CTA1-DD蛋白在枯草芽胞桿菌中的分泌表達(dá)

張?jiān)i，侯立婷，杜露平，于曉明，李蘭，楊利，張浩明，王義偉，喬緒穩(wěn)，程海衛(wèi)，秦竹，3，4，5*，陳瑾 ，3，4，5*，鄭其升，3，4，5*

(1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫工程研究所，江蘇 南京 210014；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014；3. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；4. 江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，江蘇 南京 210014；5. 獸用生物制品(泰州)國(guó)泰技術(shù)創(chuàng)新中心，江蘇 泰州 225300)

黏膜系統(tǒng)不但是病毒侵入宿主機(jī)體的主要位點(diǎn)，同時(shí)也是宿主對(duì)抗病毒感染的免疫反應(yīng)的重要場(chǎng)所。黏膜免疫能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生多種類型的免疫反應(yīng)：促進(jìn)分泌型IgA(sIgA)的產(chǎn)生，血清中產(chǎn)生IgG中和抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[1]。盡管黏膜免疫具有很多的優(yōu)點(diǎn)，但是由于黏膜系統(tǒng)具有免疫屏障，往往單純的免疫抗原并不能引起足夠的免疫反應(yīng)。為了增強(qiáng)抗原的免疫原性，免疫的過程中往往要添加免疫佐劑。霍亂毒素(CT)作為當(dāng)前最熱門的黏膜佐劑之一，當(dāng)與抗原混合使用進(jìn)行口服或者滴鼻免疫時(shí)，能夠引起強(qiáng)烈的黏膜免疫和系統(tǒng)免疫，因此被認(rèn)為是最有應(yīng)用前景的佐劑之一[2]，但是由于其具有神經(jīng)毒性，限制了開發(fā)和利用[3-5]。為了解決這個(gè)問題，Agren等[6]通過把CTA1亞基與葡萄球菌G蛋白的D肽偶聯(lián)在一起，構(gòu)建了基因融合蛋白CTA1-DD。葡萄球菌G蛋白的D肽通過與免疫球蛋白的Fc和Fab片段結(jié)合，可以將CTA1導(dǎo)向免疫球蛋白，而且還能夠?qū)駼細(xì)胞受體。融合蛋白CTA1-DD保留了具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的CTA1亞基，而CTB亞基和與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂受體結(jié)合的能力被去除。廣泛的研究表明，CTA1-DD融合蛋白具有與完整CT分子相當(dāng)?shù)娜砗宛つっ庖叩淖魟┕δ躘7]。CTA1-DD提供了相當(dāng)?shù)淖魟┬Ч?，大大增?qiáng)了機(jī)體對(duì)與佐劑聯(lián)合免疫的特異性免疫原的細(xì)胞和體液免疫力[8]。

本研究采用枯草芽胞桿菌分泌表達(dá)CTA1-DD基因，旨在獲得胞外分泌的CTA1-DD蛋白，并初步驗(yàn)證其黏膜佐劑活性，為大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

流感病毒HA抗原由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院劉青濤副研究員惠贈(zèng)；6周齡ICR小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；枯草芽胞桿菌WB600、重組穿梭載體pHT43、pMDT-18T-CTA1-DD-His載體、大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；ExTaq酶 、T4 DNA連 接 酶 、 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物科技有限公司；蛋白Marker購自Thermo公司；氨芐青霉素、氯霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購自上海生工生物工程公司；瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司；Ni-IDA瓊脂糖純化樹脂購自中科森輝微球技術(shù)公司；凝膠法鱟試劑盒購自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司；鼠抗His單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗購自南京翼飛雪生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgA二抗購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 重組表達(dá)載體pHT43-CTA1-DD構(gòu)建

用XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切pMDT-18T-CTA1-DD-His對(duì)CTA1-DD基因片段進(jìn)行膠回收，然后用 T4連接酶與同樣雙酶切后膠回收的pHT43載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過夜。挑選單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，陽性克隆送入南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.3 CTA1-DD在枯草芽胞桿菌WB600中的轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá)

將重組載體pHT43-CTA1-DD通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法[9]轉(zhuǎn)入枯草芽胞桿菌WB600中，涂布于含有終濃度為10 μg/mL氯霉素的固體LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取陽性克隆，在含有氯霉素LB培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)至OD值為0.5～1.0時(shí)，加入1.0 mmol/L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)24 h后離心取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.4 3L發(fā)酵罐培養(yǎng)

將菌液按照5%體積分?jǐn)?shù)接種到3L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)條件：溫度37 ℃，pH=7.2，攪拌轉(zhuǎn)速為500 r/min，溶氧為30%，通氣量為1.0 (V/V·min)，添加1.0 mmol/L的IPTG，分別在6、12、24、36 h取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5 重組蛋白的純化

將發(fā)酵液離心取上清液，加入終濃度為20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl后按照Ni-IDA 說明書進(jìn)行層析純化，收集洗脫蛋白并用脫鹽柱進(jìn)行脫鹽。然后參照凝膠法鱟試劑盒說明書檢測(cè)蛋白的內(nèi)毒素含量，并用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量分析。

1.6 重組蛋白的Western blot鑒定

將純化后的樣品經(jīng)處理后進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂乳37 ℃封閉2 h，PBST洗滌5次；用1∶1 000稀釋的鼠抗His單克隆抗體作為一抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5次；放入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗中，37 ℃作用30 min，PBST 洗滌5次后，DAB進(jìn)行顯色。

1.7 CTA1-DD重組蛋白佐劑活性的測(cè)定

將30只雌性6周齡的ICR小鼠隨機(jī)分成3組：第1組，生理鹽水；第2組，生理鹽水+5 μg流感病毒HA抗原；第3組，10 μg CTA1-DD蛋白+5 μg流感病毒HA抗原，每只小鼠免疫的體積為20 μL。將疫苗分別于第0、14天對(duì)小鼠進(jìn)行滴鼻免疫，在免后4周眼眶采血分離血清，小鼠處死后用200 μL的PBS對(duì)支氣管肺泡進(jìn)行灌洗并收集灌洗液。采用終點(diǎn)稀釋ELISA法檢測(cè)特異性IgG和IgA抗體的滴度[10]，具體步驟如下：ELISA板包被HA抗原(200 ng/孔)，用含有3%的PBST封閉1 h后，再用PBST清洗3次。制備2倍連續(xù)稀釋的血清和黏膜樣品，分別加入孔中。37 ℃孵育1 h后，PBST洗3次，加入1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG二抗或者HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgA二抗，37 ℃孵育1 h，洗3次后加入底物液顯色15 min后，加入2 mol/L的硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值A(chǔ)450 nm。樣品的抗體滴度為樣品孔A450 nm-空白孔A450 nm≥0.2的最大稀釋倍數(shù)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體pHT43-CTA1-DD的構(gòu)建

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板，挑取單克隆菌落，提取質(zhì)粒，用XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切鑒定。如圖1所示，重組質(zhì)粒被切成2個(gè)片段，分別得到一個(gè)約8 000 bp的條帶，與pHT43載體大小相等；另一個(gè)片段約1 000 bp，與目的片段(CTA1亞基和DD亞基大小分別為585 bp和576 bp)大小相符。

M.5000 DNA Ladder；1. pHT43-CTA1-DD雙酶切產(chǎn)物。

2.2 CTA1-DD重組蛋白在枯草芽胞桿菌中的表達(dá)驗(yàn)證

將空載體pHT43重組菌和含重組質(zhì)粒pHT43-CTA1-DD重組菌WB600經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后終止，離心取上清液進(jìn)行SDS-PAGE，如圖2所示。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組上清液在43 kDa處出現(xiàn)明顯的外源蛋白條帶，該蛋白分子量大小與CTA1-DD融合蛋白預(yù)期的分子量一致。Western blot結(jié)果(圖3)也證明CTA1-DD基因在枯草芽胞桿菌中已成功表達(dá)，其表達(dá)量約占上清液總蛋白的60%。

M. 預(yù)染Marker；1. pHT43空載體發(fā)酵液上清液；2. pHT43-CTA1-DD發(fā)酵液上清液。

M.蛋白Marker；1. pHT43空載體發(fā)酵液上清液；2～3. pHT43-CTA1-DD發(fā)酵液上清液。

2.3 CTA1-DD重組蛋白的發(fā)酵表達(dá)及蛋白的純化

使用發(fā)酵罐來表達(dá)CTA1-DD重組蛋白，分別在6、12、24、36 h取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖4)，可以發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移蛋白的表達(dá)量越高，最終在36 h達(dá)到最高，產(chǎn)量約為700 μg/mL。收集上清液通過鎳離子柱親和層析純化的方法進(jìn)行純化，經(jīng)過100 mmol/L咪唑的沖洗后，再用500 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫后即可獲得較高純度的CTA1-DD蛋白(圖5)。純化的蛋白經(jīng)過脫鹽柱脫鹽后，BCA法檢測(cè)蛋白濃度為0.15 mg/mL，內(nèi)毒素含量低于10 U/mL。

1～4. 發(fā)酵時(shí)間分別為6、12、24和36 h；M.蛋白Marker。

2.4 CTA1-DD重組蛋白佐劑活性

為了驗(yàn)證枯草芽胞桿菌表達(dá)的CTA1-DD重組蛋白佐劑活性，將10 μg的CTA1-DD蛋白與5 μg流感病毒HA抗原混合后滴鼻免疫小鼠(第3組)，分別設(shè)生理鹽水組(第1組)和HA對(duì)照(第2組)，28 d后收集血清和鼻腔灌洗液分別檢測(cè)IgG和IgA抗體。血清IgG抗體檢測(cè)結(jié)果顯示免疫HA組只能誘導(dǎo)很低的IgG抗體，而添加CTA1-DD蛋白組能夠誘導(dǎo)更高的IgG抗體水平；黏膜IgA抗體檢測(cè)結(jié)果顯示添加CTA1-DD蛋白也能夠顯著提升IgA抗體水平(圖6)，說明枯草芽胞桿菌表達(dá)的重組CTA1-DD蛋白具有佐劑活性。

3 討論

CTA1-DD蛋白作為黏膜佐劑在預(yù)防傳染病疫苗方面的功效得到了充分驗(yàn)證，科研人員證明CTA1-DD可用于人類免疫缺陷病毒(HIV)，人類乳頭瘤病毒(HPV)，埃博拉病毒(EBOV)、甲型流感病毒(H1N1)和輪狀病毒(RV)等病毒疫苗的顯著保護(hù)[11-15]。同時(shí)科研人員也發(fā)現(xiàn)CTA1-DD佐劑鼻內(nèi)免疫可以增強(qiáng)對(duì)幽門螺桿菌和結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)性免疫[16-17]。根據(jù)這些報(bào)道和建議，我們相信它在其他黏膜疫苗中也是有效的。因此，CTA1-DD作為黏膜佐劑是非常理想和安全的。當(dāng)前獸用疫苗中，禽流感病毒(AIV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)等病毒疫苗都需要強(qiáng)有力的黏膜佐劑來提高黏膜免疫的效力。但是文獻(xiàn)報(bào)道的CTA1-DD蛋白多由大腸桿菌表達(dá)，蛋白產(chǎn)量低，還需要進(jìn)行細(xì)菌破碎、純化等復(fù)雜工藝，并且革蘭陰性菌表達(dá)系統(tǒng)會(huì)伴有大量的內(nèi)毒素，處理過程繁瑣、成本高，限制了其在獸用疫苗上的應(yīng)用。

原核表達(dá)系統(tǒng)中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛，操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉，體系也非常成熟和完善。但其最大缺點(diǎn)是目的蛋白只能表達(dá)于胞內(nèi)和周質(zhì)空間，不能像其他真核表達(dá)系統(tǒng)在胞外分泌表達(dá)，雖然也有一些信號(hào)元件可以實(shí)現(xiàn)這個(gè)功能，但是遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有芽胞桿菌容易和高效?？莶菅堪麠U菌表達(dá)系統(tǒng)作為原核表達(dá)系統(tǒng)的一種，是一種對(duì)環(huán)境無害的革蘭陽性細(xì)菌且能分泌表達(dá)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品行業(yè)[18]?？莶菅堪麠U菌表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，其優(yōu)勢(shì)如：非致病性、細(xì)胞壁組成簡(jiǎn)單、重組表達(dá)的蛋白內(nèi)毒素低、較低密碼子偏愛性、表達(dá)蛋白可溶性高、生物活性好[19]。本試驗(yàn)采用枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)，其一是蛋白能夠直接分泌到培養(yǎng)基中，省去了大腸桿菌所需的菌體的離心、破碎等過程；其二是枯草芽胞桿菌不含有內(nèi)毒素，不會(huì)引起動(dòng)物的不良反應(yīng)。本試驗(yàn)選用枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了可溶性蛋白CTA1-DD，證明它是一種很有優(yōu)勢(shì)的表達(dá)系統(tǒng)。使用發(fā)酵罐發(fā)酵36 h蛋白的產(chǎn)量就能夠達(dá)到700～1 000 mg/L，目的蛋白能占到上清液總蛋白的60%以上。將發(fā)酵液經(jīng)過簡(jiǎn)單的離心后，上清液就可以直接進(jìn)行親和層析純化，并且能夠獲得很純的目的蛋白。蛋白經(jīng)過檢測(cè)，不含有內(nèi)毒素，可直接進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，極大地精簡(jiǎn)了蛋白的處理步驟，為大規(guī)模應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

為了驗(yàn)證枯草芽胞桿菌表達(dá)的CTA1-DD蛋白是否具有佐劑活性，本研究將CTA1-DD蛋白與HA抗原混合滴鼻后，顯著提高了小鼠血清中的IgG抗體水平及肺泡黏膜中的sIgA抗體水平，表明CTA1-DD很好地發(fā)揮了黏膜佐劑作用，顯著提升了小鼠呼吸道局部黏膜免疫應(yīng)答。本試驗(yàn)說明枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的CTA1-DD蛋白是一種有效的黏膜佐劑，并且具有產(chǎn)量高、易于純化等特點(diǎn)，為以后的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。