高效液相色譜法測(cè)定大鼠口服玉米黃素雙棕櫚酸酯后胃腸道含量變化

雷艷麗， 謝娜娜， 魯曉麗， 米 佳， 祿 璐， 閆亞美， 曹有龍， 冉林武

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，銀川 750004； 3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞科學(xué)研究所，銀川 750002； 4.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，銀川 750004； 5.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部，銀川 750004）

枸杞作為一種藥食兩用的植物，廣泛分布于我國(guó)寧夏、青海和新疆等地。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，枸杞具有“滋肝明目，清肺補(bǔ)腎”的功效[1]，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)其具有調(diào)節(jié)免疫、保肝[2-3]、抗氧化損傷[4]、保護(hù)視力[5]等作用。類胡蘿卜素是枸杞中的主要功效成分，97%以上的類胡蘿卜素是以酯化形式存在的[6-7]。其中，僅玉米黃素雙棕櫚酸酯（zeaxanthin dipalmitate，ZDP）的含量即達(dá)80%[8]。ZDP 為玉米黃素（zeaxanthin，ZE）的脂肪酸形式，為游離態(tài)ZE 的兩側(cè)羥基分別與棕櫚酸結(jié)合而形成的天然類胡蘿卜素酯。

ZDP 是通過(guò)飲食獲得的脂質(zhì)性類胡蘿卜素，人體無(wú)法合成[9]。研究[10-11]表明，ZDP 可以改善視網(wǎng)膜病變，并且可以治療肝臟疾病。體外實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)存在胰脂肪酶和羧基酯脂肪酶時(shí)，ZDP 的水解速率由1.7%提高到29.5%，在小腸中以游離ZE 的形式被吸收[7，12]，而僅加入胰酶和體外消化模型中的胰脂肪酶似乎不足以模擬體內(nèi)消化?？诜幬镂章绊懸蛩囟?，但具有服用方便、安全、接受度高等優(yōu)點(diǎn)，為目前最為常見(jiàn)的一種給藥方式。研究影響生物利用度較低的口服藥物吸收的因素，對(duì)于提高藥物的吸收率，改善藥物的臨床效果有著重大意義。本研究旨在通過(guò)高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定ZDP 在胃腸道內(nèi)的含量變化，探討口服ZDP 在胃腸道消化吸收及發(fā)揮作用的機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)ZDP 口服產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HPLC 儀（Agilent 1260 型）購(gòu)自美國(guó)安捷倫科技公司；濾膜（0.22 μm）購(gòu)自上海青陽(yáng)生物科技有限公司；精密天平（Sartorius BP 211D 型）購(gòu)自德國(guó)賽多利斯公司；超純水處理系統(tǒng)（Milli-Q型）購(gòu)自美國(guó)Millipore；離心機(jī)（TGL-18C 型）購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；渦旋混合器購(gòu)自北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司。

1.2 試藥

ZDP 對(duì)照品（瑞士CaroteNature 原裝進(jìn)口，純度為96.9%），ZE（瑞士CaroteNature 原裝進(jìn)口，純度為95%）、10’－載脂蛋白－β-胡蘿卜素（瑞士CaroteNature 原裝進(jìn)口，純度為95%），ZDP 提取物（寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞學(xué)研究所，純度為93.3%），二氯甲烷（DCM）、乙腈（ACN）與甲醇（MT）為色譜純購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；實(shí)驗(yàn)中用到的水為純凈水。

1.3 動(dòng)物

雄性SD 大鼠，24 只，SPF 級(jí)，6～8 周齡，體質(zhì)量200～220 g［寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（寧）2015-0001］。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18～22 ℃，濕度為40%～70%，保持自然晝夜節(jié)律光照（12 h/12 h），自由攝食飲水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

SD 大鼠24 只（200～220 g），分為空白組和給藥組，適應(yīng)性飼養(yǎng)后，對(duì)照組灌胃0.2 mL/100 g生理鹽水，給藥組灌胃ZDP 提取物（低劑量組0.1 mL/100 g、中劑量組0.2 mL/100 g、高劑量組0.4 mL/100 g）。給藥組于90 d 使用代謝籠分籠飼養(yǎng)，收集糞便。糞便收集結(jié)束后及時(shí)更換籠盒，收集的糞便置于離心管中于-80 ℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)大鼠，禁食不禁水12 h，二氧化碳安樂(lè)死后立即打開(kāi)腹腔，冰上操作，剖開(kāi)胃、空腸、回腸等，收集其內(nèi)容物置于離心管中于-80 ℃冰箱保存。

2.2 ZDP 的HPLC 方法建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters YMC C30 column（250 mm×4.6 mm ID，5 μm）；流速1.0 mL·min-1；流動(dòng)相A 為MT∶ACN∶水（82∶14∶4）v；流動(dòng)相B 為DCM；檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm；進(jìn)樣體積10 μL，見(jiàn)表1。

表1 HPLC 法測(cè)定ZDP 的梯度程序

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精密稱取適量ZDP、ZE、10’－載脂蛋白－β-胡蘿卜素置于10 mL 棕色容量瓶中，加入適量DCM 超聲至完全溶解，DCM定容至刻度，配制成0.1 mg·mL-1的溶液，進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密移取適量對(duì)照品溶液，用DCM 稀釋配成含10’－載脂蛋白－β-胡蘿卜素（0.125、0.25、0.5、1、2、4 μg·mL-1）；ZE（10、5、2.5、1.25、0.625、0.125 μg·mL-1）；ZDP（10、5、2.5、1.25、0.625、0.125 μg·mL-1）的不同溶液，按2.2.1的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖峰面積。以藥物濃度（X）為自變量，峰面積為因變量進(jìn)行工作曲線的最小二乘法擬合。

2.2.4 專屬性 選擇雜質(zhì)多、干擾大的糞便作為待測(cè)成分的色譜專屬性進(jìn)行分析，記錄圖譜。

2.3 樣品提取

2.3.1 內(nèi)容物的提取 精密稱重各大鼠胃內(nèi)容物、空腸內(nèi)容物、回腸內(nèi)容物，記錄其質(zhì)量，加入200 μL 無(wú)水乙醇、200 μL 0.1%維生素C 充分混合均勻。加入600 μL DCM 提?。u旋混合5 min，4 ℃離心，3 000 r·min-1，10 min）。吸取下層液體，使用0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC 分析（注：樣品提取過(guò)程避光操作）。

2.3.2 糞便中藥物提取 全過(guò)程避光條件下操作。精密稱重各組大鼠糞便質(zhì)量，研缽研磨充分后，稱取0.5 g 粉末置于15 mL 離心管中，加入1 mL無(wú)水乙醇、1 mL 0.1%維生素C 充分混合均勻。加入2.5 mL DCM 提?。u旋混合5 min，4 ℃離心，3 000 r·min-1，10 min）。吸取下層液體，使用0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC 分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

10’－載脂蛋白－β-胡蘿卜素的回歸方程：y=115.67x+2.396 8，r2=0.999 7；ZE 的回歸方程：y=156.75x+23.568，r2=0.998 7；ZDP 的回歸方程：y=74.971x+12.458，r2=0.999 2。結(jié)果表明，3 種物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)線性良好。

3.2 專屬性

由圖1 可知，所建立的HPLC 方法能同時(shí)檢測(cè)10’－載脂蛋白－β-胡蘿卜素、ZE、ZDP 3 種物質(zhì)，且不產(chǎn)生干擾，專屬性良好。

圖1 大鼠糞便樣品HPLC 分析圖譜

3.3 ZDP 在大鼠胃腸道中的含量測(cè)定

3.3.1 大鼠胃內(nèi)容物中的藥物含量 由圖2 可知，長(zhǎng)期口服ZDP 后，大鼠胃內(nèi)容物中含有ZDP（100～300 μg·g-1），且根據(jù)給藥劑量呈劑量依賴性；胃中所測(cè)到的ZE 較少，表明ZDP 在胃內(nèi)容物中消化成ZE 的量較少或者可能性低。

圖2 大鼠口服ZDP 90 d 后胃內(nèi)容物中的藥物含量測(cè)定

3.3.2 大鼠空腸內(nèi)容物中的藥物含量 由圖3可知，長(zhǎng)期口服ZDP 后，大鼠空腸內(nèi)容物中含有ZDP、ZE，且ZDP 在空腸內(nèi)容中的含量決定了ZE的含量。空腸中ZDP、ZE 的含量是胃內(nèi)容物中的2 倍左右，是由于給藥后24 h 進(jìn)行采樣，多數(shù)藥物已到達(dá)腸道位置。

圖3 口服ZDP 90 d 后大鼠空腸內(nèi)容物中的藥物含量測(cè)定

3.3.3 大鼠回腸內(nèi)容物中的藥物含量 由圖4可知，長(zhǎng)期口服ZDP 后，大鼠回腸內(nèi)容物中含有ZDP、ZE，低劑量組、中劑量組中ZE 的含量約為ZDP 的10%，高劑量組中ZE 的含量約為ZDP 的25%，且ZE 的含量是低、中劑量組的100 倍，ZDP 在大鼠回腸中的含量決定了ZE 的含量。

圖4 口服ZDP 90 d 后大鼠回腸內(nèi)容物中含量測(cè)定

3.3.4 大鼠糞便中的藥物含量 由圖5 可知，口服ZDP 后，糞便中含有大量的ZDP 和少量ZE，排出的ZDP 的含量是ZE 的10 倍左右，表明未被吸收的ZDP 大量地以原形被排出體外。

圖5 大鼠口服ZDP 90 d 后糞便中含量測(cè)定

4 討論

藥物口服后通過(guò)胃腸道吸收是一個(gè)極為復(fù)雜的生理過(guò)程。吸收速率、吸收程度與藥物的分子大小、親水/親脂性等因素緊密相關(guān)，適宜的親水/親脂性有助于藥物跨過(guò)黏膜進(jìn)而被吸收[13]。本研究在大鼠灌胃ZDP 后，給予不同劑量的ZDP后，測(cè)定胃腸道內(nèi)容物，含量與給藥劑量呈正比，提示ZDP 在胃內(nèi)不易受環(huán)境及蛋白酶的影響，很少被分解為ZE。測(cè)定空腸、回腸內(nèi)容物，結(jié)果表明，ZDP 在腸道內(nèi)分解，產(chǎn)生了ZE，但具體影響其代謝行為的因素還不明確，可能是腸道內(nèi)的環(huán)境及細(xì)菌共同作用的結(jié)果。糞便中，ZDP 原形排出的含量是ZE 的10 倍左右，表明ZDP 吸收后以一定ZE 的形式存在，不被吸收的ZDP 及未轉(zhuǎn)換成ZE 的剩余ZDP 將以大量的ZDP 原形通過(guò)糞便排出。ZDP 作為親脂性的類胡蘿卜素，體外實(shí)驗(yàn)表明，脂肪酶和羧基酯脂肪酶在小腸中將ZDP 水解成游離的ZE，即在小腸中被吸收[2，7]。并且腸上皮細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到ZDP 的存在，僅有一定游離的ZE 和ZE 單酯[14]，同時(shí)證明了腸道中的ZDP 確實(shí)會(huì)轉(zhuǎn)化成ZE。

本研究發(fā)現(xiàn)，ZDP 口服后在腸道中轉(zhuǎn)換成ZE 的過(guò)程與劑量相關(guān)，高劑量組在回腸中的ZE含量最高。另一項(xiàng)研究顯示，人體受試者攝入ZDP 和ZE 后，在收集的血液樣本中未檢測(cè)到ZDP；然而，與非酯化ZE 的攝入相比，ZDP 組血液中的ZE 含量更高，該研究假設(shè)ZDP 的非極性性質(zhì)，在脂肪酶活性激活之前形成有效的膠束而發(fā)揮作用[15]。相應(yīng)地，健康的老年受試者以牛奶為基礎(chǔ)的枸杞子配方補(bǔ)充90 d 后使血漿中的ZE 增加了26%，抗氧化活性增加了57%[16]。因此，脂肪酶的存在促進(jìn)了人體對(duì)ZE 的吸收。研究[17-18]顯示，ZDP 的攝取增加了ZE 在血液、黃斑、脾臟、肝臟和脂肪組織中的含量。ZDP 雖然未能在血液中被檢測(cè)到，但是其攝入后提升了ZE 在組織器官中的含量，有助于枸杞發(fā)揮其傳統(tǒng)功效，而有關(guān)ZDP 代謝和生物利用的具體途徑及相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)行深入研究。本研究考察了大鼠長(zhǎng)期口服ZDP 后胃腸道及糞便中的藥物含量，明確了ZDP 在胃腸道、糞便中的含量與存在形式，進(jìn)而探討了ZDP 吸收的可能機(jī)制，為深入研究枸杞并闡明枸杞中ZDP 的吸收機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。