響應(yīng)面優(yōu)化連翹葉總?cè)铺崛」に嚰捌淇鼓[瘤活性研究

王學(xué)方，陳 玲，歸 榮，寧二娟，王 偉，王學(xué)兵，李 曉

（1.河南省納普生物技術(shù)有限公司，鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450000）

連翹葉為木犀科植物連翹（Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl）的干燥葉，在中國民間已有較長的藥用歷史［1］，古典典籍《玉樵醫(yī)令》中記載：“連翹葉，味苦，性寒，可瀉火，入心肺二經(jīng)”。在《中藥大辭典》和《中華本草》等近代典籍中，對連翹葉的描述是“連翹莖葉具有清熱、解毒之功效”。在中國，目前人們僅把它當(dāng)作茶葉來飲用，用于咽喉腫痛等癥［2］。連翹葉富含木脂素、連翹酯苷A、熊果酸等化合物，具有調(diào)節(jié)血脂、抗疲勞、抗衰老和抗流感等多種保健作用［3］，有研究表明連翹葉有可能作為藥用部位連翹果實的補充和替代，也可以作為中草藥飼料添加劑用于獸醫(yī)臨床等，應(yīng)用前景十分廣闊，具有很高的社會意義和商業(yè)價值［4］。

連翹葉中含有豐富的三萜類化合物，如熊果酸、齊墩果酸、白樺脂酸等，且含量均高于連翹果實［5，6］。大量研究表明熊果酸具有抗炎、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤、抗糖尿病、擴張血管和增強機體免疫力等作用；齊墩果酸具有保肝、降血糖、抗HIV 和抗腫瘤等功效；白樺脂酸具有消炎、殺菌、抗瘧疾、抗腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用等功效［7，8］。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，未見對連翹葉總?cè)频奶崛」に嚺c抗腫瘤活性研究［9-14］。鑒于此，本試驗采用響應(yīng)面法考察了連翹葉總?cè)频某暡ㄌ崛」に嚕⑦M(jìn)一步利用大孔樹脂富集純化，同時檢測其抗腫瘤活性，為連翹葉資源的科學(xué)開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

連翹葉采自河南省欒川縣，自然曬干，粉碎過篩（20 目）備用；人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231 細(xì)胞，肝癌HepG2、SNU-739 細(xì)胞，結(jié)腸癌HT29、HCT116細(xì)胞和正常肝細(xì)胞HL-7702 均購自上海中科院細(xì)胞庫；DMEM、RPMI1640 培養(yǎng)液、青鏈雙抗和胎牛血清（Gibco 公司）；CCK-8（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；齊墩果酸對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：19111301）；熊果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110742-201622）；白樺脂酸對照品（四川中草藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，批號：200804）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

UC-15B 型超聲波清洗機（功率360 W，頻率50 kHz），游目儀器（上海）有限公司；RE100-S 型旋轉(zhuǎn)手動蒸發(fā)儀，大龍興創(chuàng)儀器有限公司；DLSB-5L/20 型低溫冷卻循環(huán)泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；TU-1810 型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；NBS-U410 型超低溫冰箱、NBS-170S 型二氧化碳培養(yǎng)箱，Eppendorf 公司；1300 SERIES A2 型生物安全柜，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；LC-20AD 型高效液相色譜儀系統(tǒng)，日本株式會社島津制作所。

1.3 方法

1.3.1 連翹葉總?cè)铺崛」に嚵鞒?連翹葉→干燥→粉碎→過篩（20 目）→稱重→超聲提取→過濾→減壓濃縮干燥→連翹葉總?cè)拼謽悠贩勰側(cè)拼制啡芤骸罂讟渲患兓鷾p壓濃縮干燥→連翹葉總?cè)萍兓贰?/p>

1.3.2 連翹葉總?cè)频暮繙y定 根據(jù)2020 年版《中華人民共和國藥典》［15］靈芝三萜含量測定的方法，并結(jié)合提取三萜相關(guān)文獻(xiàn)的報道方法［12］，確定本研究采用紫外分光光度法測定連翹葉中總?cè)频暮俊?/p>

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密稱定齊墩果酸對照品1.96 mg，加乙醇制成每1 mL 含196 μg 的溶液，吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、0.90 mL 上述對照品溶液，分別置于10 mL 具塞試管中，75 ℃烘箱揮干溶劑后，精密加入0.2 mL 新配制的香草醛冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，震搖均勻后置于70 ℃水浴中加熱25 min，取出冷卻至室溫，加入乙酸乙酯4 mL，震搖均勻，于546 nm 波長處測定吸光度。得回歸方程為y＝0.011 6x-0.013 7（R2＝0.993 6）。

2）連翹葉總?cè)茰y定及提取率的計算。根據(jù)“1.3.2”項下回歸方程，計算連翹葉總?cè)铺崛悠分锌側(cè)频暮?，提取率計算公式為?/p>

式中，X表示根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中的齊墩果酸含量（%）；m表示提取樣品質(zhì)量（g）；M表示連翹葉粉末質(zhì)量（g）。

1.3.3 連翹葉總?cè)浦行芄?、齊墩果酸和白樺脂酸的含量測定

1）供試品溶液的配制。精密稱取純化后連翹葉總?cè)茦悠?.021 3 g，置50 mL三角瓶中，加入10 mL的95%乙醇溶液，稱其質(zhì)量后，超聲30 min，使其溶解，放冷，用乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。分別精密稱取熊果酸、齊墩果酸、白樺脂酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，置100 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成每1 mL 分別含0.200 3、0.170 1、0.204 8 mg 對照品的儲備液，4 ℃冰箱保存，備用。

3）HPLC 檢 測條 件。色 譜柱：Eclipse plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1 mol/L 乙酸銨溶液（85∶15）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：210 nm，進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.4 單因素試驗 分別設(shè)置不同的乙醇濃度、料液比、提取時間以及溫度，探究其對連翹葉總?cè)铺崛÷实挠绊憽?/p>

1.3.5 響應(yīng)面試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）和提取溫度（D）這4 個因素作為響應(yīng)因子，以總?cè)铺崛÷剩╕）為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計4 因素3 水平響應(yīng)面試驗。因素水平見表1。

1.3.6 連翹葉總?cè)拼罂讟渲患兓?選擇6 種大孔樹脂進(jìn)行試驗，研究不同型號大孔樹脂對連翹葉總?cè)萍兓挠绊?，取最佳超聲工藝提取的連翹葉總?cè)拼謽悠愤m量，加水超聲溶解，制成濃度為100 mg/mL 的樣液200 mL。取預(yù)處理好的大孔樹脂100 g 濕法裝入3 cm×70 cm 色譜柱中，按1.5 mL/min的流速將配制好的連翹葉總?cè)拼謽悠啡芤壕徛现儆萌ルx子水快速沖至流出液無色；然后先用65%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，再用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液以流速2.0 mL/min 進(jìn)行洗脫，收集95%乙醇洗脫液。將95%乙醇洗脫液減壓濃縮至干，得到連翹葉總?cè)聘稍锓勰?，用于抗腫瘤活性測定，并用HPLC 測定其總?cè)?、熊果酸、齊墩果酸和白樺脂酸的含量。

1.3.7 連翹葉總?cè)频目鼓[瘤活性研究 以米托蒽醌為陽性對照，采用CCK-8 法測定其對人乳腺癌MCF-7 細(xì) 胞 和MDA-MB-231 細(xì) 胞、肝 癌HepG2 細(xì)胞和SNU-739 細(xì)胞、結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞和HCT116 細(xì)胞及正常肝細(xì)胞HL-7702 細(xì)胞的抗腫瘤活性。細(xì)胞在DMEM 和RPMI1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、50 IU/mL 青霉素和50 μg/mL 鏈霉素）中培養(yǎng)，并保持在37 °C。取正處于對數(shù)生長期的細(xì)胞于96 孔平底板中，每孔放置2.5×104個細(xì)胞。培養(yǎng)24 h 后，用含有不同濃度受試樣品的培養(yǎng)基代替生長培養(yǎng)基。孵 育48 h 后，棄 去 原 培 養(yǎng) 基，加 入100 μL 的10%CCK-8 溶液（培養(yǎng)基稀釋），在培養(yǎng)箱中放置1.5~2.0 h。用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處檢測其吸光度，并計算其IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 不同乙醇濃度對連翹葉總?cè)铺崛÷实挠绊?固定料液比1∶35 g/mL，提取時間30 min，提取溫度55 ℃，考察乙醇濃度分別為45%、55%、65%、75%、85%、95%時對連翹葉總?cè)铺崛÷实挠绊?。由圖1 可知，隨著乙醇濃度的升高，連翹葉總?cè)频奶崛÷氏瓤焖偕吆蠼档?，在乙醇濃?5%時達(dá)到最大。

圖1 乙醇濃度對連翹葉總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>

2.1.2 不同料液比對連翹葉總?cè)铺崛÷实挠绊懝潭ㄒ掖紳舛?5%，提取時間30 min，提取溫度55 ℃，考察料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL 時對連翹葉總?cè)铺崛÷实挠绊憽Ｓ蓤D2可知，料液比對連翹葉總?cè)铺崛÷实挠绊懖皇呛艽螅B翹葉總?cè)铺崛÷孰S提取溶劑的增大呈上升趨勢，當(dāng)料液比為1∶30 g/mL 時，連翹葉總?cè)铺崛÷室掩呌诜€(wěn)定。因此，選取料液比為1∶30 g/mL。

圖2 料液比對連翹葉總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>

2.1.3 不同提取時間對連翹葉總?cè)铺崛÷实挠绊?固定乙醇濃度75%，料液比1∶30 g/mL，提取溫度55 ℃，考察提取時間分別為10、20、30、40、50、60 min 時對連翹葉總?cè)铺崛÷实挠绊?。由圖3 可知，隨著提取時間的增加，連翹葉總?cè)频奶崛÷室仓饾u升高，提取時間為40 min 時連翹葉總?cè)铺崛÷室堰_(dá)最高，隨后出現(xiàn)下降的趨勢，可能是由于提取時間過長，其他成分的溶出較多，以致于降低了總?cè)频奶崛÷省?/p>

圖3 提取時間對連翹葉總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>

2.1.4 不同提取溫度對連翹葉總?cè)铺崛÷实挠绊?固定乙醇濃度75%，料液比1∶30 g/mL，提取時間40 min，考察提取溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃時對連翹葉總?cè)铺崛÷实挠绊?。由圖4 可知，隨著提取溫度的升高，連翹葉總?cè)频奶崛÷示徛仙?，?dāng)提取溫度達(dá)50 ℃時，提取率最高；之后又緩慢降低，可能溫度過高對總?cè)频姆€(wěn)定性產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致提取率下降。

圖4 提取溫度對連翹葉總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化連翹葉總?cè)铺崛」に?/h3>

2.2.1 響應(yīng)面試驗方案與結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計進(jìn)行試驗，不同工藝條件下連翹葉總?cè)铺崛≡囼炘O(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗 利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到連翹葉總?cè)铺崛÷剩╕）對乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）和提取溫度（D）的二次多項回歸方程為：Y=13.95+1.16A+0.87B+0.91C+0.59D+0.60AB+ 0.54AC- 0.22AD+ 0.002 5BC+ 0.33BD-0.078CD-1.27A2-1.59B2-1.94C2-1.68D2。對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。該試驗所建模型極顯著（P<0.000 1）；模型失擬項P=0.320 3>0.05，表明失擬不顯著。方差分析結(jié)果得出決定系數(shù)R2和校正決定系數(shù)RAdj2分別為0.960 5 和0.921 1，說明該模型預(yù)測性能良好，因此用該模型分析和預(yù)測連翹葉中總?cè)频奶崛÷适呛线m的。

表3 方差分析結(jié)果

方差分析結(jié)果表明，回歸模型的一次項A、B、C、D極顯著（P<0.01）；交互項AB顯著（P<0.05）；二次項A2、B2、C2、D2極顯著（P<0.01）；其余均不顯著。影響連翹葉總?cè)铺崛÷实囊蛩乇憩F(xiàn)為A>C>B>D，即乙醇濃度>提取時間>料液比>提取溫度。

2.2.3 提取工藝的響應(yīng)面交互作用分析 為了更直觀地反映出兩兩因素交互作用對連翹葉總?cè)铺崛÷市Ч挠绊懀谄渌蛩夭蛔兊那闆r下，選取2 個交互因素對連翹葉總?cè)铺崛÷蔬M(jìn)行響應(yīng)面分析，利用Design-Expert 8.0.6 軟件繪制響應(yīng)面3D 圖（圖5）。由圖5 可以看出，乙醇濃度（A）和料液比（B）的交互作用對響應(yīng)值Y的影響顯著（P＜0.05），在提取時間和提取溫度一定的情況下，Y隨著因素A和B的增加而增大。乙醇濃度（A）和提取時間（C）、乙醇濃度（A）和提取溫度（D）、料液比（B）和提取時間（C）、料液比（B）和提取溫度（D）、提取時間（C）和提取溫度（D）的交互作用均不顯著，具體表現(xiàn)為兩兩因素交互作用的響應(yīng)面坡度變化緩慢。

綜合回歸模型的分析可知，連翹葉總?cè)谱顑?yōu)提取工藝參數(shù)為乙醇濃度85%、料液比1∶37.96 g/mL，提取時間35.39 min、提取溫度57.74 ℃。為方便實際操作，設(shè)定最優(yōu)提取工藝參數(shù)為乙醇濃度85%、料液比1∶40 g/mL、提取時間35 min、提取溫度60 ℃。在此條件下平行操作5 次，實際測得總?cè)频钠骄崛÷蕿?4.13%，與模型理論預(yù)測值14.25%基本吻合。

2.3 連翹葉總?cè)萍兓Y(jié)果

經(jīng)樹脂富集純化后連翹葉中總?cè)频募兌冉Y(jié)果見表4，可見純化效果較好的多為非極性樹脂，如D-101、D3520 和D4020 型大孔樹脂等，其中D101 型大孔樹脂的純化效果最好，可獲得純度為72.89%的連翹葉總?cè)飘a(chǎn)品，純度約為純化前的5.16 倍，故最終確定連翹葉總?cè)萍兓米罴褬渲瑸镈-101，并測定其熊果酸、齊墩果酸和白樺脂酸的含量。HPLC法測定連翹葉總?cè)浦行芄帷R墩果酸和白樺脂酸的含量分別為70.11%、14.23%和4.79%，HPLC 圖譜如圖6 所示。

圖6 連翹葉總?cè)艸PLC 圖譜

表4 不同大孔樹脂對連翹葉總?cè)萍兓慕Y(jié)果

2.4 連翹葉總?cè)瓶鼓[瘤活性研究

由表5 可知，連翹葉總?cè)萍兓瘶悠穼θ巳橄侔┘?xì)胞、肝癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞均具有一定的增殖抑制作用，其中對乳腺癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用比較明顯，對乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和MDA-MB-231 的IC50分 別 為（6.29±0.34）mg/L 和（9.51±0.71）mg/L，對肝癌細(xì)胞HepG2 和SNU-739 的IC50分別為（12.05±1.23）mg/L 和（9.91±0.94）mg/L；而且與陽性對照藥米托蒽醌相比，該化合物對正常肝細(xì)胞HL-7702 的影響明顯弱于腫瘤細(xì)胞，IC50大于100 mg/L。

表5 連翹葉總?cè)萍兓瘶悠穼? 種腫瘤細(xì)胞的IC50 （單位：mg/L）

3 小結(jié)

采用超聲技術(shù)提取連翹葉總?cè)?，通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到最優(yōu)提取工藝為乙醇濃度85%，料液比1∶40 g/mL，提取時間35 min，提取溫度60 ℃，此條件下得到連翹葉總?cè)频奶崛÷蕿?4.13%，基本與理論值相符合，說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取工藝具有一定的參考價值。6種樹脂中D101型樹脂為最佳，經(jīng)純化后的連翹葉總?cè)频募兌冗_(dá)72.89%，HPLC法測定純化后的連翹葉總?cè)浦行芄?、齊墩果酸和白樺脂酸的含量分別為70.11%、14.23%和4.79%。

近年來，隨著人類對天然藥物越來越關(guān)注，從天然藥物中獲取抗腫瘤有效成分已成為腫瘤防治的研究熱點［16-20］。本研究體外抗腫瘤試驗結(jié)果表明，連翹葉總?cè)茖θ巳橄侔?、肝癌和結(jié)腸癌等6 種腫瘤細(xì)胞均具有良好的增殖抑制效果，應(yīng)用前景十分廣闊，具有很高的社會意義和商業(yè)價值。