子生物學(xué)鑒定， 以及細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)的分析，初步鑒定該菌株為植物乳桿菌，命名為植物乳桿菌MMB-09。 利用MEGA 7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株MMB-09 與植物乳桿菌在同一分支。

圖6 菌株MMB-0916S rDNA 序列系統(tǒng)進化樹

2.3 所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的鑒定

2.3.1 排酸結(jié)果 有研究表明， 乳酸菌的代謝產(chǎn)物中具有多種抑菌物質(zhì)，包括有機酸、過氧化氫等（陸春波，2019）。使用NaOH 溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液pH 至7.0 后，發(fā)酵液抑菌性逐漸減弱（P ＜0.05），但仍有明顯的抑菌效果， 由此推測在發(fā)酵上清液中，有機酸不是MMB-09 發(fā)酵上清液的主要抑菌物質(zhì)，還存在其他具有抑菌作用的物質(zhì)（表3），這與呂蕾等（2022）對于ZW2、ZW9 以及ZW14 的排酸試驗結(jié)果一致。

表3 菌株MMB-09 的排酸結(jié)果

2.3.2 過氧化氫的排除 經(jīng)過氧化氫酶處理后，發(fā)酵上清液的抑菌性變?。≒ ＜0.05），但是還保留78.41% ～86.03%的抑菌效果，說明發(fā)酵上清液中的抑菌作用僅有小部分是由過氧化氫引起的（表4），這與涂小麗等（2018）對于過氧化氫酶處理后的乳酸菌上清液仍有較強抑菌作用一致。 表明發(fā)酵上清液中還存在其他抑菌物質(zhì)。

表4 過氧化氫的排除以及蛋白酶穩(wěn)定性抑菌圈直徑 mm

2.3.3 蛋白酶敏感試驗 試驗結(jié)果表明， 發(fā)酵上清液經(jīng)胰蛋白酶、 蛋白酶K 和胃蛋白酶處理后，與原發(fā)酵液相比， 抑菌活性分別降低了13.97%、14.29%、21.59%（P ＜0.05）。 進一步證明抑菌物質(zhì)的成分中有蛋白質(zhì)類物質(zhì)，這與辛婷等（2022）對菌株A2、A7 以及A13 的蛋白酶敏感的研究結(jié)果類似，證明該菌株可產(chǎn)細(xì)菌素。

3 結(jié)論

我國“禁抗”以來，用作飼料添加劑的乳酸菌菌株主要從動物和人類的消化道、腸道、糞便以及發(fā)酵食物中分離。 本研究從貴州省黔東南苗族侗族自治州農(nóng)家生產(chǎn)鹵水中分離純化獲得一株耐鹽耐酸產(chǎn)細(xì)菌素能力較好的菌株MMB-09， 經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定其為植物乳桿菌。植物乳桿菌MMB-09 進入對數(shù)期較快，說明該菌株能夠大量增殖，符合篩選要求。 動物的胃液環(huán)境pH 一般保持在3.0 左右，食物在胃里消化的時間為2 ～3 h，因此篩選作乳酸菌制劑的菌株需要良好的耐酸能力， 菌株MMB-09 在pH 為3.0 時仍保持良好的生長狀態(tài)，說明具有一定的耐酸性能，對于動物的胃部環(huán)境有一定的耐受力， 加入飼料中的乳酸菌能通過胃部環(huán)境定植動物腸道發(fā)揮其益生作用。 乳酸菌菌株MMB-09 在生長過程中通過快速產(chǎn)酸降低腸道pH，能有效抑制部分有害微生物生長（Nagpal 等，2012）。 該菌株經(jīng)過排酸試驗證實其所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在pH 為7.0 時還保留35%的抑菌效果，說明其所產(chǎn)抑菌物質(zhì)不是酸類物質(zhì)，且被過氧化氫酶和各類蛋白酶處理過后一部分抑菌活性消失，說明其所產(chǎn)抑菌物質(zhì)存在蛋白質(zhì)類，證明其代謝產(chǎn)物有細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)。這些結(jié)果表明，植物乳桿菌MMB-09 適合作為乳酸菌飼料制劑的優(yōu)良菌株， 為后續(xù)開發(fā)乳酸菌飼料制劑提供資料和參考。